Name: in vivo calcium imaging in mouse inferior olive
Uploaded: 2021-06-10T14:30:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive at JoVE.com

Мы благодарим Эндрю Скотта из медиа-центра OIST за помощь в записи и редактировании видео. Кроме того, мы благодарим Хьюго Hoedemaker за его помощь в разработке хирургии разоблачить ствол мозга и д-р Кевин Дорганс за его помощь в рисовании диаграмм для цифр. Кроме того, большое спасибо Сальваторе Лакаве за его закадровый голос, а также всем членам nRIM и домашним животным за постоянную поддержку благополучия в трудные времена COVID-19.

<ol>
	<li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+signals+in+vivo:+A+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology.">Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. , (2011).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kilohertz+two-photon+brain+imaging+in+awake+mice.">Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice.</a> Nature Methods. , (2019).</li><li>Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+the+primary+somatosensory+cortex+using+Thy1-GCaMP6s+transgenic+mice.">Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).</li><li>Lee, H. S., Han, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+In+vivo+Calcium+Imaging+with+a+Head-Mount+Miniaturized+Microscope+in+the+Amygdala+of+Freely+Behaving+Mouse.">Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse.</a> Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).</li><li>Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+the+light+that+we+can+see:+a+new+era+in+miniaturized+microscopy.">All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy.</a> Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).</li><li>Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns.">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li><li>Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).</li><li>Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Manipulation+of+Neuronal+Activity+to+Modulate+Behavior+in+Freely+Moving+Mice.">Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e61023 (2020).</li><li>Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine+alone+and+combined+with+diazepam+or+xylazine+in+laboratory+animals:+A+10+year+experience.">Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience.</a> Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).</li><li>Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+signs+monitoring+during+injectable+andn+inhalant+anesthesia+in+mice.">Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice.</a> Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).</li><li>Vrieler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+and+directionality+of+inferior+olive+neuron+dendrites+revealed+by+detailed+3D+characterization+of+an+extensive+morphological+library.">Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library.</a> Brain Structure and Function. , 1677-1695 (2019).</li><li>Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+nucleus+MdV+mediates+skilled+forelimb+motor+tasks.">Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks.</a> Nature. , (2014).</li><li>Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+neuroanatomical+characterization+of+single+neurons+in+the+mouse+medullary+gigantocellular+reticular+nucleus.">Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li><li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine/Xylazine.">Ketamine/Xylazine.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> eLife. 8, 1-45 (2019).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIN1PIPE:+A+Miniscope+1-Photon-Based+Calcium+Imaging+Signal+Extraction+Pipeline.">MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline.</a> Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).</li><li>. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy">https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy</a> (2020)</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+accurate+extraction+of+in+vivo+calcium+signals+from+microendoscopic+video+data.">Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data.</a> eLife. 7, 1-37 (2018).</li><li>. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/zhoupc/CNMF_E">https://github.com/zhoupc/CNMF_E</a> (2020)</li><li>De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferior+olive:+All+ins+and+outs.">Inferior olive: All ins and outs.</a> Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).</li><li>Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Subthreshold+Voltage+Oscillation+With+Cellular+Resolution+in+the+Inferior+Olive+in+vitro.">Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Поскольку хирургическая процедура включает в себя операции, выполняемые в области горла с многочисленными жизненно важными структурами (артериями, нервами), важно, чтобы она проводилась исследователем с высоким уровнем хирургических навыков. Далее мы выделяем и комментируем несколько ключевых моментов процедуры; однако, следует напомнить, что никакое количество письменных советов не может вытеснить опыт, мастерство и интуицию исследователя.
Наиболее важным шагом в хирургии является трахеотомия. Она включает в себя резки трахеи, переключение изофлюрана из конуса носа в инубации трубки, обеспечение трахеи к коже грудной клетки и связывания трахеи и инубации трубки вместе. Все эти операции должны быть завершены в гладкой и быстрой манере, чтобы избежать несчастных случаев, таких как неадекватная анестезия, приток жидкости в трахею или инуляции трубки соскальзывания. Нужно иметь протокол ясно в виду, прежде чем резки трахеи.
Кровоизлияние является одной из основных причин смерти животных в этой операции. Так как область шеи плотная с кровеносными сосудами, разрез должен быть выполнен только тогда, когда линия видимости ясна, чтобы избежать резки невидимых вен и артерий. Таким образом, мышцы и соединительные ткани, заслоняющие зрение, должны быть удалены, а кровь из сломанных капилляров должна быть очищена перед продвижением.
С начала операции животное может прожить в живых длительное время (более 8 часов). Тем не менее, важно закончить хирургическую процедуру быстро, так что больше времени для изучения нейронов ствола мозга, когда физиологическое состояние животных хорошее. Квалифицированный исследователь может закончить всю процедуру за 70 минут.
Хотя метод обеспечивает чистый вид поверхностей брюшного мозга, это, к сожалению, невозможно сделать это без выполнения трахеотомии, а также удаление значительного количества тканей в области горла. Поэтому животному нельзя позволить проснуться от наркоза. Кроме того, несмотря на то, что животное можно поддерживать в живых в течение многих часов при тщательной корректировке анестезии, поддержании температуры тела и гидратации, неизбежно, что длительные эксперименты в конечном итоге приведет к ослаблению состояния животного. Это оставлено на экспертизу исследователя, чтобы рассмотреть максимальную продолжительность стабильных записей.
Еще одно потенциальное ограничение метода, описанное здесь, заключается в том, что, поскольку объектив GRIN не вставляется в паренхиму мозга, можно изучить только относительно поверхностные нейроны (150-200 мкм). В то время как хирургическая имплантация объектива GRIN технически возможна, метод острой хирургии не позволяет достаточно времени для нейронов, чтобы оправиться от окислительного стресса и наличие крови после имплантации, вероятно, ухудшит качество изображения за пределами приемлемого.
Несмотря на вышеуказанные опасения, мы считаем, что это первый раз, когда метод для виво изображения нейронов IO представлен. Это позволяет изутовить spatiotemporal деятельности в нейронах IO в контексте in vivo в присутствии нетронутых афферентных входов от сенсорных систем, а также сигналов от мозжечковых ядер и мезодиенцефалическогосоединения 22, подвиг, который не был возможен до сих пор. С помощью этого метода, функция IO теперь может быть исследована в большей глубине с сочетанием сенсорной и оптогенетической стимуляции. Примечательно, что с эволюцией визуализации напряжения (например, наш недавний метод визуализации напряжения в IO 23), мы надеемся, что представленный хирургический метод будет вдохновлять многочисленных исследователей взять на себя задачу изучения того, как IO способствует генерации мозжечковых сложных шипов.

