Name: in vivo calcium imaging in mouse inferior olive
Uploaded: 2021-06-10T14:30:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive at JoVE.com

Nous remercions Andrew Scott du centre des médias de l’OIST pour son aide à l’enregistrement et au montage vidéo. Nous remercions également Hugo Hoedemaker pour son aide dans le développement de la chirurgie pour exposer le tronc cérébral et le Dr Kevin Dorgans pour son aide dans la rédaction de diagrammes pour les figures. De plus, un grand merci à Salvatore Lacava pour sa narration en voix off, ainsi qu’à tous les membres du nRIM et aux animaux de compagnie pour leur soutien continu au bien-être dans les moments difficiles de COVID-19.

<ol>
	<li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+signals+in+vivo:+A+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology.">Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. , (2011).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kilohertz+two-photon+brain+imaging+in+awake+mice.">Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice.</a> Nature Methods. , (2019).</li><li>Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. 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J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).</li><li>Vrieler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+and+directionality+of+inferior+olive+neuron+dendrites+revealed+by+detailed+3D+characterization+of+an+extensive+morphological+library.">Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library.</a> Brain Structure and Function. , 1677-1695 (2019).</li><li>Esposito, M. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+neuroanatomical+characterization+of+single+neurons+in+the+mouse+medullary+gigantocellular+reticular+nucleus.">Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li><li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine/Xylazine.">Ketamine/Xylazine.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> eLife. 8, 1-45 (2019).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIN1PIPE:+A+Miniscope+1-Photon-Based+Calcium+Imaging+Signal+Extraction+Pipeline.">MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline.</a> Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).</li><li>. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy">https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy</a> (2020)</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. 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I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferior+olive:+All+ins+and+outs.">Inferior olive: All ins and outs.</a> Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).</li><li>Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Subthreshold+Voltage+Oscillation+With+Cellular+Resolution+in+the+Inferior+Olive+in+vitro.">Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Comme l’intervention chirurgicale implique des opérations effectuées dans la région de la gorge avec de nombreuses structures vitales (artères, nerfs), il est essentiel qu’elle soit menée par un chercheur ayant des compétences chirurgicales de haut niveau. En suivant, nous soulignons et commentons plusieurs points clés de la procédure; cependant, il faut se rappeler qu’aucune quantité de conseils écrits ne peut supplanter l’expérience, les compétences et l’intuition du chercheur.
L’étape la plus critique de la chirurgie est la trachéotomie. Il s’agit de couper la trachée, de passer l’isoflurane du cône nasal au tube d’intubation, de fixer la trachée à la peau de la poitrine et d’attacher la trachée et le tube d’intubation ensemble. Toutes ces opérations doivent être effectuées de manière fluide et rapide pour éviter les accidents, tels qu’une anesthésie inadéquate, un afflux de liquide dans la trachée ou un glissement du tube d’intubation. Il faut garder le protocole clair à l’esprit avant de couper la trachée.
L’hémorragie est l’une des principales causes de mort animale dans cette chirurgie. Étant donné que la région du cou est dense en vaisseaux sanguins, la coupe ne doit être exécutée que lorsque la ligne de visée est claire pour éviter de couper des veines et des artères invisibles. Par conséquent, les muscles et les tissus conjonctifs obscurcissant la vision doivent être enlevés, et le sang des capillaires cassés doit être nettoyé avant d’avancer.
L’animal peut être maintenu en vie pendant une longue période (plus de 8 heures) à partir du début de la chirurgie. Cependant, il est important de terminer l’intervention chirurgicale rapidement afin qu’il y ait plus de temps pour examiner les neurones du tronc cérébral lorsque l’état physiologique de l’animal est bon. Un chercheur qualifié peut terminer toute la procédure en 70 min.
Bien que la méthode offre une vue propre des surfaces ventrales du cerveau, il est malheureusement impossible de le faire sans effectuer une trachéotomie ainsi que l’élimination d’une quantité importante de tissu dans la région de la gorge. Par conséquent, l’animal ne peut pas être autorisé à se réveiller de l’anesthésie. De plus, même s’il est possible de maintenir l’animal en vie pendant de nombreuses heures avec un ajustement minutieux de l’administration anesthésique, le maintien de la température corporelle et de l’hydratation, il est inévitable que l’expérimentation prolongée finisse par affaiblir la condition animale. Il est laissé à l’expertise du chercheur de considérer la durée maximale des enregistrements stables.
