Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81972116, No. 81972085, No. 81772394); Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı Anahtar Programı (No.2018B0303110003); Guangdong Uluslararası İşbirliği Projesi (No.2021A0505030011); Shenzhen Bilim ve Teknoloji Projeleri (Hayır. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (No.2020M682907); Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (No.2021A1515010985); Shenzhen'de Sanming Tıp Projesi (SZSM201612079); Guangdong Eyaletinde Üst Düzey Hastanelerin İnşaatı için Özel Fonlar.

Bu çalışma Shenzhen İkinci Halk Hastanesi İnsan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. hSF-MSC'lerden izole edilen eksozomların şematik diyagramı in vitro protokolde Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. İnsan SF-MSC'lerinin kültürü ve tanımlanması
<ol><li>Klinik OA hastalarından bir şırınga ve iğne kullanarak 20 mL SF hasat edin.<ol><li>OA hastasının diz eklemini dezenfekte edin. Kuadriseps femoris tendonundan pate...

<ol>
	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlike+bone,+cartilage+regeneration+remains+elusive.">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration.">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li><li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI.">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li><li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chondrocyte+implantation:+past,+present,+and+future.">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li><li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis.">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li><li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee:+a+proof-of-concept+clinical+trial.">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li><li>Pers, Y. M., Ruiz, M., No&#235;l, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis:+state+of+the+art+and+perspectives.">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li><li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells.">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 329 (2018).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model.">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy.">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li><li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy.">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+(3D)+spheroids.">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury.">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury.">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 206 (2020).</li></ol>

Mezenkimal kök hücreler, kendini yenilemeleri, özel fonksiyonlara sahip doku hücrelerine farklılaşmaları ve parakrin etkileri nedeniyle rejeneratif tıpta yaygın olarak kullanılmaktadır16,17. Özellikle, eksozomlar tarafından uygulanan parakrin etkiler çok dikkat çekmiştir18. Eksozomlar, MSC'lerin biyo-bilgilerini taşır ve biyolojik işlevlerini yerine getirir ve zahmetli depolama ve sevkiyat gibi MSC eksikliklerinin üstes...

