Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

National Natural Science Foundation of China (nr 81972116, nr 81972085, nr 81772394); Nyckelprogram för naturvetenskapliga stiftelsen i Guangdong-provinsen (nr 2018B0303110003); Guangdongs internationella samarbetsprojekt (nr 2021A0505030011); Shenzhen vetenskaps- och teknikprojekt (nr. GJHZ20200731095606019, Nej. JCYJ20170817172023838, nr. JCYJ20170306092215436, nr. JCYJ20170413161649437); Kinas postdoktorala vetenskapsstiftelse (nr 2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (nr 2021A1515010985); Sanming-projektet för medicin i Shenzhen (SZSM201612079); Särskilda medel för byggandet av sjukhus på hög nivå i Guangdong-provinsen.

Denna studie godkändes av Human Ethics Committee of Shenzhen Second People's Hospital. Ett schematiskt diagram över exosomer isolerade från hSF-MSCs in vitro-protokoll visas i figur 1.
1. Mänsklig SF-MSCs kultur och identifiering
<ol><li>Skörda 20 ml SF med en spruta och nål från kliniska OA-patienter.<ol><li>Desinficera knäleden hos OA-patienten. Punktering från quadriceps femoris-senan utanför patella in i ledhålan med en 7...

<ol>
	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlike+bone,+cartilage+regeneration+remains+elusive.">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration.">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li><li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI.">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li><li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chondrocyte+implantation:+past,+present,+and+future.">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li><li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis.">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li><li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee:+a+proof-of-concept+clinical+trial.">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li><li>Pers, Y. M., Ruiz, M., No&#235;l, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis:+state+of+the+art+and+perspectives.">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li><li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells.">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 329 (2018).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model.">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy.">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li><li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy.">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+(3D)+spheroids.">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury.">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury.">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 206 (2020).</li></ol>

De mesenkymala stamcellerna har använts i stor utsträckning inom regenerativ medicin på grund av deras självförnyelse, differentierade till vävnadsceller med specialiserade funktioner och parakrina effekter16,17. I synnerhet har de parakrina effekterna som utövas av exosomer väckt stor uppmärksamhet18. Exosomer bär bioinformation från MSC och utför sin biologiska funktion och övervinner MSC-brister, såsom besvärlig lagring o...

Artros (OA), till följd av ledbrosk och underliggande bennedbrytning, är fortfarande en allvarlig utmaning som leder till funktionshinder 1,2. Utan blod- och nervtillförsel är broskets självläkande förmåga minimal när den väl har skadats 3,4. Under de senaste decennierna har terapier baserade på autolog kondrocytimplantation (ACI) gjort vissa framsteg i OA-behandling5. För kondrocytisolering och expansion är det nödvändigt att skörda litet brosk från OA-ledens icke-viktbärande område, vilket orsakar skador på brosket. Förfarandet kommer också att kräva en andra operation för att implantera de expanderade kondrocyterna6. Således är enstegsterapier för OA-behandling utan broskskador under omfattande utforskning.
Mesenkymala stamceller (MSC) har föreslagits som lovande alternativ för OA-behandling 7,8. MSC kommer från flera vävnader och kan differentieras till kondrocyter med specifik stimulering. Viktigt är att MSC kan modulera immunsvar via anti-inflammation9. Därför har MSC betydande fördelar vid OA-behandling genom att reparera broskdefekter och modulera immunsvaret, särskilt i inflammationsmiljön. För OA-behandling har MSC från synovialvätska (SF-MSC) nyligen väckt stor uppmärksamhet på grund av deras starkare kondrocytdifferentieringsförmåga än andra MSC-källor10,11. I synnerhet på den ortopediska kliniken är extraktionen av inflammatorisk SF från ledhålan en rutinbehandling för att lindra smärtsymptomet hos OA-patienter. Extraherad inflammatorisk SF bortskaffas vanligtvis som medicinskt avfall. Både patienter och läkare är redo att överväga autologa MSC isolerade från inflammatorisk SF som OA-behandling med mycket få etiska konflikter. SF-MSC-terapi äventyras dock på grund av tumörogena risker, långvarig lagring och avlägsna leveransbarriärer.
Exosomer, som utsöndras av många celltyper, inklusive MSC, bär det mesta av modercellens bioinformation. Det har undersökts ingående som en cellfri terapi12,13. Enligt de uppdaterade resurserna som finns tillgängliga på webbplatsen för kliniska prövningar (ClinicalTrials.gov) initieras och genomförs mer omfattande exosomkliniska studier inom forskningsområdena cancer, högt blodtryck och neurodegenerativa sjukdomar. SF-MSC exosombehandling kan vara en spännande och utmanande prövning för att hantera OA. God tillverkningssed (GMP) och storskalig exosomproduktion är avgörande för klinisk översättning. Småskalig exosomisolering har utförts i stor utsträckning baserat på tvådimensionell (2D) cellodling. Storskaliga exosomproduktionsstrategier behöver dock optimeras. En storskalig exosomtillverkningsmetod utvecklades i denna studie, baserad på massiv SF-MSC-kultur under xenofria förhållanden. Efter ultracentrifugering från cellodlingssupernatanter validerades exosomsäkerhet och funktion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