Une autre limitation potentielle de la méthode décrite ici est que comme la lentille GRIN n’est pas insérée dans le parenchyme cérébral, seuls les neurones relativement superficiels (~ 150-200 μm) peuvent être examinés. Bien que l’implantation chirurgicale du cristallin GRIN soit techniquement possible, la méthode de chirurgie aiguë ne laisse pas suffisamment de temps aux neurones pour récupérer du stress oxydatif et la présence de sang après l’implantation dégradera probablement la qualité de l’image au-delà de l’acceptable.
Malgré les préoccupations ci-dessus, nous croyons que c’est la première fois qu’une méthode pour l’imagerie in vivo des neurones d’IO est présentée. Il permet d’examiner l’activité spatio-temporelle dans les neurones IO dans le contexte in vivo en présence d’entrées afférentes intactes provenant des systèmes sensoriels ainsi que les signaux des noyaux cérébelleux et de la jonction mésoodencéphalique22,un exploit qui n’a pas été possible jusqu’à présent. Avec cette méthode, la fonction de l’IO peut maintenant être étudiée plus en profondeur avec une combinaison de stimulation sensorielle et optogénétique. Notamment, avec l’évolution de l’imagerie de tension (telle que notre récente méthode d’imagerie de tension dans l’IO 23),nous espérons que la méthode chirurgicale présentée inspirera de nombreux chercheurs à relever le défi d’étudier comment l’IO contribue à la génération de pointes complexes cérébelleux.

L’objectif principal des neurosciences des systèmes est de comprendre comment les modèles d’activité spatio-temporelle des réseaux neuronaux contribuent à la génération du comportement animal. Ainsi, la méthodologie d’imagerie fluorescente utilisant des sondes sensibles au calcium est devenue au cours de la dernière décennie un outil principal pour examiner l’activité du réseau neuronal chez les animaux vivants1,2, car elle permet la visualisation de cette dynamique à travers des échelles spatiales allant des cellules uniques aux circuits à méso-échelle. Ces dernières années, l’approche courante où les circuits neuronaux dans les structures cérébrales superficielles (telles que les cortex cérébraux ou cérébelleux) sont entqués à travers une fenêtre crânienne transparente3 a été complétée par l’utilisation de lentilles à indice de réfraction gradient (GRIN)4 permettant l’examen de la dynamique des réseaux dans les structures cérébrales profondes. Les lentilles GRIN actuellement disponibles permettent d’atteindre des structures de plusieurs millimètres de profondeur, telles que l’amygdale de souris, l’hippocampe et les ganglions de la base5. Cependant, de nombreuses régions d’intérêt telles que divers noyaux dans la médulle ventrale se trouvent significativement plus profondément, les plaçant à l’extrême de la portée du cristallin GRIN.
Ici, nous décrivons comment surmonter cette difficulté en profitant de l’accessibilité relativement facile de la médulle par l’aspect ventral du cerveau. En utilisant des souris adultes où l’olive inférieure (IO), un noyau dans la médulle ventrale, a été transfectée viralement avec un capteur de calcium GCaMP6s, nous décrivons les étapes chirurgicales (modifiées à partir de la méthode décrite à l’origine dans Khosrovani et al. 20076) pour placer une lentille GRIN sur la surface ventrale du cerveau d’une souris anesthésiée. À l’aide d’un microscope miniature, nous démontrons la faisabilité d’enregistrer l’activité neuronale dans de telles régions cérébrales extrêmement ventrales. Bien que la procédure soit nécessairement une chirurgie de non-survie et qu’aucune expérimentation ne puisse être effectuée chez des animaux éveillés, la méthode permet d’examiner la dynamique de réseau intacte dans le contexte de la stimulation sensorielle ou d’une autre voie afférente, offrant des avantages clairs par rapport aux approches ex vivo telles que l’utilisation de préparations de tranches aiguës.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene, USA</td>
			<td>100844-AAV9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable suture with 6 mm half circle needle</td>
			<td>Natume, Japan</td>
			<td>L6-60N2</td>
			<td>hook needle with thread</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorption triangles</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18105-03</td>
			<td>Surgical sponges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>M50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo curved tip needle holder with lock</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12061-01</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>Sanyo, Japan</td>
			<td>HUBY-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate suture tying forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Suture Tying Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson rongeur curved tip</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>16221-14</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam absorbable gelatin sponge</td>
			<td>Pfizer, USA</td>
			<td>0315-08</td>
			<td>Hemostatic gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-Capillary Nanoinjection</td>
			<td>Neurostar, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For virus vector injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps with serrated tip</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11052-10</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Implantation rod</td>