Eklem kıkırdağı ve altta yatan kemik parçalanmasından kaynaklanan osteoartrit (OA), sakatlığa yol açan ciddi bir zorluk olmaya devam etmektedir 1,2. Kan ve sinir kaynağı olmadan, kıkırdak kendi kendini iyileştirme yeteneği bir kez yaralandığında minimumdur 3,4. Son yıllarda, otolog kondrosit implantasyonuna (ACI) dayalı tedaviler OA tedavisinde bazı ilerlemeler kaydetmiştir5. Kondrosit izolasyonu ve genişlemesi için, OA ekleminin ağırlık taşımayan alanından küçük kıkırdak toplanması gereklidir ve bu da kıkırdakta yaralanmalara neden olur. Ayrıca, prosedür genişletilmiş kondrositleri implante etmek için ikinci bir operasyon gerektirecektir6. Bu nedenle, kıkırdak yaralanmaları olmadan OA tedavisi için tek aşamalı tedaviler kapsamlı bir şekilde araştırılmaktadır.
Mezenkimal kök hücreler (MSC) OA tedavisinde umut verici alternatifler olarak önerilmiştir 7,8. Birden fazla dokudan kaynaklanan MSC'ler, spesifik stimülasyonla kondrositlere farklılaşabilir. Önemli olarak, MSC'ler anti-inflamasyon9 yoluyla bağışıklık tepkilerini modüle edebilir. Bu nedenle MSC'ler OA tedavisinde kıkırdak defektlerini onararak ve özellikle inflamasyon ortamında immün yanıtı modüle ederek önemli avantajlar sağlamaktadır. OA tedavisi için, sinovyal sıvıdan (SF-MSC'ler) MSC'ler, diğer MSC kaynaklarından daha güçlü kondrosit farklılaşma yetenekleri nedeniyle son zamanlarda çok dikkat çekmiştir10,11. Özellikle, ortopedik klinikte, eklem boşluğundan enflamatuar SF'nin çıkarılması, OA hastalarının ağrı semptomunu hafifletmek için rutin bir tedavidir. Ekstrakte edilen inflamatuar SF genellikle tıbbi atık olarak bertaraf edilir. Hem hastalar hem de doktorlar, inflamatuar SF'den izole edilen otolog MSC'leri çok az etik çatışma ile OA tedavisi olarak düşünmeye hazırdır. Bununla birlikte, SF-MSC tedavisi tümörojenik riskler, uzun süreli depolama ve uzak sevkiyat engelleri nedeniyle tehlikeye girmektedir.
MSC'ler de dahil olmak üzere birçok hücre tipi tarafından salgılanan eksozomlar, ana hücre biyo-bilgisinin çoğunu taşır. Hücresiz tedavi olarak derinlemesine araştırılmıştır12,13. Klinik araştırma hükümeti (ClinicalTrials.gov) web sitesinde bulunan güncellenmiş kaynaklara göre, kanser, hipertansiyon ve nöro-dejeneratif hastalıkların araştırma alanlarında daha kapsamlı eksozom klinik çalışmaları başlatılmakta ve üstlenilmektedir. SF-MSC eksozom tedavisi, OA ile başa çıkmak için heyecan verici ve zorlu bir çalışma olabilir. İyi üretim uygulamaları (GMP) sınıfı ve büyük ölçekli eksozom üretimi klinik çeviri için gereklidir. Küçük ölçekli eksozom izolasyonu, iki boyutlu (2D) hücre kültürüne dayanarak yaygın olarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, büyük ölçekli eksozom üretim stratejilerinin optimizasyona ihtiyacı vardır. Bu çalışmada, ksenosuz koşullarda masif SF-MSC kültürüne dayanan büyük ölçekli bir eksozom üretim yöntemi geliştirilmiştir. Hücre kültürü süpernatantlarından ultrasantrifüjlemeden sonra, eksozom güvenliği ve fonksiyonu doğrulandı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) tarafından salgılanan eksozomlar, kıkırdak yaralanmaları ve osteoartrit tedavisi için umut verici adaylar olarak önerilmiştir. Klinik uygulama için eksozomlar büyük ölçekli üretim gerektirir. Bu amaçla, insan sinovyal sıvı MSC'leri (hSF-MSC'ler) mikro taşıyıcı boncuklar üzerinde yetiştirildi ve daha sonra dinamik üç boyutlu (3D) bir kültür sisteminde kültürlendi. 3D dinamik kültürü kullanarak, bu protokol SF-MSC kültür süpernatantlarından büyük ölçekli eksozomları başarıyla elde etti. Eksozomlar ultrasantrifüjleme ile toplandı ve bir iletim elektron mikroskobu, nanopartikül iletim testi ve batı lekelenmesi ile doğrulandı. Ayrıca, eksozomların mikrobiyolojik güvenliği tespit edildi. Eksozom tespitinin sonuçları, bu yaklaşımın çok sayıda iyi üretim uygulamaları (GMP) sınıfı eksozom üretebileceğini düşündürmektedir. Bu eksozomlar ekzozom biyolojisi araştırmalarında ve klinik osteoartrit tedavisinde kullanılabilir.

SF-MSC'lerin yüzey belirteçlerini tanımlamak için akım sitometrisi, Uluslararası Hücresel Terapi Derneği14,15 tarafından önerilen insan MSC'lerini tanımlamak için minimum kriterlere göre kullanılmıştır. Akım sitometri analizi, bu çalışmada kültüre alınan SF-MSC'lerin MSC'lerin tanımlama kriterlerini karşıladığını ortaya koymuştur. CD34, CD45 ve HLA-DR (%3'ün altında) için negatif ve CD73, CD90 ve CD105 (%95'in üzerinde) için p...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Burada, bir 3D biyoreaktör kullanarak sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerden çok sayıda GMP sınıfı eksozom üretmek için bir protokol sunuyoruz.

Sinovyal Sıvı Mezenkimal Kök Hücre Kaynaklı Eksozomların 3D Biyoreaktör Kültürü ile Büyük Ölçekli Hazırlanması