Exosomer som utsöndras av mesenkymala stamceller (MSC) har föreslagits som lovande kandidater för broskskador och artrosbehandling. Exosomer för klinisk tillämpning kräver storskalig produktion. För detta ändamål odlades humana synovialvätska MSC (hSF-MSC) på mikrobärarpärlor och odlades sedan i ett dynamiskt tredimensionellt (3D) odlingssystem. Genom att använda 3D-dynamisk kultur erhöll detta protokoll framgångsrikt storskaliga exosomer från SF-MSC-kultursupernatanter. Exosomer skördades genom ultracentrifugering och verifierades av ett transmissionselektronmikroskop, nanopartikelöverföringsanalys och western blotting. Dessutom detekterades den mikrobiologiska säkerheten hos exosomer. Resultat av exosomdetektering tyder på att den här metoden kan producera ett stort antal exosomer av god tillverkningssed (GMP). Dessa exosomer kan användas i exosombiologisk forskning och klinisk artrosbehandling.

Flödescytometri användes för att identifiera ytmarkörerna för SF-MSC, enligt de minimala kriterierna för att definiera humana MSC som rekommenderas av International Society for Cellular Therapy14,15. Flödescytometrianalys avslöjade att SF-MSC som odlades i denna studie uppfyllde identifieringskriterierna för MSC. De var negativa för CD34, CD45 och HLA-DR (under 3%) och positiva för CD73, CD90 och CD105 (över 95%) (Figur 2...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Här presenterar vi ett protokoll för att producera ett stort antal exosomer av GMP-kvalitet från synovialvätska mesenkymala stamceller med hjälp av en 3D-bioreaktor.

Storskalig beredning av synovialvätska mesenkymala stamcellsderiverade exosomer genom 3D-bioreaktorodling