Основная цель системной нейронауки – понять, как патиотемпоральные модели активности нейронных сетей способствуют генерации поведения животных. Таким образом, флуоресцентная методология визуализации с использованием чувствительных к кальцию зондов в последнее десятилетие стала основным инструментом для изучения активности нейроннойсети у живых животных 1,2 , так как позволяет визуализироватьтакуюдинамику в пространственных масштабах от одиночных клеток до мезомасштабных схем. В последние годы общий подход, при котором нейронные цепи в поверхностных структурах мозга (таких как мозговые или мозжечковые кортисы)изобрагются через прозрачное черепное окно 3, дополняется использованием градиентно-рефракционных линз (GRIN)4, позволяющих изучать динамику сети в глубоких структурах мозга. В настоящее время доступные линзы GRIN позволяют достичь в структуры несколько миллиметров глубиной, такие как мышеловка миндалина, гиппокамп и базальныеганглии 5. Тем не менее, многие области интереса, такие как различные ядра в брюшной медулле лежат значительно глубже, помещая их в крайности досягаемости объектива GRIN.
Здесь мы описываем, как преодолеть эту трудность, воспользовавшись относительно легкой доступностью медуллы через брюшной аспект мозга. Используя взрослых мышей, где нижняя оливка (IO), ядро в брюшной медулле, была вирусно трансфицирована с датчиком кальция GCaMP6s, мы описываем хирургические шаги (измененные из метода, описанного первоначально в Khosrovani и др. 20076), чтобы поместить объектив GRIN на брюшной поверхности мозга обезболивающей мыши. Используя миниатюрный микроскоп, мы демонстрируем целесообразность записи нейронной активности в таких чрезвычайно вентраловых областях мозга. Хотя процедура обязательно не выживаемость хирургии и никаких экспериментов может быть выполнена в бодрствующим животным, метод позволяет изучение нетронутой динамики сети в контексте сенсорной или другой афферентной стимуляции пути, обеспечивая явные преимущества по сравнению с ex vivo-подходов, таких как использование острых препаратов ломтик.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene, USA</td>
			<td>100844-AAV9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable suture with 6 mm half circle needle</td>
			<td>Natume, Japan</td>
			<td>L6-60N2</td>
			<td>hook needle with thread</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorption triangles</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18105-03</td>
			<td>Surgical sponges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>M50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo curved tip needle holder with lock</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12061-01</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>Sanyo, Japan</td>
			<td>HUBY-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate suture tying forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Suture Tying Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson rongeur curved tip</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>16221-14</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam absorbable gelatin sponge</td>
			<td>Pfizer, USA</td>
			<td>0315-08</td>
			<td>Hemostatic gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-Capillary Nanoinjection</td>
			<td>Neurostar, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For virus vector injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps with serrated tip</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11052-10</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Implantation rod</td>
			<td>Inscopix, USA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>It is part of the nVoke2 system. It&#39;s designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo</td>
			<td>Zoetis, UK</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION</td>
			<td>Daiichi Sankyo, Japan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark, USA</td>
			<td></td>
			<td>Cleaning tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Beveler</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900</td>
			<td>Neurostar, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter</td>
			<td>Starr Life Sciences, PA, USA</td>
			<td>MouseOxPlus</td>
			<td>Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system</td>
			<td>Inscopix, USA</td>
			<td>1000-003026</td>
			<td>Miniature microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohaus Compact Scales</td>
			<td>Ohaus, USA</td>
			<td>CS 200</td>
			<td>Scale used to weight animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Otsuka Normal Saline</td>
			<td>Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological-biological temperature controller system</td>
			<td>SuperTech Instruments, Hungary</td>
			<td>TMP-5b</td>
			<td>Thermal pad for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length</td>
			<td>Inscopix, USA</td>
			<td>1050-002214</td>
			<td>Gradient-refractive index (GRIN) lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q114-53-10NP glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>112017</td>
			<td>Customized&#160; quartz glass capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety IV Catheter 20G</td>
			<td>B. Braun, Germany</td>
			<td>4251652-03</td>
			<td>20 gauage catheter used to prepare intubation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand paper</td>
			<td>ESCO, Japan</td>
			<td>EA366MC</td>
			<td>Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Muromachi Kikai, Japan</td>
			<td>10010-00</td>
			<td>Used to cut the tip of quartz glass pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system</td>
			<td>Kent Scientific, USA</td>
			<td>SOMNO</td>
			<td>Provides precise control of isoflurane flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgic XT Plus drill</td>
			<td>NSK</td>
			<td>Y1002774</td>
			<td>For virus vector injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>Terumo, Japan</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 25G</td>
			<td>Top, Japan</td>
			<td>00819</td>
			<td>Used to make blunt and bended needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 26G</td>
			<td>Terumo, Japan</td>
			<td>NN-2613S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrive 2100 Professional Trimmer</td>
			<td>Thrive, Japan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Shaver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-T&#252;bingen spring scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Hayashi Pure Chemical, Japan</td>
			<td>22000255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet sensitive skin</td>
			<td>Veet, Canada</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Hair removal cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine Jelly 2 % 30ml</td>
			<td>Aspen Japan,&#160; Japan</td>
			<td>871214</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging in mouse inferior olive

