Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
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Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81972116, Nº 81972085, Nº 81772394); Programa clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (No.2018B0303110003); Proyecto de Cooperación Internacional de Guangdong (No.2021A0505030011); Proyectos de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (No.2020M682907); Fundación de Investigación Básica y Aplicada de Guangdong (No.2021A1515010985); Proyecto Sanming de Medicina en Shenzhen (SZSM201612079); Fondos especiales para la construcción de hospitales de alto nivel en la provincia de Guangdong.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humana del Segundo Hospital Popular de Shenzhen. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático de exosomas aislados del protocolo in vitro hSF-MSC.
1. Cultura e identificación de SF-MSCs humanas
<ol><li>Recolectar 20 ml de SF usando una jeringa y una aguja de pacientes clínicos con OA.<ol><li>Desinfecte la articulación de la rodilla del paciente con OA. Punción del tendón femo...

<ol>
	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. 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M., Ruiz, M., No&#235;l, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis:+state+of+the+art+and+perspectives.">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li><li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells.">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 329 (2018).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model.">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. 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The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. 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Las células madre mesenquimales han sido ampliamente utilizadas en medicina regenerativa debido a su autorrenovación, diferenciadas en células tisulares con funciones especializadas y efectos paracrinos16,17. Cabe destacar que los efectos paracrinos ejercidos por los exosomas han atraído mucha atención18. Los exosomas transportan la bioinformación de las MSC y realizan su función biológica y superan las deficiencias de MSC, como el...

La osteoartritis (OA), resultante del cartílago articular y la descomposición ósea subyacente, sigue siendo un desafío grave que conduce a la discapacidad 1,2. Sin suministro de sangre y nervios, la capacidad de autocuración del cartílago es mínima una vez lesionado 3,4. En las últimas décadas, las terapias basadas en la implantación autóloga de condrocitos (ACI) han progresado en el tratamiento de la OA5. Para el aislamiento y la expansión de los condrocitos, es necesario extraer cartílago pequeño del área que no soporta peso de la articulación OA, causando lesiones en el cartílago. Además, el procedimiento requerirá una segunda operación para implantar los condrocitos expandidos6. Por lo tanto, las terapias de un solo paso para el tratamiento de la OA sin lesiones del cartílago están bajo una exploración exhaustiva.
Las células madre mesenquimales (CMM) han sido sugeridas como alternativas prometedoras para el tratamiento de la OA 7,8. Originadas en múltiples tejidos, las MSC pueden diferenciarse en condrocitos con estimulación específica. Es importante destacar que las MSC pueden modular las respuestas inmunes a través de la antiinflamación9. Por lo tanto, las MSC tienen ventajas significativas en el tratamiento de la OA al reparar defectos del cartílago y modular la respuesta inmune, especialmente en el entorno inflamatorio. Para el tratamiento de la OA, las MSC del líquido sinovial (SF-MSC) han atraído recientemente mucha atención debido a su capacidad de diferenciación de condrocitos más fuerte que otras fuentes de MSC10,11. En particular, en la clínica ortopédica, la extracción de SF inflamatorio de la cavidad articular es una terapia de rutina para aliviar el síntoma de dolor de los pacientes con OA. El SF inflamatorio extraído generalmente se elimina como desechos médicos. Tanto los pacientes como los médicos están listos para considerar las CMM autólogas aisladas del SF inflamatorio como tratamiento de OA con muy pocos conflictos éticos. Sin embargo, la terapia SF-MSC se ve comprometida debido a los riesgos tumorigénicos, el almacenamiento prolongado y las barreras de envío distantes.
Los exosomas, secretados por muchos tipos de células, incluidas las MSC, llevan la mayor parte de la bioinformación de las células madre. Ha sido investigado en profundidad como terapia libre de células12,13. De acuerdo con los recursos actualizados disponibles en el sitio web del gobierno de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov), se inician y realizan estudios clínicos de exosomas más extensos en los campos de investigación del cáncer, la hipertensión y las enfermedades neurodegenerativas. El tratamiento con exosomas SF-MSC podría ser un ensayo emocionante y desafiante para hacer frente a la OA. La producción de exosomas a gran escala y de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP) es esencial para la traducción clínica. El aislamiento de exosomas a pequeña escala se ha realizado ampliamente en base al cultivo celular bidimensional (2D). Sin embargo, las estrategias de producción de exosomas a gran escala necesitan optimización. En este estudio se desarrolló un método de fabricación de exosomas a gran escala, basado en el cultivo masivo de SF-MSC en condiciones libres de xeno. Después de la ultracentrifugación de sobrenadantes de cultivo celular, se validó la seguridad y la función del exosoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

