Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
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Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 81972116, No. 81972085, No. 81772394); Programa Chave da Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (No.2018B0303110003); Projecto de Cooperação Internacional de Guangdong (No.2021A0505030011); Projetos de Ciência e Tecnologia de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, Não. JCYJ20170817172023838, Não. JCYJ20170306092215436, Não. JCYJ20170413161649437); Fundação de Ciência de Pós-Doutorado da China (No.2020M682907); Fundação de Investigação Básica e Aplicada de Guangdong (No.2021A1515010985); Projeto Sanming de Medicina em Shenzhen (SZSM201612079); Fundos Especiais para a Construção de Hospitais de Alto Nível na Província de Guangdong.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana do Segundo Hospital Popular de Shenzhen. Um diagrama esquemático de exossomos isolados do protocolo in vitro de hSF-MSCs é mostrado na Figura 1.
1. Cultura e identificação de SF-MSCs humanas
<ol><li>Colher 20 mL de SF usando seringa e agulha de pacientes clínicos com OA.<ol><li>Desinfetar a articulação do joelho do paciente com OA. Punção do tendão do quadríceps femoral f...

<ol>
	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. 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M., Ruiz, M., No&#235;l, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis:+state+of+the+art+and+perspectives.">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li><li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells.">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 329 (2018).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model.">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy.">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li><li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy.">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. 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As células-tronco mesenquimais têm sido amplamente utilizadas na medicina regenerativa devido à sua auto-renovação, diferenciadas em células teciduais com funções especializadas e efeitos parácrinos16,17. Notavelmente, os efeitos parácrinos exercidos pelos exossomos têm atraído muita atenção18. Os exossomos carregam a bioinformação das MSCs e desempenham sua função biológica e superam as deficiências das MSC, como armaz...

A osteoartrite (OA), resultante da cartilagem articular e da degradação óssea subjacente, continua sendo um desafio grave que leva à incapacidade 1,2. Sem suprimento de sangue e nervos, a capacidade de auto-cicatrização da cartilagem é mínima uma vez lesada 3,4. Nas últimas décadas, terapias baseadas no implante autólogo de condrócitos (ACI) têm feito alguns progressos no tratamento da OA5. Para o isolamento e expansão dos condrócitos, é necessária a colheita de pequenas cartilagens da área de suporte de peso da articulação OA, causando lesões na cartilagem. Além disso, o procedimento exigirá uma segunda operação para implantar os condrócitos expandidos6. Assim, terapias de uma etapa para o tratamento da OA sem lesões cartilaginosas estão sob extensa exploração.
As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido sugeridas como alternativas promissoras para o tratamento da OA 7,8. Originárias de múltiplos tecidos, as CTMs podem se diferenciar em condrócitos com estimulação específica. É importante ressaltar que as CTMs podem modular as respostas imunes por meio da anti-inflamação9. Portanto, as MSCs possuem vantagens significativas no tratamento da OA, reparando defeitos da cartilagem e modulando a resposta imune, especialmente no meio inflamatório. Para o tratamento da OA, as CTMs do líquido sinovial (SF-MSCs) têm atraído recentemente muita atenção devido à sua maior capacidade de diferenciação de condrócitos do que outras fontes deCTMs 10,11. Notavelmente, na clínica ortopédica, a extração de SF inflamatória da cavidade articular é uma terapia de rotina para aliviar o sintoma de dor de pacientes com OA. A SF inflamatória extraída geralmente é descartada como resíduo médico. Tanto os pacientes quanto os médicos estão prontos para considerar as CTMs autólogas isoladas da SF inflamatória como tratamento da OA com muito poucos conflitos éticos. No entanto, a terapia SF-MSC está comprometida devido a riscos tumorigênicos, armazenamento de longo prazo e barreiras de remessa distantes.
Os exossomos, secretados por muitos tipos de células, incluindo MSCs, carregam a maior parte da bioinformação da célula-mãe. Tem sido investigada em profundidade como terapia livre de células12,13. De acordo com os recursos atualizados disponíveis no site do governo de ensaios clínicos (ClinicalTrials.gov), estudos clínicos exossômicos mais extensos são iniciados e realizados nos campos de pesquisa de câncer, hipertensão e doenças neurodegenerativas. O tratamento com exossomos SF-MSC pode ser um estudo empolgante e desafiador para lidar com a OA. A produção de exossomos de boas práticas de fabrico (BPF) e de exossomas em larga escala é essencial para a tradução clínica. O isolamento exossomático em pequena escala tem sido amplamente realizado com base em cultura de células bidimensionais (2D). No entanto, as estratégias de produção de exossomos em larga escala precisam de otimização. Um método de fabricação de exossomos em larga escala foi desenvolvido neste estudo, baseado na cultura maciça de SF-MSC em condições livres de xeno. Após a ultracentrifugação de sobrenadantes de cultura celular, a segurança e a função do exossomo foram validadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