Нижняя оливка (IO), ядро в брюшной медулле, является единственным источником альпинистских волокон, которые образуют один из двух входных путей, входящих в мозжечок. IO уже давно предлагается иметь решающее значение для управления двигателем и его деятельность в настоящее время считается в центре многих гипотез как двигательных, так и когнитивных функций мозжечка. Хотя его физиология и функция были относительно хорошо изучены на одноклеточном уровне in vitro,в настоящее время нет никаких сообщений об организации сетевой активности IO у живых животных. Это в значительной степени связано с чрезвычайно сложным анатомическим расположением IO, что затрудняет подвержение обычным флуоресцентным методам визуализации, где оптический путь должен быть создан через весь мозг, расположенный dorsally в область интереса.
Здесь мы описываем альтернативный метод получения самых новых данных визуализации кальция на уровне IO. Метод использует экстремальное брюшное расположение IO и включает в себя хирургическую процедуру для вставки градиентно-рефракционного индекса (GRIN) объектив через шею внутренности вступают в контакт с вентальной поверхности датчика кальция GCaMP6s-выражая ИО у анестезированной мышей. Показано, что репрезентативная запись изображений кальция демонстрирует возможность записи активности нейронов IO после операции. Хотя это не выживаемость хирургии и записи должны быть проведены под наркозом, он позволяет избежать повреждения жизненно важных ядер ствола мозга и позволяет проводить большое разнообразие экспериментов, исследуя spatiotemporal модели активности и входной интеграции в IO. Эта процедура с модификациями может быть использована для записи в других, смежных областях брюшного ствола мозга.

