Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

Национальный фонд естественных наук Китая (No 81972116, No 81972085, No 81772394); Ключевая программа Фонда естественных наук провинции Гуандун (No2018B0303110003); Гуандунский проект международного сотрудничества (No 2021A0505030011); Шэньчжэньские научно-технические проекты (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Китайский постдокторский научный фонд (No 2020M682907); Гуандунский фонд фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (No 2021A1515010985); Санминский медицинский проект в Шэньчжэне (SZSM201612079); Специальные фонды для строительства больниц высокого уровня в провинции Гуандун.

Это исследование было одобрено Комитетом по этике человека Второй народной больницы Шэньчжэня. Принципиальная схема экзосом, выделенных из протокола hSF-MSC in vitro , показана на рисунке 1.
1. Культура и идентификация человека SF-MSC
<ol><li>Соберите 20 ?...

<ol>
	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlike+bone,+cartilage+regeneration+remains+elusive.">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration.">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li><li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI.">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li><li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chondrocyte+implantation:+past,+present,+and+future.">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li><li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis.">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li><li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee:+a+proof-of-concept+clinical+trial.">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li><li>Pers, Y. M., Ruiz, M., No&#235;l, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis:+state+of+the+art+and+perspectives.">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li><li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells.">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 329 (2018).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model.">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy.">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li><li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy.">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+(3D)+spheroids.">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury.">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury.">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 206 (2020).</li></ol>

Мезенхимальные стволовые клетки широко используются в регенеративной медицине благодаря их самообновлению, дифференцированному в тканевые клетки со специализированными функциями и паракринным эффектам16,17. Примечательно, что паракринные эффекты, ока?...

Остеоартрит (ОА), возникающий в результате разрушения суставного хряща и лежащей в его основе кости, остается серьезной проблемой, приводящей к инвалидности 1,2. Без крово- и нервного снабжения способность хряща к самовосстановлению минимальна после травмирования 3,4. В последние десятилетия методы лечения, основанные на аутологичной имплантации хондроцитов (ACI), достигли некоторого прогресса в лечении ОА5. Для выделения и расширения хондроцитов необходим сбор небольшого хряща из ненесущей области сустава ОА, что приводит к травмам хряща. Также процедура потребует повторной операции по имплантации расширенных хондроцитов6. Таким образом, одноэтапная терапия для лечения ОА без повреждений хряща находится в стадии обширного изучения.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были предложены в качестве перспективных альтернатив для лечения ОА 7,8. Происходящие из нескольких тканей, МСК могут дифференцироваться в хондроциты со специфической стимуляцией. Важно отметить, что МСК могут модулировать иммунные реакции с помощью противовоспалительногосредства 9. Таким образом, МСК обладают значительными преимуществами в лечении ОА, восстанавливая дефекты хряща и модулируя иммунный ответ, особенно в среде воспаления. Для лечения ОА МСК из синовиальной жидкости (SF-МСК) в последнее время привлекли большое внимание из-за их более сильной способности дифференцировки хондроцитов, чем другие источники МСК10,11. Примечательно, что в ортопедической клинике удаление воспалительной СФ из полости сустава является рутинной терапией для облегчения болевого симптома пациентов с ОА. Экстрагированная воспалительная НФ обычно утилизируется как медицинские отходы. Как пациенты, так и врачи готовы рассматривать аутологичные МСК, выделенные из воспалительной СФ, как лечение ОА с очень небольшим количеством этических конфликтов. Тем не менее, терапия SF-MSC скомпрометирована из-за опухолевых рисков, длительного хранения и отдаленных барьеров транспортировки.
Экзосомы, секретируемые многими типами клеток, включая МСК, несут большую часть биоинформации родительских клеток. Он был подробно исследован как бесклеточная терапия12,13. Согласно обновленным ресурсам, доступным на веб-сайте правительства по клиническим испытаниям (ClinicalTrials.gov), начинаются и проводятся более обширные клинические исследования экзосом в областях исследований рака, гипертонии и нейродегенеративных заболеваний. Лечение экзосом SF-MSC может быть захватывающим и сложным испытанием, чтобы справиться с ОА. Надлежащая производственная практика (GMP) и крупномасштабное производство экзосом имеют важное значение для клинического перевода. Мелкомасштабная изоляция экзосом была широко выполнена на основе двумерной (2D) клеточной культуры. Однако крупномасштабные стратегии производства экзосом нуждаются в оптимизации. В этом исследовании был разработан крупномасштабный метод производства экзосом, основанный на массивной культуре SF-MSC в условиях, свободных от ксено. После ультрацентрифугирования из супернатантов клеточной культуры была подтверждена безопасность и функция экзосом.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