Exossomos secretados por células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido sugeridos como candidatos promissores para lesões cartilaginosas e tratamento da osteoartrite. Exossomos para aplicação clínica requerem produção em larga escala. Para esse fim, as MSCs do líquido sinovial humano (hSF-MSCs) foram cultivadas em esferas de microcarreador e, em seguida, cultivadas em um sistema de cultura tridimensional dinâmico (3D). Através da utilização da cultura dinâmica 3D, este protocolo obteve com sucesso exossomos em larga escala de sobrenadantes da cultura SF-MSC. Os exossomos foram colhidos por ultracentrifugação e verificados por microscópio eletrônico de transmissão, ensaio de transmissão de nanopartículas e western blotting. Além disso, a segurança microbiológica dos exossomos foi detectada. Os resultados da detecção de exossomos sugerem que essa abordagem pode produzir um grande número de exossomos de boas práticas de fabricação (BPF). Esses exossomos podem ser utilizados em pesquisas de biologia de exossomos e tratamento clínico da osteoartrite.

A citometria de fluxo foi utilizada para identificar os marcadores de superfície das SF-MSCs, de acordo com os critérios mínimos para definição de CTMs humanas recomendados pela International Society for Cellular Therapy14,15. A análise da citometria de fluxo revelou que as SF-MSCs cultivadas neste estudo preencheram os critérios de identificação das CTMs. Foram negativos para CD34, CD45 e HLA-DR (abaixo de 3%) e positivos para CD73, CD90 e CD105 (acima ...

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Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um grande número de exossomos de grau GMP a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando um biorreator 3D.

Preparação em larga escala de exossomos derivados de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial por cultura de biorreator 3D

