Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
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National Natural Science Foundation of China (n. 81972116, n. 81972085, n. 81772394); Programma chiave della Fondazione di Scienze Naturali della Provincia del Guangdong (No.2018B0303110003); Progetto di cooperazione internazionale del Guangdong (n. 2021A0505030011); Progetti scientifici e tecnologici di Shenzhen (n. GJHZ20200731095606019, n. JCYJ20170817172023838, n. JCYJ20170306092215436, n. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (No.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (No.2021A1515010985); Progetto Sanming di Medicina a Shenzhen (SZSM201612079); Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nella provincia del Guangdong.

Questo studio è stato approvato dal Comitato di etica umana del secondo ospedale popolare di Shenzhen. Un diagramma schematico di esosomi isolati dal protocollo hSF-MSCs in vitro è mostrato in Figura 1.
1. Cultura e identificazione delle SF-MSC umane
<ol><li>Raccogliere 20 ml di SF usando una siringa e un ago da pazienti clinici con OA.<ol><li>Disinfettare l'articolazione del ginocchio del paziente OA. Puntura dal tendine del quadrici...

<ol>
	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlike+bone,+cartilage+regeneration+remains+elusive.">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration.">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li><li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI.">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li><li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chondrocyte+implantation:+past,+present,+and+future.">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li><li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis.">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li><li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee:+a+proof-of-concept+clinical+trial.">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li><li>Pers, Y. M., Ruiz, M., No&#235;l, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis:+state+of+the+art+and+perspectives.">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li><li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells.">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 329 (2018).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model.">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy.">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li><li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy.">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+(3D)+spheroids.">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury.">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury.">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 206 (2020).</li></ol>

Le cellule staminali mesenchimali sono state ampiamente utilizzate nella medicina rigenerativa grazie al loro auto-rinnovamento, differenziate in cellule tissutali con funzioni specializzate ed effetti paracrini16,17. In particolare, gli effetti paracrini esercitati dagli esosomi hanno attirato molta attenzione18. Gli esosomi trasportano le bioinformazioni delle MSC e svolgono la loro funzione biologica e superano le carenze delle MSC, com...

L'osteoartrite (OA), derivante dalla cartilagine articolare e dalla rottura ossea sottostante, rimane una grave sfida che porta alla disabilità 1,2. Senza l'apporto di sangue e nervi, la capacità di auto-guarigione della cartilagine è minima una volta feriti 3,4. Negli ultimi decenni, le terapie basate sull'impianto autologo di condrociti (ACI) hanno fatto alcuni progressi nel trattamento dell'OA5. Per l'isolamento e l'espansione dei condrociti, è necessario raccogliere una piccola cartilagine dall'area non portante dell'articolazione OA, causando lesioni alla cartilagine. Inoltre, la procedura richiederà una seconda operazione per impiantare i condrociti espansi6. Pertanto, le terapie in un'unica fase per il trattamento dell'OA senza lesioni della cartilagine sono in fase di ampia esplorazione.
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state suggerite come alternative promettenti per il trattamento dell'OA 7,8. Originate da più tessuti, le MSC possono differenziarsi in condrociti con una stimolazione specifica. È importante sottolineare che le MSC possono modulare le risposte immunitarie tramite l'anti-infiammazione9. Pertanto, le MSC hanno vantaggi significativi nel trattamento dell'OA riparando i difetti della cartilagine e modulando la risposta immunitaria, specialmente nell'ambiente infiammatorio. Per il trattamento dell'OA, le MSC da liquido sinoviale (SF-MSCs) hanno recentemente attirato molta attenzione a causa della loro più forte capacità di differenziazione dei condrociti rispetto ad altre fonti di MSC10,11. In particolare, presso la clinica ortopedica, l'estrazione di SF infiammatoria dalla cavità articolare è una terapia di routine per alleviare il sintomo del dolore dei pazienti con OA. La SF infiammatoria estratta di solito viene smaltita come rifiuto medico. Sia i pazienti che i medici sono pronti a considerare le MSC autologhe isolate dalla SF infiammatoria come trattamento OA con pochissimi conflitti etici. Tuttavia, la terapia con SF-MSC è compromessa a causa dei rischi tumorigenici, della conservazione a lungo termine e delle barriere di spedizione distanti.
Gli esosomi, secreti da molti tipi di cellule, comprese le MSC, trasportano la maggior parte delle bio-informazioni della cellula madre. È stato studiato in modo approfondito come terapia cell-free12,13. Secondo le risorse aggiornate disponibili sul sito web del governo della sperimentazione clinica (ClinicalTrials.gov), vengono avviati e intrapresi studi clinici sugli esosomi più ampi nei campi di ricerca del cancro, dell'ipertensione e delle malattie neurodegenerative. Il trattamento degli esosomi SF-MSC potrebbe essere uno studio entusiasmante e impegnativo per far fronte all'OA. La produzione di esosomi di grado GMP e su larga scala è essenziale per la traduzione clinica. L'isolamento degli esosomi su piccola scala è stato ampiamente eseguito sulla base di colture cellulari bidimensionali (2D). Tuttavia, le strategie di produzione di esosomi su larga scala devono essere ottimizzate. In questo studio è stato sviluppato un metodo di produzione di esosomi su larga scala, basato su una massiccia coltura SF-MSC in condizioni prive di xeno. Dopo l'ultracentrifugazione da supernatanti di coltura cellulare, sono state convalidate la sicurezza e la funzione degli esosomi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