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Vi presenterar ett protokoll för att producera ett stort antal exosomer av GMP-kvalitet från synovialvätska mesenkymala stamceller med hjälp av vår 3D-bioreaktor. Dessa exosomer kan användas i exosombiologi forskning och klinisk artrit behandling. Demonstrerar proceduren kommer att vara Dr.Yujie Liang.Börja samla de mänskliga mesenkymala cellerna, eller MSC, genom att centrifugera synovialvätskan vid 1 500 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Efter centrifugering, kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 10 ml PBS. Centrifugera de återsuspenderade cellerna vid 1 500 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och kassera PBS innan du återsuspenderar pelleten med 10 ml humant MSC-odlingsmedium vid en celldensitet på fem gånger 10 till de fjärde cellerna per milliliter och platta sedan suspensionen i en 100-millimeters skål.Inkubera skålen vid 37 grader Celsius i en atmosfär som innehåller 5% koldioxid. Efter två veckor, samla cellodlingssupernatanten för att identifiera synovialvätska mesenkymala stamceller, eller SF-MSC, med hjälp av flödescytometri. För att göra det, smälta tredje generationens passage tre av SF-MSC genom centrifugering vid 1 000 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Kassera sedan supernatanten innan du samlar cellpelleten. Tillsätt sedan 400 mikroliter av blockeringsbufferten till cellpelleten i koncentrationen av fem gånger 10 till den fjärde och låt pelleten stå i 15 minuter vid rumstemperatur. Efter 15 minuter centrifugerar du cellsuspensionen som beskrivits tidigare och återsuspenderar sedan den separerade pelleten i 100 mikroliter 1X PBS.Tillsätt en mikroliter av den monoklonala fluorescerande antikroppen vid ett utspädningsförhållande på 1:100 per rör enligt beskrivningen i manuskriptet och placera röret för inkubation vid rumstemperatur i 30 minuter. Efter inkubation, tvätta cellerna två gånger med 1X PBS och återsuspendera cellerna i 100 mikroliter 1X PBS. Upptäck sedan fluoroforerna i upp till 10 000 celler på en flödescytometer med röda och FITC-kanaler.För att förbereda mikrobärarna, svälla och hydratisera torka 0,75 gram av mikrobärarna i 1X DPBS i koncentrationen av 50 milligram per gram i minst tre timmar vid rumstemperatur. Dekantera sedan supernatanten för att tvätta mikrobärarna i färsk DPBS i fem minuter. Efter att ha ersatt mediet med färskt 1X DPBS vid 50 milligram av mikrobärarna per gram, sterilisera mikrobärarna genom autoklavering vid 121 grader Celsius i 15 minuter vid 15 pund per kvadrattum.Låt sedan de steriliserade mikrobärarna sätta sig innan du dekanterar supernatanten. Skölj mikrobärarna i odlingsmediet i koncentrationen av 50 milligram av mikrobärarna per gram vid rumstemperatur. När mikrocarriersna är avgjorda, kassera supernatanten.För att förbereda perfusionsbioreaktorn, sterilisera bioreaktorn genom autoklavering som beskrivits tidigare. När du är klar räknar du antalet SF-MSC för att fördela 2,5 gånger 10 till den sjunde SF-MSC och mikrocarriers till bioreaktorn perfuserad med 250 ml av GMP-klass MSC-odlingsmediet. Placera bioreaktorn i en inkubator med 5% koldioxid vid 37 grader Celsius med en hastighet av 15 varv per minut.Byt odlingsmedium var sjätte dag. Efter 14 dagar, samla cellodlingssupernatanterna och mikrobärarna för vidare analys. Centrifugera cellodlingssupernatanten vid 300 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och samla supernatanten medan du kasserar cellresterna.Vid fyra grader Celsius centrifugerar du supernatanten sekventiellt vid 2 000 gånger G i 10 minuter och sedan vid 10 000 gånger G i 30 minuter för att kassera de större vesiklarna och samla pelleten. Efter att ha återsuspenderat pelleten i 40 ml PBS, centrifugera cellsuspensionen vid 120 000 gånger G i 70 minuter vid fyra grader Celsius. Återsuspendera sedan den uppsamlade pelleten som innehåller exosomer i 500 mikroliter PBS.Späd de nyligen isolerade exosomproverna med steril PBS till koncentrationen av 10 till den sjunde till 10 till den nionde partiklarna per milliliter och injicera 500 mikroliter av provet för varje körning i nanopartikelspårningsanalysen, eller NTA-systemet, vid 30 mikroliter per minut och 24,4 till 24,5 grader Celsius. Ställ in fångst- och analyssystemet manuellt enligt tillverkarens protokoll. Visualisera partiklarna genom laserljusspridning och fånga deras bruna rörelse på digital video.Analysera sedan de inspelade videobanden med hjälp av programvara och spåra minst 200 enskilda partiklar per körning. För Western blotting, tillsätt 300 mikroliter lysbuffert och proteashämmare cocktail till exosomerna med blandning genom pipettering upp och ner. Låt sedan stå på is i 20 minuter.Efter centrifugering av blandningen vid 9 391 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius, mäta proteinkoncentrationen i supernatanten med hjälp av ett proteinanalyssats. Värm provet efter analysen med 100 mikroliter 4X proteinbelastningsbuffert vid 100 grader Celsius i 10 minuter. Därefter ladda 15 mikroliter proteiner i en koncentration av 10 milligram per milliliter för att köras med gelelektrofores vid 120 volt i 70 minuter och elektro-blotting vid 100 volt i 60 minuter vid fyra grader Celsius.Upptäck de icke-exosomspecifika markörerna, såsom calnexin och de exosomala biomarkörerna som CD9, CD63 och CD81 genom fluorescerande Western blotting. I studien användes flödescytometri för att identifiera ytmarkörerna för SF-MSC: er. Flödescytometrianalys avslöjade att de odlade SF-MSC: erna var negativa för CD34, CD45 och HLA-DR och positiva för CD73, CD90 och CD105, som uppfyllde identifieringskriterierna för MSC.Under inverterad mikroskopi märktes att SF-MSC: erna sprider sig på mikrobärare. SF-MSC spred sig snabbare i 3D-kulturen från sex dagar och framåt jämfört med 2D-kulturen. Exosomerna från SF-MSC av 2D- och 3D-kultur identifierades med hjälp av Western blotting och exosomerna visade sig uttrycka CD63, CD9 och CD81 samtidigt som de var negativa för calnexin.Nanocytanalysen visade att diametern på 2D- och 3D-exosomer var cirka 120 nanometer. Den transmissionselektronmikroskopiska analysen avslöjade morfologin hos 2D- och 3D-exosomer, som visar ungefär sfäroida vesiklar. Med hjälp av NTA-analys analyserades koncentrationen av partiklar i 30 till 160 nanometerstorlek.Efter 3D-odling var partikelkoncentrationen 4,0 gånger 10 till sex per milliliter. Men efter 2D-kulturen var koncentrationen av partiklar av samma storlek 2,5 gånger 10 till sex per milliliter. Dessutom producerade 3D-kulturen mer exosomprotein än 2D-kultur.Den representativa analysen visar internaliseringen av Dil-märkta exosomer av primära kondrocyter. Dil-märkta exosomer in i primära kondrocyter kan ses med en topp vid tre timmar. In vitro-leveransstudie visade att exosomer kunde leverera sulfo-cyanin3-märkt mikroRNA-140 till kondrocyter.Plätering av cellerna, start av reaktionen i bioreaktorn och supernatanten är de viktigaste stegen i detta protokoll. 3D-odling används ofta för storskalig odling av vidhäftande celler. Andra metoder som spinnflex kan också användas för storskalig produktion av exosomer.Vår metod förbättrar utbytet av exosomer, vilket möjliggör MSC exosombaserad preklinisk applikation.

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Storskaliga skärmar Metagenomic bibliotek

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolering och storskalig expansion av vuxen människa Endothelial kolonibildande progenitorceller

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Småmolekylära skärm

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

En 3D-system för odling mänskliga Artikulära chondrocyter i ledvätskan

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium analys för Storskaliga SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

En strategi för känsliga, storskaliga kvantitativa Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Provberedning och avbildning av Exosomes av transmissionselektronmikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk-aktiverad Cell sortering strategier för att isolera och rena Synovial vätska-Derived mesenkymala stamceller från en kanin-modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identifiering av nya regulatorer av växttranspiration genom storskalig termisk avbildningsscreening i Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

En halvautomatisk ChIP-Seq-procedur för storskaliga epigenetiska studier

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...