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Apresentamos um protocolo para produzir um grande número de exossomos de grau GMP a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando nosso biorreator 3D. Esses exossomos podem ser utilizados em pesquisas de biologia de exossomos e tratamento clínico da artrite. Demonstrando o procedimento será o Dr. Yujie Liang.Comece a coletar as células mesenquimais humanas, ou MSCs, centrifugando o líquido sinovial a 1, 500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com 10 mililitros de PBS. Centrifugar as células ressuspensas a 1, 500 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius e descartar o PBS antes de ressuspender o pellet com 10 mililitros de meio de cultura MSC humano a uma densidade celular de cinco vezes 10 para a quarta célula por mililitro e, em seguida, chapear a suspensão em um prato de 100 milímetros.Incubar o prato a 37 graus Celsius numa atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Após duas semanas, coletar o sobrenadante da cultura celular para identificar células-tronco mesenquimais do líquido sinovial, ou SF-MSCs, usando citometria de fluxo. Para fazer isso, digerir a passagem de terceira geração três de SF-MSCs por centrifugação a 1.000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, descarte o sobrenadante antes de coletar o pellet celular. Em seguida, adicione 400 microlitros do tampão de bloqueio ao pellet da célula na concentração de cinco vezes 10 ao quarto e deixe o pellet repousar por 15 minutos à temperatura ambiente. Após 15 minutos, centrifugar a suspensão celular conforme descrito anteriormente e, em seguida, ressuspender o pellet separado em 100 microlitros de PBS 1X.Adicione um microlitro do anticorpo fluorescente monoclonal a uma razão de diluição de 1:100 por tubo, conforme descrito no manuscrito, e coloque o tubo para incubação à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, lave as células duas vezes com 1X PBS e ressuspenda as células em 100 microlitros de 1X PBS. Em seguida, detecte os fluoróforos em até 10.000 células em um citômetro de fluxo usando canais vermelhos e FITC.Para preparar os microcarreadores, inchar e hidratar seco 0,75 gramas dos microtransportadores em 1X DPBS na concentração de 50 miligramas por grama por pelo menos três horas à temperatura ambiente. Em seguida, decante o sobrenadante para lavar os microtransportadores em DPBS fresco por cinco minutos. Depois de substituir o meio por 1X DPBS fresco a 50 miligramas dos microtransportadores por grama, esterilize os microtransportadores por autoclave a 121 graus Celsius por 15 minutos a 15 libras por polegada quadrada.Em seguida, permita que os microportadores esterilizados se depositem antes de decantar o sobrenadante. Enxaguar os microcarreadores no meio de cultura na concentração de 50 miligramas dos microcarreadores por grama à temperatura ambiente. Quando os microportadores estiverem assentados, descarte o sobrenadante.Para preparar o biorreator de perfusão, esterilize o biorreator por autoclave, conforme descrito anteriormente. Quando terminar, conte o número de SF-MSCs para alocar 2,5 vezes 10 para o sétimo SF-MSCs e microportadores para o biorreator perfundido com 250 mililitros do meio de cultura MSC de grau GMP. Coloque o biorreator em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a uma velocidade de 15 rotações por minuto.Mude o meio de cultura a cada seis dias. Após 14 dias, coletar os sobrenadantes e microportadores da cultura celular para análise posterior. Centrifugar o sobrenadante da cultura celular a 300 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius e coletar o sobrenadante enquanto descarta os detritos celulares.A quatro graus Celsius, centrífuga sequencial do sobrenadante a 2.000 vezes G por 10 minutos e depois a 10.000 vezes G por 30 minutos para descartar as vesículas maiores e coletar o pellet. Depois de ressuspender o pellet em 40 mililitros de PBS, centrifugar a suspensão da célula a 120.000 vezes G por 70 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, ressuscite o pellet coletado contendo exossomos em 500 microlitros de PBS.Diluir as amostras de exossomos recém-isoladas com PBS estéril até a concentração de 10 a sétima a 10 a nona partículas por mililitro e injetar 500 microlitros da amostra para cada corrida na análise de rastreamento de nanopartículas, ou sistema NTA, a 30 microlitros por minuto e 24,4 a 24,5 graus Celsius. Defina manualmente o sistema de captura e análise de acordo com o protocolo do fabricante. Visualize as partículas por dispersão de luz laser e capture seu movimento browniano em vídeo digital.Em seguida, analise as fitas de vídeo gravadas utilizando software, rastreando pelo menos 200 partículas individuais por corrida. Para Western blotting, adicione 300 microlitros do tampão de lise e coquetel de inibidores de protease aos exossomos com mistura por pipetagem para cima e para baixo. Em seguida, deixe o ficar no gelo por 20 minutos.Após a centrifugação da mistura a 9, 391 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius, meça a concentração de proteína no sobrenadante usando um kit de ensaio de proteína. Após o ensaio, aqueça a amostra com 100 microlitros de tampão de carregamento de proteína 4X a 100 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, carregue 15 microlitros de proteínas a uma concentração de 10 miligramas por mililitro para funcionar por eletroforese em gel a 120 volts por 70 minutos e eletro-blotting a 100 volts por 60 minutos a quatro graus Celsius.Detecte os marcadores específicos não exossomos, como a calexina, e os biomarcadores exossômicos, como CD9, CD63 e CD81, por Western blotting fluorescente. No estudo, a citometria de fluxo foi utilizada para identificar os marcadores de superfície das SF-MSCs. A análise da citometria de fluxo revelou que as SF-MSCs cultivadas foram negativas para CD34, CD45 e HLA-DR e positivas para CD73, CD90 e CD105, atendendo aos critérios de identificação das CTMs.Sob microscopia invertida, observou-se que as SF-MSCs proliferam em microportadores. O SF-MCC proliferou na cultura 3D mais rapidamente a partir de seis dias em comparação com a cultura 2D. Os exossomos de SF-MSCs de cultura 2D e 3D foram identificados usando Western blotting e os exossomos expressaram CD63, CD9 e CD81 enquanto eram negativos para a calexina.A análise de nanócitos demonstrou que o diâmetro dos exossomos 2D e 3D era de aproximadamente 120 nanômetros. A análise microscópica eletrônica de transmissão revelou a morfologia dos exossomos 2D e 3D, mostrando vesículas aproximadamente esferoidais. Usando a análise NTA, a concentração de partículas de 30 a 160 nanômetros foi analisada.Após a cultura 3D, a concentração de partículas foi de 4,0 vezes 10 a seis por mililitro. No entanto, após a cultura 2D, a concentração de partículas do mesmo tamanho foi de 2,5 vezes 10 a seis por mililitro. Além disso, a cultura 3D produziu mais proteína exossomótica do que a cultura 2D.A análise representativa mostra a internalização de exossomos marcados com Dil por condrócitos primários. Exossomos marcados com dil que entraram nos condrócitos primários podem ser vistos com um pico em três horas. O estudo de entrega in vitro demonstrou que os exossomos poderiam fornecer microRNA-140 marcado com sulfo-cianinina3 aos condrócitos.Planear as células, iniciar a reação no biorreator e o do sobrenadante são os passos mais importantes deste protocolo. A cultura 3D é comumente usada para cultura em larga escala de células aderentes. Outros métodos, como o spin flex, também podem ser usados para a produção em larga escala de exossomos.Nosso método melhora o rendimento dos exossomos, permitindo assim a aplicação pré-clínica baseada em exossomos de MSC.

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