Gli esosomi secreti dalle cellule staminali mesenchimali (MSC) sono stati suggeriti come candidati promettenti per le lesioni della cartilagine e il trattamento dell'osteoartrite. Gli esosomi per applicazioni cliniche richiedono una produzione su larga scala. A tal fine, le MSC del liquido sinoviale umano (hSF-MSCs) sono state coltivate su perle di microcarrier e quindi coltivate in un sistema di coltura dinamico tridimensionale (3D). Attraverso l'utilizzo di colture dinamiche 3D, questo protocollo ha ottenuto con successo esosomi su larga scala da supernatanti di coltura SF-MSC. Gli esosomi sono stati raccolti mediante ultracentrifugazione e verificati da un microscopio elettronico a trasmissione, saggio di trasmissione di nanoparticelle e western blotting. Inoltre, è stata rilevata la sicurezza microbiologica degli esosomi. I risultati del rilevamento degli esosomi suggeriscono che questo approccio può produrre un gran numero di esosomi di grado GMP (Good Manufacturing Practices). Questi esosomi potrebbero essere utilizzati nella ricerca sulla biologia degli esosomi e nel trattamento clinico dell'osteoartrite.

La citometria a flusso è stata utilizzata per identificare i marcatori di superficie delle SF-MSCs, secondo i criteri minimi per definire le MSC umane raccomandati dalla Società Internazionale per la Terapia Cellulare14,15. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che le SF-MSC coltivate in questo studio hanno soddisfatto i criteri di identificazione delle MSC. Sono risultati negativi per CD34, CD45 e HLA-DR (inferiori al 3%) e positivi per CD73, CD90 e ...

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Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Qui, presentiamo un protocollo per produrre un gran numero di esosomi di grado GMP da cellule staminali mesenchimali del liquido sinoviale utilizzando un bioreattore 3D.

Preparazione su larga scala di esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali con liquido sinoviale mediante coltura di bioreattori 3D