			<td>Inscopix, USA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>It is part of the nVoke2 system. It&#39;s designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo</td>
			<td>Zoetis, UK</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION</td>
			<td>Daiichi Sankyo, Japan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark, USA</td>
			<td></td>
			<td>Cleaning tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Beveler</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900</td>
			<td>Neurostar, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter</td>
			<td>Starr Life Sciences, PA, USA</td>
			<td>MouseOxPlus</td>
			<td>Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system</td>
			<td>Inscopix, USA</td>
			<td>1000-003026</td>
			<td>Miniature microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohaus Compact Scales</td>
			<td>Ohaus, USA</td>
			<td>CS 200</td>
			<td>Scale used to weight animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Otsuka Normal Saline</td>
			<td>Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological-biological temperature controller system</td>
			<td>SuperTech Instruments, Hungary</td>
			<td>TMP-5b</td>
			<td>Thermal pad for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length</td>
			<td>Inscopix, USA</td>
			<td>1050-002214</td>
			<td>Gradient-refractive index (GRIN) lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q114-53-10NP glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>112017</td>
			<td>Customized&#160; quartz glass capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety IV Catheter 20G</td>
			<td>B. Braun, Germany</td>
			<td>4251652-03</td>
			<td>20 gauage catheter used to prepare intubation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand paper</td>
			<td>ESCO, Japan</td>
			<td>EA366MC</td>
			<td>Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Muromachi Kikai, Japan</td>
			<td>10010-00</td>
			<td>Used to cut the tip of quartz glass pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system</td>
			<td>Kent Scientific, USA</td>
			<td>SOMNO</td>
			<td>Provides precise control of isoflurane flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgic XT Plus drill</td>
			<td>NSK</td>
			<td>Y1002774</td>
			<td>For virus vector injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>Terumo, Japan</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 25G</td>
			<td>Top, Japan</td>
			<td>00819</td>
			<td>Used to make blunt and bended needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 26G</td>
			<td>Terumo, Japan</td>
			<td>NN-2613S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrive 2100 Professional Trimmer</td>
			<td>Thrive, Japan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Shaver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-T&#252;bingen spring scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Hayashi Pure Chemical, Japan</td>
			<td>22000255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet sensitive skin</td>
			<td>Veet, Canada</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Hair removal cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine Jelly 2 % 30ml</td>
			<td>Aspen Japan,&#160; Japan</td>
			<td>871214</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging in mouse inferior olive

L’olive inférieure (IO), un noyau dans la médulle ventrale, est la seule source de fibres grimpantes qui forment l’une des deux voies d’entrée entrant dans le cervelet. IO a longtemps été proposé pour être crucial pour le contrôle de moteur et son activité est actuellement considérée au centre de nombreuses hypothèses de moteur et de fonctions cognitives du cervelet. Bien que sa physiologie et sa fonction aient été relativement bien étudiées in vitro auniveau unicellulaire, il n’y a actuellement aucun rapport sur l’organisation de l’activité du réseau IO chez les animaux vivants. Ceci est en grande partie dû à l’emplacement anatomique extrêmement difficile de l’IO, le rendant difficile à soumettre aux méthodes fluorescentes conventionnelles d’imagerie, où un chemin optique doit être créé à travers tout le cerveau situé dorsalement à la région d’intérêt.
Nous décrivons ici une méthode alternative pour obtenir des données d’imagerie calcique de pointe à partir du réseau IO. La méthode tire parti de l’emplacement ventral extrême de l’IO et implique une procédure chirurgicale pour insérer une lentille gradient-réfractive index (GRIN) à travers les viscères de cou pour entrer en contact avec la surface ventrale du capteur de calcium GCaMP6s-exprimant IO chez les souris anesthésiées. Un enregistrement représentatif de formation image de calcium est montré pour démontrer la faisabilité d’enregistrer l’activité de neurone IO après la chirurgie. Bien qu’il s’agisse d’une chirurgie de non-survie et que les enregistrements doivent être effectués sous anesthésie, elle évite les dommages aux noyaux critiques pour la vie du tronc cérébral et permet de mener une grande variété d’expériences étudiant les modèles d’activité spatio-temporelle et l’intégration d’entrée dans l’OI. Ce procédé avec des modifications a pu être employé pour des enregistrements dans d’autres, régions adjacentes du tronc cérébral ventral.