Здесь мы представляем репрезентативную запись, полученную методом, как описано. На рисунке 6a показано расположение ярко помеченных клеток IO, визуализированых в ходе эксперимента. Темные диагональные полосы кровеносных сосудов. Обратите внимание на переменную яркость отдельных клеток, в результате переменной эффективности трансфекции. На панели Рисунок 6b мы показываем средние нормализованные интенсивности флуоресценции (deltaF/F) следы, полученные из сомата указано с цветами и числами в панели. Отклонения вверх представляют собой переходное увеличение внутриклеточного кальция. Обратите внимание, как различное выражение GCaMP6s (отраженное в яркости ячейки в панели a) приводит к переменным соотношениям сигнала к шуму (SNR).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62222/62222fig06.jpg"> Рисунок 6: Пример записи активности нейронов IO в анестезированных мыши. ( ) Представитель пример кадра из записи после пространственной фильтрации. Яркими пятнами являются IO нейрональной сомата, некоторые из которых были указаны как регионы интересов (ROIs, цветные числа). Темные полосы кровеносных сосудов. b) Примерследов deltaF/F, полученных из ROIs, указанных в панели a. Отклонения вверх отражают увеличение сигнала кальция. Масштабная планка в a'10 м. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62222/62222fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive at JoVE.com

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Мы представляем протокол, чтобы разоблачить ствол мозга взрослой мыши с брюшной стороны. С помощью градиентно-рефракционного индексного объектива с миниатюрным микроскопом, кальций изображения могут быть использованы для изучения активности нижней оливковой нервной сомата in vivo.