Los exosomas secretados por las células madre mesenquimales (MSC) se han sugerido como candidatos prometedores para las lesiones del cartílago y el tratamiento de la osteoartritis. Los exosomas para aplicación clínica requieren una producción a gran escala. Con este objetivo, las MSC de líquido sinovial humano (hSF-MSC) se cultivaron en perlas de microportadores y luego se cultivaron en un sistema de cultivo dinámico de tres dimensiones (3D). Mediante la utilización de la cultura dinámica 3D, este protocolo obtuvo con éxito exosomas a gran escala a partir de sobrenadantes de cultivo SF-MSC. Los exosomas se cosecharon por ultracentrifugación y se verificaron mediante un microscopio electrónico de transmisión, un ensayo de transmisión de nanopartículas y Western blotting. Además, se detectó la seguridad microbiológica de los exosomas. Los resultados de la detección de exosomas sugieren que este enfoque puede producir un gran número de exosomas de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP). Estos exosomas podrían utilizarse en la investigación de la biología de exosomas y el tratamiento clínico de la osteoartritis.

La citometría de flujo fue utilizada para identificar los marcadores de superficie de las SF-MSCs, de acuerdo con los criterios mínimos para definir las MSCs humanas recomendados por la International Society for Cellular Therapy14,15. El análisis de citometría de flujo reveló que las SF-MSCs cultivadas en este estudio cumplieron con los criterios de identificación de las MSCs. Fueron negativos para CD34, CD45 y HLA-DR (por debajo del 3%) y positivos para CD...

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Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Aquí, presentamos un protocolo para producir un gran número de exosomas de grado GMP a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando un biorreactor 3D.

Preparación a gran escala de exosomas derivados de células madre mesenquimales del líquido sinovial mediante cultivo de biorreactores 3D