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Presentiamo un protocollo per produrre un gran numero di esosomi di grado GMP da cellule staminali mesenchimali del liquido sinoviale utilizzando il nostro bioreattore 3D. Questi esosomi potrebbero essere utilizzati nella ricerca sulla biologia degli esosomi e nel trattamento clinico dell'artrite. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Yujie Liang.Iniziare a raccogliere le cellule mesenchimali umane, o MSC, centrifugando il liquido sinoviale a 1.500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 10 millilitri di PBS. Centrifugare le cellule risospese a 1.500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il PBS prima di risospendere il pellet con 10 millilitri di terreno di coltura MSC umano a una densità cellulare di cinque volte 10 alla quarta cella per millilitro e quindi placcare la sospensione in un piatto da 100 millimetri.Incubare il piatto a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica. Dopo due settimane, raccogliere il surnatante di coltura cellulare per identificare le cellule staminali mesenchimali del liquido sinoviale, o SF-MSC, utilizzando la citometria a flusso. Per fare ciò, digerire il passaggio di terza generazione tre di SF-MSC mediante centrifugazione a 1.000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Quindi, scartare il surnatante prima di raccogliere il pellet cellulare. Quindi, aggiungere 400 microlitri del tampone bloccante al pellet cellulare alla concentrazione di cinque volte 10 al quarto e lasciare riposare il pellet per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo 15 minuti, centrifugare la sospensione cellulare come descritto in precedenza, quindi risospendere il pellet separato in 100 microlitri di 1X PBS.Aggiungere un microlitro di anticorpo monoclonale fluorescente con un rapporto di diluizione di 1:100 per provetta, come descritto nel manoscritto, e porre la provetta per l'incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con 1X PBS e risospendere le cellule in 100 microlitri di 1X PBS. Quindi, rilevare i fluorofori in un massimo di 10.000 cellule su un citometro a flusso utilizzando canali rossi e FITC.Per preparare i microcarrier, gonfiare e idratare 0,75 grammi di microcarrier in 1X DPBS alla concentrazione di 50 milligrammi per grammo per almeno tre ore a temperatura ambiente. Quindi, decantare il surnatante per lavare i microcarrier in DPBS fresco per cinque minuti. Dopo aver sostituito il mezzo con DPBS 1X fresco a 50 milligrammi di microcarrier per grammo, sterilizzare i microcarrier in autoclave a 121 gradi Celsius per 15 minuti a 15 libbre per pollice quadrato.Quindi, lasciare che i microvettori sterilizzati si depositino prima di decantare il surnatante. Risciacquare i microcarrier nel terreno di coltura alla concentrazione di 50 milligrammi di microcarrier per grammo a temperatura ambiente. Quando i microcarrier sono sistemati, scartare il surnatante.Per preparare il bioreattore di perfusione, sterilizzare il bioreattore in autoclave come descritto in precedenza. Al termine, contare il numero di SF-MSC da allocare 2,5 volte 10 al settimo SF-MSC e microcarrier al bioreattore perfuso con 250 millilitri del terreno di coltura MSC di grado GMP. Posizionare il bioreattore in un incubatore con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius ad una velocità di 15 rotazioni al minuto.Cambiare il terreno di coltura ogni sei giorni. Dopo 14 giorni, raccogliere i supernatanti e i microcarrier della coltura cellulare per ulteriori analisi. Centrifugare il surnatante di coltura cellulare a 300 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante mentre si scartano i detriti cellulari.A quattro gradi Celsius, centrifugare sequenzialmente il surnatante a 2.000 volte G per 10 minuti e poi a 10.000 volte G per 30 minuti per scartare le vescicole più grandi e raccogliere il pellet. Dopo aver risospeso il pellet in 40 millilitri di PBS, centrifugare la sospensione cellulare a 120.000 volte G per 70 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, risospendere il pellet raccolto contenente esosomi in 500 microlitri di PBS.Diluire i campioni di esosomi appena isolati con PBS sterile alla concentrazione da 10 alla settima a 10 alla nona particella per millilitro e iniettare 500 microlitri del campione per ogni corsa nell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle, o sistema NTA, a 30 microlitri al minuto e da 24,4 a 24,5 gradi Celsius. Impostare manualmente il sistema di acquisizione e analisi in base al protocollo del produttore. Visualizza le particelle mediante diffusione della luce laser e cattura il loro movimento browniano su video digitali.Successivamente, analizza le videocassette registrate utilizzando il software, tracciando almeno 200 singole particelle per esecuzione. Per il Western blotting, aggiungere 300 microlitri del tampone di lisi e del cocktail di inibitori della proteasi agli esosomi con miscelazione mediante pipettaggio su e giù. Quindi, lasciare riposare sul ghiaccio per 20 minuti.Dopo la centrifugazione della miscela a 9.391 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, misurare la concentrazione proteica nel surnatante utilizzando un kit di analisi delle proteine. Dopo il test, riscaldare il campione con 100 microlitri di tampone di carico proteico 4X a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, caricare 15 microlitri di proteine a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro per eseguire l'elettroforesi su gel a 120 volt per 70 minuti e l'elettroblotting a 100 volt per 60 minuti a quattro gradi Celsius.Rilevare i marcatori specifici non esosomi, come la calnexina e i biomarcatori esosomici come CD9, CD63 e CD81 mediante Western blotting fluorescente. Nello studio, la citometria a flusso è stata utilizzata per identificare i marcatori di superficie delle SF-MSC. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che le SF-MSC coltivate erano negative per CD34, CD45 e HLA-DR e positive per CD73, CD90 e CD105, soddisfacendo i criteri di identificazione delle MSC.Sotto microscopia invertita, è stato notato che le SF-MSC proliferano su microcarrier. L'SF-MSC ha proliferato nella cultura 3D più rapidamente da sei giorni in poi rispetto alla cultura 2D. Gli esosomi delle SF-MSC di coltura 2D e 3D sono stati identificati utilizzando Western blotting e gli esosomi sono risultati esprimere CD63, CD9 e CD81 pur essendo negativi per la calnessina.L'analisi dei nanociti ha dimostrato che il diametro degli esosomi 2D e 3D era di circa 120 nanometri. L'analisi microscopica elettronica a trasmissione ha rivelato la morfologia degli esosomi 2D e 3D, mostrando vescicole approssimativamente sferoidali. Utilizzando l'analisi NTA, è stata analizzata la concentrazione di particelle di dimensioni da 30 a 160 nanometri.Dopo la coltura 3D, la concentrazione di particelle era 4,0 volte 10 al sei per millilitro. Tuttavia, dopo la coltura 2D, la concentrazione di particelle delle stesse dimensioni era 2,5 volte 10 per sei per millilitro. Inoltre, la coltura 3D ha prodotto più proteine esosomiche rispetto alla coltura 2D.L'analisi rappresentativa mostra l'internalizzazione degli esosomi marcati con Dil da parte dei condrociti primari. Gli esosomi marcati con Dil entrati nei condrociti primari possono essere visti con un picco a tre ore. Lo studio di somministrazione in vitro ha dimostrato che gli esosomi potrebbero fornire microRNA-140 marcati con sulfo-cianina3 ai condrociti.Placcare le cellule, avviare la reazione nel bioreattore e il surnatante sono i passi più importanti di questo protocollo. La coltura 3D è comunemente usata per la coltura su larga scala di cellule aderenti. Altri metodi come lo spin flex possono anche essere utilizzati per la produzione su larga scala di esosomi.Il nostro metodo migliora la resa degli esosomi, consentendo così l'applicazione preclinica basata sugli esosomi MSC.

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