In vivo Кальций Изображения в мыши Нижняя Оливковая

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Нижняя оливка является наиболее брюшной частью медуллы, и, таким образом, чрезвычайно трудно достичь в живом животном. Здесь мы вводим протокол, чтобы разоблачить мозг взрослой мыши стволовых от брюшной стороны, и использовать линзы GRIN для записи нейронной активности в нижних оливковых нейронов, выражаюющих датчики кальция. Этот метод позволяет избежать повреждения критически важного для жизни ствола мозга, а также позволяет проводить исследования пространственно-временных моделей активности и входной интеграции в нижняя оливка.Так как операция проводится в сложной области горла со многими жизненно важными структурами, важно, чтобы она проводится исследователем с высоким уровнем хирургических навыков. Подготовьте иноатную трубку, разрезая прорезь длиной от 5 до 6 миллиметров и шириной 0,8 миллиметра с кончика 20-го калибровного катетера. Подготовь тупую и изогнутую иглу, отрезав кончик, отшлифовав поверхность перелома и согните ее плоскогубцами.Это будет использоваться для поддержки трахеи во время трахеотомии. Разбавить 15 миллиграмм на миллилитр кетамина с солевым раствором до 15%Собрать хирургические инструменты и расходные материалов. Установите грелку до 38 градусов по Цельсию.Поверните nosecone 180 градусов горизонтально в стереотаксисной раме. Взвесьте мышь, чья нижняя оливка ранее была трансфицирована вирусосущей GCaMP6s, и рассчитать количество разбавленного кетамина для инъекций. Предварительно заполнить индукционный ящик с 5%isoflurane, и анестезировать мышь.Намонтайте мышь в стереотаксисной раме, вентраль стороной вверх. Бритье мыши горла и бедра области. Удалите остаточные волосы кремом для удаления волос.Местно нанесите ксилокаин желе на кожу горла. Мониторинг температуры мыши с помощью ректального теплового датчика. Ввимите один миллилитр предварительно разогретый солевой интраперитонически.Оцените глубину анестезии сильным щепоткой на задних лапах. Не следует вызывать никаких обнаруживаемых ответов. Сделайте вертикальный разрез в коже горла вдоль средней линии.Отделить кожу шеи от внутренностей под ним с помощью метода тупого вскрытия и отрезать кожу. Бесплатные слюнные железы из соединительной ткани, и перевернуть их сбоек, чтобы разоблачить стернотиреоидных мышц покрытых трахеей. Интраперитонально вводят первую дозу разбавленного кетамина по пять миллилитров на килограмм веса животного.Тщательно разделить стернотиреоид мышцы вдоль средней линии с кончиком тонкой типсов подвергать трахеи. Отсоедините трахею от кровеносных сосудов и пищевода с помощью типсов с помощью метода тупого вскрытия. Ввимите вторую дозу разбавленного кетамина при 2,5 миллилитрах на килограмм веса животного.Поперечно вставьте тупую иглу под трахею. Поднимите трахею тупой иглой. Сделать шов нить идти вокруг третьего кольца трахеи, caudal щитовидной железы, с половиной круга иглы.Сделайте четыре инструментальных галстука на этом кольце. Пирс груди кожи с той же иглой полукруг и привести нить через кожу. Аккуратно поднимите трахею нитью и вырежьте трахею хвостом к щитовидной железе.Потяните трахею к коже груди. Поднимите отверстие трахеи, добавив небольшой кусочек хирургической губки под ним. Удалите оставшуюся жидкость внутри открывающейся кончика трахеи тонкой полоской чистящих тканей.Переключите изофлюранный поток из стереотаксийного носовогоона в инубную трубку. Вставьте инобубную трубку в трахею. Убедитесь, что часть щели в трубке остается за пределами трахеи, чтобы дышать.Исправить трахеи для мыши груди кожи, сделав три-четыре инструмента связей. Свяжите трахею с шовной нитью, чтобы обеспечить иноподабительный трубки. Разрежьте стернотиреоидную мышцу вдоль мышечных волокон с помощью тонких типсов.Отрежьте изолированную часть с ножницами весны. Тщательно освободите остатки трахеи и гортани от мышц, чтобы свести к минимуму повреждение кровеносных сосудов в мышцах. Удалите остатки трахеи и гортани.Освободите пищевод от прикрепленной ткани с типсами и отрежьте его весенними ножницами. Удалите продольную мышцу, покрывающую ствол мозга и вентраловую арку атласа. Удалите мышцы, покрывающие атласную вентрал арку и переднюю клубень.Вырезать вентрал арки атласа с rongeur. Удалите переднюю клубень атласа. Удалите кровь и жидкость для просмотра foramen magnum и ствол мозга.Расширьте foramen magnum путем извлекать затылчной костоно с rongeur. Удалите хрящ, и тщательно очистить периостейный слой dura mater с тонкой тибры, чтобы иметь четкое представление о брюшной ствол мозга. Зажим датчик SpO2 на бедре мыши для мониторинга жизненно важных признаков, таких как частота сердечных сокращений, насыщение кислородом, и частота дыхания.Намонтировать объектив GRIN на имплантативной штанге. Тщательно очистите объектив 70%-ной тканью очистки, пропитанной этанолом. Зафиксировать имплантатный стержень на стереотаксисной раме и установить миниатюрный микроскоп на имплантативный стержень.Добавьте несколько капель солевого раствора в область ствола мозга для погружения в объектив GRIN. Подойди к стволу мозга с помощью объектива GRIN. GCaMP6s, выражающих нижние оливковые нейроны в поверхностной области, можно найти в области прямоугольной формы, от 0,5 до 1,7 миллиметра рострального к оставшемуся атласу, и от 2,6 до 1,1 миллиметра боковой к средней линии.Включите возбуждение синий светодиод в миниатюрном микроскопе, чтобы найти GCaMP6s трансфицированных нижних оливковых нейронов. Нейроны показывают различную базовую интенсивность флуоресценции из-за различных уровней экспрессии GCaMP6s. Изменение уровня кальция кружили нижней оливкового нейрона сомата в видео слева будет показано нам дельта F разделены F следы справа.Хотя мышь хранится теплой и увлажненной, она неизбежно будет ослаблена длительной анестезией и хирургией. Важно, чтобы сохранить продолжительность операции короткий так мыши физическое состояние будет хорошо для записи. Квалифицированный исследователь может закончить операцию за 70 минут.Этот метод, с модификациями, может быть использован для изучения других смежных областей брюшной ствол мозга.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

В естественных нейронных изображений кальция в C. Элеганс

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

В Vivo Функциональное мозга изображений подход, основанный на Биолюминесцентный кальция Индикатор GFP-акворина

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

В естественных условиях кальция изображений боковой линии клетки волос в личиночной данио рерио

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

Успешная визуализация кальция In vivo с миниатюрным микроскопом Head-Mount в миндале свободно ведя себя мышью

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Транспупиллярная двухфотонная визуализация сетчатки мыши In vivo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo Кальциевая визуализация реакции ганглионных нейронов мыши на вкусовые стимулы

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Кальций и гемодинамическая визуализация перицитов головного мозга у трансгенных мышей In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

В естественных условиях Кальциевая визуализация нейронных ансамблей в сетях первичных сенсорных нейронов в интактных ганглиях дорсальных корешков

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...