Nous présentons ici un enregistrement représentatif obtenu avec le procédé décrit. La figure 6a montre l’emplacement des cellules d’E/S clairement étiquetées visualisées au cours de l’expérience. Les bandes diagonales sombres sont des vaisseaux sanguins. Notez la luminosité variable des cellules individuelles, résultant de l’efficacité variable de la transfection. Dans le panneau figure 6b, nous montrons les traces d’intensité de fluorescence normalisées moyennes (deltaF/F) obtenues à partir de la somata indiquée par des couleurs et des nombres dans le panneau a. Les déviations vers le haut représentent des augmentations transitoires du calcium intracellulaire. Notez comment différents niveaux d’expression GCaMP6s (reflétés dans la luminosité de la cellule dans le panneau a) conduisent à des rapports signal/bruit (SNR) variables.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62222/62222fig06.jpg"> Figure 6: Exemple d’enregistrement de l’activité des neurones IO chez une souris anesthésiée. (a) Exemple représentatif de trame à partir d’un enregistrement après filtrage spatial. Les points lumineux sont la somata neuronale IO, dont plusieurs ont été indiquées comme des régions d’intérêt (ROIs, nombres colorés). Les rayures sombres sont des vaisseaux sanguins. b)Exemple de traces deltaF/F obtenues à partir des ROIs indiqués dans le panneau a. Les déviations vers le haut reflètent l’augmentation du signal de calcium. Barre d’échelle dans a=10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62222/62222fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Nous présentons un protocole pour exposer le tronc cérébral de la souris adulte du côté ventral. En utilisant une lentille à indice de réfraction gradient avec un microscope miniature, l’imagerie au calcium peut être utilisée pour examiner l’activité de la somata neuronale olive inférieure in vivo.

In vivo Imagerie du calcium chez la souris Olive inférieure

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

L’olive inférieure est la partie la plus ventrale de la médulle et est donc extrêmement difficile à atteindre chez un animal vivant. Ici, nous introduisons un protocole pour exposer le tronc cérébral de la souris adulte de la face ventrale et utilisons des lentilles GRIN pour enregistrer l’activité neuronale dans les neurones olive inférieurs exprimant des capteurs de calcium. Cette méthode évite les dommages au tronc cérébral critique pour la vie et permet d’enquêter sur les modèles d’activité spatio-temporelle et l’intégration des entrées dans l’olive inférieure.Étant donné que l’opération est effectuée dans la région complexe de la gorge avec de nombreuses structures vitales, il est essentiel qu’elle soit menée par un chercheur ayant des compétences chirurgicales de haut niveau. Préparez un tube d’intubation en coupant une fente de 5 à 6 millimètres de long et de 0,8 millimètre de large à partir de l’extrémité d’un cathéter de calibre 20. Préparez une aiguille émoussée et incurvée en coupant la pointe, poncer la surface de fracture et pliez-la avec le plier.Ceci sera utilisé pour soutenir une trachée pendant la trachéotomie. Diluer 15 milligrammes par millilitre de kétamine avec une solution saline à 15%Assembler des outils de chirurgie et des consommables. Réglez le coussin chauffant à 38 degrés Celsius.Tournez le nosecone de 180 degrés horizontalement dans un cadre stéréotaxique. Peser la souris dont l’olive inférieure a été précédemment transfectée par des GCaMP6 porteurs du virus et calculer la quantité de kétamine diluée à injecter. Préremouchez la boîte d’induction avec 5% d’isoflurane et anesthésiez la souris.Montez la souris dans le cadre stéréotaxique, côté ventral vers le haut. Rasez la gorge et la cuisse de la souris. Retirez les cheveux résiduels avec une crème d’épilation.Appliquer par voie topique de la gelée de xylocaine sur la peau de gorge. Surveillez la température de la souris à l’avec un capteur thermique rectal. Injecter un millilitre de solution saline préchauffée par voie intrapéritonéale.Évaluer la profondeur de l’anesthésie par une forte pincement sur les orteils postérieurs. Aucune réponse détectable ne doit être évoquée. Faire une incision verticale dans la peau de la gorge le long de la ligne médiane.Séparez la peau du cou des viscères en dessous en utilisant la méthode de dissection émoussée et coupez la peau. Libérez les glandes salivaires du tissu conjonctif, et retournez-les latéralement pour exposer la trachée muscle-couverte sternothyroïde. Injecter par voie intrapéritonéale la première dose de kétamine diluée à cinq millilitres par kilogramme de poids animal.Divisez soigneusement le muscle sternothyroïde le long de la ligne médiane avec le bout d’une pince fine pour exposer la trachée. Détachez la trachée des vaisseaux sanguins et de l’oesophage avec des pinces utilisant la méthode émoussée de dissection. Injecter une deuxième dose de kétamine diluée à 2,5 millilitres par kilogramme de poids animal.Insérez en croix une aiguille émoussée sous la trachée. Soulevez la trachée avec l’aiguille émoussée. Faites en sorte que le fil de suture fasse le tour du troisième anneau de trachée, caudale de la glande thyroïde, avec une aiguille en demi-cercle.Faites quatre liens d’instruments sur cet anneau. Percez la peau de la poitrine avec la même aiguille en demi-cercle et conduisez le fil à travers la peau. Soulevez doucement la trachée avec le fil et coupez la trachée caudale à la glande thyroïde.Tirez la trachée vers la peau de la poitrine. Soulevez l’ouverture de la trachée en ajoutant un petit morceau d’éponge chirurgicale en dessous. Enlevez tout liquide restant à l’intérieur de l’extrémité d’ouverture de la trachée à l’avec une fine bande de tissu nettoyant.Basculer le flux d’isoflurane du nosecone stéréotaxique au tube d’intubation. Insérez le tube d’intubation dans la trachée. Assurez-vous qu’une partie de la fente dans le tube reste à l’extérieur de la trachée pour permettre la respiration.Fixez la trachée à la peau de poitrine de la souris en faisant trois à quatre liens d’instrument. Attachez la trachée avec le fil de suture pour fixer le tube d’intubation. Trancher le muscle sternothyroïdienne le long des fibres musculaires avec la pince fine.Coupez la partie isolée avec les ciseaux à ressort. Libérez soigneusement les restes de trachée et de larynx du muscle pour minimiser les dommages sur les vaisseaux sanguins dans le muscle. Enlever les restes de trachée et de larynx.Libérez l’œsophage des tissus attachés avec une pince et coupez-le avec des ciseaux à ressort. Enlever le muscle longitudinal recouvrant le tronc cérébral et l’arc ventral de l’atlas. Enlever le muscle recouvrant l’arc ventral de l’atlas et le tubercule antérieur.Couper les arcs ventraux de l’atlas avec le rongeur. Enlever le tubercule antérieur de l’atlas. Retirez le sang et le liquide pour voir le foramen magnum et le tronc cérébral.Dilatez le foramen magnum en enlevant l’os occipital avec le rongeur. Retirez le cartilage, et épluchez soigneusement la couche périostéale du mater de dura avec la pince fine pour avoir une vue claire du tronc cérébral ventral. Serrez le capteur SpO2 sur la cuisse de la souris pour surveiller les signes vitaux tels que la fréquence cardiaque, la saturation en oxygène et la fréquence respiratoire.Montez la lentille GRIN sur la tige d’implantation. Nettoyez soigneusement la lentille avec un tissu nettoyant imbibé d’éthanol à 70%. Fixez la tige d’implantation sur le cadre stéréotaxique et montez le microscope miniature sur la tige d’implantation.Ajouter plusieurs gouttes de solution saline dans la zone du tronc cérébral pour l’immersion de la lentille GRIN. Approchez le tronc cérébral avec l’objectif de GRIN. Les GCaMP6 exprimant des neurones olive inférieurs dans la zone superficielle peuvent être trouvés dans une région en forme de rectangle, environ 0,5 à 1,7 millimètre rostral à l’atlas restant, et environ 2,6 à 1,1 millimètre latéral à la ligne médiane.Allumez la LED bleue d’excitation dans un microscope miniature pour localiser les neurones olive inférieurs transfectés par GCaMP6. Les neurones montrent une intensité de fluorescence de base différente en raison de divers niveaux d’expression de GCaMP6s. Le changement du niveau de calcium de la somata de neurone olive inférieur encerclé dans la vidéo de gauche nous montrera delta F divisé par F traces sur la droite.Bien que la souris soit maintenue au chaud et hydratée, elle sera inévitablement affaiblie par une anesthésie et une chirurgie prolongées. Il est essentiel de garder la durée de la chirurgie courte afin que la condition physique de la souris soit bonne pour l’enregistrement. Un chercheur qualifié peut terminer la chirurgie en 70 minutes.Cette méthode, avec des modifications, peut être employée pour étudier d’autres régions adjacentes du tronc cérébral ventral.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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