Экзосомы, секретируемые мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), были предложены в качестве перспективных кандидатов для травм хряща и лечения остеоартрита. Экзосомы для клинического применения требуют крупномасштабного производства. С этой целью МСК синовиальной жидкости человека (hSF-МСК) выращивали на бусинах микроносителей, а затем культивировали в динамической трехмерной (3D) системе культивирования. Используя 3D-динамическую культуру, этот протокол успешно получил крупномасштабные экзосомы из супернатантов культуры SF-MSC. Экзосомы были собраны методом ультрацентрифугирования и проверены просвечивающим электронным микроскопом, анализом передачи наночастиц и западным блоттингом. Также выявлена микробиологическая безопасность экзосом. Результаты обнаружения экзосом свидетельствуют о том, что этот подход может привести к образованию большого количества экзосом надлежащей производственной практики (GMP). Эти экзосомы могут быть использованы в исследованиях биологии экзосом и клинического лечения остеоартрита.

Проточная цитометрия использовалась для идентификации поверхностных маркеров SF-МСК в соответствии с минимальными критериями для определения МСК человека, рекомендованными Международным обществом клеточной терапии14,15. Анализ проточной цитометрии пок...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Здесь мы представляем протокол для получения большого количества экзосом GMP-класса из мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости с использованием 3D-биореактора.

Крупномасштабное получение мезенхимальных экзосом, полученных из мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости, с помощью 3D-культуры биореактора