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

3D biyoreaktörümüzü kullanarak sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerden çok sayıda GMP sınıfı eksozom üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu eksozomlar ekzozom biyolojisi araştırmalarında ve klinik artrit tedavisinde kullanılabilir. Prosedürü gösteren Dr. Yujie Liang olacak.İnsan mezenkimal hücrelerini veya MSC'leri, sinovyal sıvıyı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.500 kez G'de santrifüj ederek toplamaya başlayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini 10 mililitre PBS ile yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.500 kez G'de santrifüj yapın ve peleti 10 mililitre insan MSC kültür ortamı ile beş kez 10 hücre yoğunluğunda mililitre başına dördüncü hücrelere yeniden askıya almadan önce PBS'yi atın ve ardından süspansiyonu 100 milimetrelik bir kapta tabaklayın.Yemeği% 5 karbondioksit içeren bir atmosferde 37 santigrat derecede inkübe edin. İki hafta sonra, akış sitometrisini kullanarak sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerini veya SF-MSC'leri tanımlamak için hücre kültürü süpernatantını toplayın. Bunu yapmak için, SF-MSC'lerin üçüncü nesil geçişini, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1.000 kez G'de santrifüjleme yoluyla sindirin.Ardından, hücre peletini toplamadan önce süpernatantı atın. Daha sonra, hücre peletine beş kez 10 ila dördüncü konsantrasyonda 400 mikrolitre blokaj tamponu ekleyin ve peletin oda sıcaklığında 15 dakika beklemesine izin verin. 15 dakika sonra, hücre süspansiyonunu daha önce açıklandığı gibi santrifüj edin, ardından ayrılmış peleti 100 mikrolitre 1X PBS içinde yeniden askıya alın.Makalede açıklandığı gibi tüp başına 1:100 seyreltme oranında monoklonal floresan antikorun bir mikrolitresini ekleyin ve tüpü 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübasyon için yerleştirin. Kuluçkayı takiben, hücreleri 1X PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 100 mikrolitre 1X PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra, kırmızı ve FITC kanallarını kullanarak bir akış sitometresinde 10.000 hücreye kadar floroforları tespit edin.Mikro taşıyıcıları hazırlamak için, mikrotaşıyıcıların 0.75 gramını, oda sıcaklığında en az üç saat boyunca gram başına 50 miligram konsantrasyonda 1X DPBS'de şişirin ve nemlendirin. Daha sonra, mikro taşıyıcıları beş dakika boyunca taze DPBS'de yıkamak için süpernatantı boşaltın. Ortamı, gram başına 50 miligram mikro taşıyıcıda taze 1X DPBS ile değiştirdikten sonra, mikrotaşıyıcıları, inç kare başına 15 pound'da 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlayarak sterilize edin.Ardından, süpernatanı boşaltmadan önce sterilize edilmiş mikro taşıyıcıların yerleşmesine izin verin. Kültür ortamındaki mikro taşıyıcıları, oda sıcaklığında gram başına 50 miligram mikro taşıyıcı konsantrasyonunda durulayın. Mikro taşıyıcılar yerleştiğinde, süpernatanı atın.Perfüzyon biyoreaktörünü hazırlamak için, daha önce açıklandığı gibi otoklavlama yaparak biyoreaktörü sterilize edin. İşiniz bittiğinde, yedinci SF-MSC'lere 2,5 kez 10 tahsis etmek için SF-MSC'lerin sayısını ve GMP sınıfı MSC kültür ortamının 250 mililitresi ile perfüze edilmiş biyoreaktöre mikro taşıyıcıları sayın. Biyoreaktörü, dakikada 15 dönme hızında, 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren bir inkübatöre yerleştirin.Kültür ortamını her altı günde bir değiştirin. 14 gün sonra, daha fazla analiz için hücre kültürü süpernatantlarını ve mikro taşıyıcılarını toplayın. Hücre kültürü süpernatantını dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin ve hücresel kalıntıları atarken süpernatantı toplayın.Dört santigrat derecede, daha büyük vezikülleri atmak ve peleti toplamak için süpernatantı 10 dakika boyunca 2.000 kez G'de ve daha sonra 30 dakika boyunca 10.000 kez G'de sırayla santrifüj yapın. Peleti 40 mililitre PBS'de yeniden askıya aldıktan sonra, hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede 70 dakika boyunca 120.000 kez G'de santrifüj edin. Daha sonra, 500 mikrolitre PBS'de eksozom içeren toplanan peleti yeniden