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Presentamos un protocolo para producir un gran número de exosomas de grado GMP a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando nuestro biorreactor 3D. Estos exosomas podrían utilizarse en la investigación de la biología de exosomas y el tratamiento clínico de la artritis. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Yujie Liang.Comience a recolectar las células mesenquimales humanas, o MSC, centrifugando el líquido sinovial a 1, 500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 10 mililitros de PBS. Centrifugar las células resuspendidas a 1.500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius y desechar PBS antes de volver a suspender el pellet con 10 mililitros de medio de cultivo MSC humano a una densidad celular de cinco veces 10 a la cuarta células por mililitro y luego colocar la suspensión en un plato de 100 milímetros.Incubar el plato a 37 grados centígrados en una atmósfera que contenga 5% de dióxido de carbono. Después de dos semanas, recolecte el sobrenadante de cultivo celular para identificar las células madre mesenquimales del líquido sinovial, o SF-MSC, utilizando citometría de flujo. Para hacerlo, digiera el pasaje de tercera generación tres de SF-MSC por centrifugación a 1.000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Luego, deseche el sobrenadante antes de recoger la bolita celular. A continuación, agregue 400 microlitros del tampón de bloqueo al pellet celular a la concentración de cinco veces 10 al cuarto y deje que el pellet repose durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, centrifugar la suspensión celular como se describió anteriormente, luego resuspender el pellet separado en 100 microlitros de 1X PBS.Añadir un microlitro del anticuerpo fluorescente monoclonal a una relación de dilución de 1:100 por tubo como se describe en el manuscrito, y colocar el tubo para incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, lave las células dos veces con 1X PBS y resuspenda las células en 100 microlitros de 1X PBS. Luego, detecte los fluoróforos en hasta 10, 000 células en un citómetro de flujo utilizando canales rojos y FIFC.Para preparar los microportadores, hinche e hidrate en seco 0,75 gramos de los microportadores en 1X DPBS a la concentración de 50 miligramos por gramo durante al menos tres horas a temperatura ambiente. Luego, decantar el sobrenadante para lavar los microportadores en DPBS fresco durante cinco minutos. Después de reemplazar el medio con 1X DPBS fresco a 50 miligramos de los microportadores por gramo, esterilice los microportadores en autoclave a 121 grados centígrados durante 15 minutos a 15 libras por pulgada cuadrada.Luego, deje que los microportadores esterilizados se asienten antes de decantar el sobrenadante. Enjuague los microportadores en el medio de cultivo a la concentración de 50 miligramos de los microportadores por gramo a temperatura ambiente. Cuando los microportadores estén asentados, deseche el sobrenadante.Para preparar el biorreactor de perfusión, esterilice el biorreactor en autoclave como se describió anteriormente. Cuando haya terminado, cuente el número de SF-MSC para asignar 2.5 veces 10 al séptimo SF-MSC y microportadores al biorreactor perfundido con 250 mililitros del medio de cultivo MSC de grado GMP. Coloque el biorreactor en una incubadora con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados a una velocidad de 15 rotaciones por minuto.Cambiar el medio de cultivo cada seis días. Después de 14 días, recolecte los sobrenadantes y microportadores del cultivo celular para su posterior análisis. Centrifugar el sobrenadante de cultivo celular a 300 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante mientras desecha los restos celulares.A cuatro grados centígrados, centrifugar secuencialmente el sobrenadante a 2, 000 veces G durante 10 minutos y luego a 10, 000 veces G durante 30 minutos para descartar las vesículas más grandes y recoger el pellet. Después de resuspender el pellet en 40 mililitros de PBS, centrifugar la suspensión celular a 120, 000 veces G durante 70 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, resuspenda el pellet recolectado que contiene exosomas en 500 microlitros de PBS.Diluir las muestras de exosomas recién aisladas con PBS estéril a la concentración de 10 a la séptima a 10 a la novena partículas por mililitro e inyectar 500 microlitros de la muestra para cada ejecución en el análisis de seguimiento de nanopartículas, o sistema NTA, a 30 microlitros por minuto y 24.4 a 24.5 grados centígrados. Configure manualmente el sistema de captura y análisis de acuerdo con el protocolo del fabricante. Visualice las partículas mediante la dispersión de la luz láser y capture su movimiento browniano en video digital.A continuación, analice las cintas de video grabadas utilizando software, rastreando al menos 200 partículas individuales por ejecución. Para la Western blotting, agregue 300 microlitros del tampón de lisis y el cóctel de inhibidores de la proteasa a los exosomas con la mezcla pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego, deje reposar sobre hielo durante 20 minutos.Después de la centrifugación de la mezcla a 9, 391 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, mida la concentración de proteína en el sobrenadante utilizando un kit de ensayo de proteínas. Después del ensayo, caliente la muestra con 100 microlitros de tampón de carga de proteína 4X a 100 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, cargue 15 microlitros de proteínas a una concentración de 10 miligramos por mililitro para que funcionen mediante electroforesis en gel a 120 voltios durante 70 minutos, y electrotransferencia a 100 voltios durante 60 minutos a cuatro grados centígrados.Detectar los marcadores específicos no exosomales, como la calnexina y los biomarcadores exosomales como CD9, CD63 y CD81 mediante Western blot fluorescente. En el estudio, se utilizó citometría de flujo para identificar los marcadores de superficie de SF-MSCs. El análisis de citometría de flujo reveló que los SF-MSCs cultivados fueron negativos para CD34, CD45 y HLA-DR, y positivos para CD73, CD90 y CD105, cumpliendo con los criterios de identificación de MSCs.Bajo microscopía invertida, se observó que los SF-MSC proliferan en microportadores. El SF-MSC proliferó en la cultura 3D más rápidamente a partir de seis días en comparación con la cultura 2D. Los exosomas de SF-MSCs de cultivo 2D y 3D se identificaron utilizando Western blot y se encontró que los exosomas expresaban CD63, CD9 y CD81 mientras eran negativos para calnexina.El análisis de nanocitos demostró que el diámetro de los exosomas 2D y 3D era de aproximadamente 120 nanómetros. El análisis microscópico electrónico de transmisión reveló la morfología de los exosomas 2D y 3D, mostrando vesículas aproximadamente esferoidales. Utilizando el análisis NTA, se analizó la concentración de partículas de 30 a 160 nanómetros de tamaño.Después del cultivo 3D, la concentración de partículas fue de 4.0 veces 10 a seis por mililitro. Sin embargo, después del cultivo 2D, la concentración de partículas del mismo tamaño fue de 2,5 veces 10 a seis por mililitro. Además, el cultivo 3D produjo más proteínas exosómicas que el cultivo 2D.El análisis representativo muestra la internalización de exosomas marcados con Dil por condrocitos primarios. Los exosomas marcados con dil que ingresaron a los condrocitos primarios se pueden ver con un pico a las tres horas. El estudio de entrega in vitro demostró que los exosomas podrían administrar microARN-140 marcado con sulfocianina3 a los condrocitos.El recubrimiento de las células, el inicio de la reacción en el biorreactor y el sobrenadante son los pasos más importantes en este protocolo. El cultivo 3D se usa comúnmente para el cultivo a gran escala de células adherentes. Otros métodos, como la flexión de espín, también se pueden utilizar para la producción a gran escala de exosomas.Nuestro método mejora el rendimiento de los exosomas, lo que permite la aplicación preclínica basada en exosomas MSC.

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