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Мы представляем протокол для получения большого количества экзосом GMP-класса из мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости с использованием нашего 3D-биореактора. Эти экзосомы могут быть использованы в исследованиях биологии экзосом и клинического лечения артрита. Демонстрировать процедуру будет доктор Юйцзе Лян.Начните собирать мезенхимальные клетки человека, или МСК, центрифугируя синовиальную жидкость в 1 500 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования отбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки 10 миллилитрами PBS. Центрифугируйте повторно суспендированные клетки в 1 500 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и отбросьте PBS перед повторным использованием гранулы с 10 миллилитрами питательной среды MSC человека при плотности клеток от пяти раз 10 до четвертой клетки на миллилитр, а затем поместите суспензию в 100-миллиметровую чашку.Инкубируйте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Через две недели соберите супернатант клеточной культуры для идентификации мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости или SF-МСК с помощью проточной цитометрии. Для этого переварите третье поколение прохождения трех SF-МСК центрифугированием в 1000 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.Затем выбросьте супернатант перед сбором гранулы клетки. Далее добавляют 400 микролитров блокирующего буфера в ячейку гранулы в концентрации от пяти раз 10 до четвертой и дают грануле постоять 15 минут при комнатной температуре. Через 15 минут центрифугируют клеточную суспензию, как описано ранее, затем повторно суспендируют отделенную гранулу в 100 микролитрах 1X PBS.Добавьте один микролитр моноклонального флуоресцентного антитела при соотношении разведения 1:100 на пробирку, как описано в рукописи, и поместите пробирку для инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации дважды промывайте клетки 1X PBS и повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах 1X PBS. Затем обнаружите флуорофоры в 10 000 клетках на проточном цитометре с использованием красного и FITC каналов.Для приготовления микроносителей набухают и увлажняют сухими 0,75 г микроносителей в 1X DPBS в концентрации 50 миллиграмм на грамм в течение не менее трех часов при комнатной температуре. Затем декантируйте супернатант для мытья микроносителей в свежем DPBS в течение пяти минут. После замены среды свежим 1X DPBS при 50 миллиграммах микроносителей на грамм, стерилизуйте микроносители автоклавированием при 121 градусе Цельсия в течение 15 минут при 15 фунтах на квадратный дюйм.Затем дайте стерилизованным микроносителям осесть перед декантацией супернатанта. Микроносители промыть в питательной среде в концентрации 50 миллиграмм микроносителей на грамм при комнатной температуре. Когда микронесущие осядут, выбросьте супернатант.Чтобы приготовить перфузионный биореактор, стерилизуйте биореактор путем автоклавирования, как описано ранее. Когда это будет сделано, подсчитайте количество SF-МСК, чтобы выделить 2,5 раза 10 седьмым SF-МСК и микроносителям биореактора, перфузированного 250 миллилитрами питательной среды MSC класса GMP. Поместите биореактор в инкубатор с 5% углекислым газом при 37 градусах Цельсия со скоростью 15 оборотов в минуту.Меняйте культуральную среду каждые шесть дней. Через 14 дней собирают супернатанты и микроносители клеточной культуры для дальнейшего анализа. Центрифугируйте супернатант клеточной культуры в 300 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и соберите супернатант, выбрасывая клеточный мусор.При четырех градусах Цельсия последовательно центрифугируйте супернатант в 2000 раз G в течение 10 минут, а затем в 10 000 раз G в течение 30 минут, чтобы выбросить более крупные везикулы и собрать гранулу. После повторного использования гранулы в 40 миллилитрах PBS центрифугируют клеточную суспензию в 120 000 раз G в течение 70 минут при четырех градусах Цельсия. Затем повторно суспендируют собранную гранулу, содержащую экзосомы, в 500 микролитрах PBS.Разбавляют свежеизолированные образцы экзосом стерильным PBS до концентрации от 10 до седьмого-10-девятого частиц на миллилитр и вводят 500 микролитров образца для каждого пробега в анализ отслеживания наночастиц или систему NTA со скоростью 30 микролитров в минуту и от 24,4 до 24,5 градусов Цельсия. Вручную настройте систему захвата и анализа в соответствии с протоколом производителя. Визуализируйте частицы с помощью лазерного рассеяния света и захватите их броуновское движение на цифровом видео.Затем проанализируйте записанные видеокассеты с помощью программного обеспечения, отслеживая не менее 200 отдельных частиц за прогон. Для вестерн-блоттинга добавьте 300 микролитров коктейля буфера лизиса и ингибиторов протеазы в экзосомы с смешиванием путем пипетирования вверх и вниз. Затем дайте ему постоять на льду в течение 20 минут.После центрифугирования смеси в 9, 391 раз g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия измеряют концентрацию белка в супернатанте с помощью набора для анализа белка. После анализа нагрейте образец 100 микролитрами 4-кратного буфера загрузки белка при 100 градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем загрузите 15 микролитров белков в концентрации 10 миллиграммов на миллилитр, чтобы запустить гель-электрофорез при 120 вольтах в течение 70 минут и электро-блоттинг при 100 вольтах в течение 60 минут при четырех градусах Цельсия.Обнаружение специфических маркеров, не связанных с экзосомами, таких как кальнексин, и экзосомальных биомаркеров, таких как CD9, CD63 и CD81, путем флуоресцентного вестерн-блоттинга. В исследовании проточная цитометрия использовалась для идентификации поверхностных маркеров SF-MSC. Анализ проточной цитометрии показал, что культивируемые SF-МСК были отрицательными для CD34, CD45 и HLA-DR и положительными для CD73, CD90 и CD105, соответствуя критериям идентификации МСК.При инвертированной микроскопии было замечено, что SF-MSC размножаются на микроносителях. SF-MSC распространялся в 3D-культуре быстрее с шести дней по сравнению с 2D-культурой. Экзосомы из SF-MSC 2D и 3D культуры были идентифицированы с использованием западного блоттинга, и было обнаружено, что экзосомы экспрессируют CD63, CD9 и CD81, будучи отрицательными для кальнексина.Анализ наноцитов показал, что диаметр 2D и 3D экзосом составляет примерно 120 нанометров. Просвечивающий электронный микроскопический анализ выявил морфологию 2D и 3D экзосом, показывая примерно сфероидальные везикулы. С помощью анализа NTA была проанализирована концентрация частиц размером от 30 до 160 нанометров.После 3D-культуры концентрация частиц составляла 4,0 раза 10 до шести на миллилитр. Однако после 2D-культуры концентрация частиц одинакового размера составляла в 2,5 раза 10-шесть на миллилитр. Кроме того, 3D-культура производила больше экзосомного белка, чем 2D-культура.Репрезентативный анализ показывает интернализацию меченых Dil экзосом первичными хондроцитами. Дил-меченые экзосомы, введенные первичными хондроцитами, можно увидеть с пиком в три часа. Исследование доставки in vitro показало, что экзосомы могут доставлять сульфоцианин3-меченую микроРНК-140 к хондроцитам.Покрытие клеток, запуск реакции в биореакторе и супернатанта являются наиболее важными шагами в этом протоколе. 3D-культура обычно используется для крупномасштабной культуры адгезивных клеток. Другие методы, такие как spin flex, также могут быть использованы для крупномасштабного производства экзосом.Наш метод улучшает выход экзосом, что позволяет применять экзосомы на основе MSC доклинического применения.

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Крупномасштабная Экраны метагеномных библиотеки

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Выделение и расширение добычи взрослых человеческих эндотелиальных клеток, образующих колонии Прародитель

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Крупномасштабные данио рерио основе В естественных условиях Малый экран Молекула

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

3D системы для культивирования правам суставные хондроциты в синовиальной жидкости

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium Анализ на крупномасштабных SNP генотипирования приложений

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Стратегия для чувствительной, крупномасштабного Количественные Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Подготовка образцов и изображений Exosomes, просвечивающей электронной микроскопии

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Магнитные активированный ячейку Сортировка стратегии изоляции и очищают синовиальной жидкости производные мезенхимальных стволовых клеток из кролика модели

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Идентификация новых регуляторов транспирации растений путем масштабного теплового скрининга в Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Полуавтоматизированная процедура ChIP-Seq для крупномасштабных эпигенетических исследований

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...