askıya alın.Yeni izole edilmiş eksozom örneklerini steril PBS ile mililitre başına 10 ila yedinci ila 10 ila dokuzuncu partikül konsantrasyonuna kadar seyreltin ve nanopartikül izleme analizine veya NTA sistemine dakikada 30 mikrolitre ve 24.4 ila 24.5 santigrat derecede her çalışma için numunenin 500 mikrolitresini enjekte edin. Yakalama ve analiz sistemini üreticinin protokolüne göre manuel olarak ayarlayın. Lazer ışık saçılmasıyla parçacıkları görselleştirin ve dijital videoda Brownian hareketlerini yakalayın.Ardından, yazılım kullanarak kaydedilen video kasetleri analiz edin ve çalışma başına en az 200 ayrı parçacığı izleyin. Batı lekelemesi için, yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırarak eksozomlara 300 mikrolitre lizis tamponu ve proteaz inhibitörleri kokteyli ekleyin. Ardından, 20 dakika boyunca buzun üzerinde durmasını bekleyin.Karışımın dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9, 391 kez G'de santrifüjlenmesinden sonra, bir protein tahlil kiti kullanarak süpernatanttaki protein konsantrasyonunu ölçün. Testi takiben, numuneyi 100 dakika boyunca 100 santigrat derecede 100 mikrolitre 4X protein yükleme tamponu ile ısıtın. Daha sonra, 70 dakika boyunca 120 voltta jel elektroforezi ve dört santigrat derecede 60 dakika boyunca 100 voltta elektro-lekelenme ile çalışmak üzere mililitre başına 10 miligram konsantrasyonda 15 mikrolitre protein yükleyin.Kalneksin gibi eksozom olmayan spesifik belirteçleri ve CD9, CD63 ve CD81 gibi ekzomal biyobelirteçleri floresan Western lekeleme ile tespit edin. Çalışmada, SF-MSC'lerin yüzey belirteçlerini tanımlamak için akış sitometrisi kullanılmıştır. Akış sitometrisi analizi, kültürlenmiş SF-MSC'lerin CD34, CD45 ve HLA-DR için negatif ve CD73, CD90 ve CD105 için pozitif olduğunu ve MSC'lerin tanımlama kriterlerini karşıladığını ortaya koymuştur.Ters mikroskopi altında, SF-MSC'lerin mikrotaşıyıcılar üzerinde çoğaldığı fark edildi. SF-MSC, 3D kültürde altı günden itibaren 2D kültüre kıyasla daha hızlı çoğaldı. 2D ve 3D kültürün SF-MSC'lerinden gelen eksozomlar Batı lekelenmesi kullanılarak tanımlandı ve eksozomların CD63, CD9 ve CD81'i eksprese ederken kalneksin için negatif olduğu bulundu.Nanosit analizi, 2D ve 3D eksozomların çapının yaklaşık 120 nanometre olduğunu gösterdi. İletim elektron mikroskobik analizi, kabaca küresel vezikülleri gösteren 2D ve 3D eksozomların morfolojisini ortaya çıkardı. NTA analizi kullanılarak, 30 ila 160 nanometre boyutundaki parçacıkların konsantrasyonu analiz edildi.3D kültürden sonra, parçacık konsantrasyonu mililitre başına 4.0 kat 10 ila altı idi. Bununla birlikte, 2B kültüründen sonra, aynı büyüklükteki parçacıkların konsantrasyonu, mililitre başına altı ila 2.5 kat 10 idi. Ayrıca, 3D kültür, 2D kültürden daha fazla eksozom proteini üretti.Temsili analiz, Dil-etiketli eksozomların birincil kondrositler tarafından içselleştirilmesini göstermektedir. Primer kondrositlere giren dil etiketli eksozomlar üç saatte bir zirve ile görülebilir. İn vitro dağıtım çalışması, eksozomların sülfo-siyanin3 etiketli mikroRNA-140'ı kondrositlere verebileceğini göstermiştir.Hücrelerin kaplanması, biyoreaktörde reaksiyonun başlatılması ve süpernatantın bu protokoldeki en önemli adımlardır. 3D kültür, yapışkan hücrelerin büyük ölçekli kültürü için yaygın olarak kullanılır. Spin flex gibi diğer yöntemler de eksozomların büyük ölçekli üretimi için kullanılabilir.Yöntemimiz eksozomların verimini arttırır, böylece MSC eksozom tabanlı preklinik uygulamayı mümkün kılar.

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Büyük Ölçekli Zebra balığı Tabanlı In vivo Küçük Molekül Ekran

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Büyük ölçekli SNP Genotiplendirme Uygulamaları için infinium Tahlili

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Helianthus Annuus'ta Büyük Ölçekli Termal Görüntüleme Taraması ile Bitki Transpirasyonunun Yeni Regülatörlerinin Belirlenmesi

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Büyük Ölçekli Epigenetik Çalışmalar için Yarı Otomatik ChIP-Seq Prosedürü

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...