Name: in vivo calcium imaging in mouse inferior olive
Uploaded: 2021-06-10T14:30:00
Duration: 8 min 58 s
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Agradecemos a Andrew Scott del centro de medios de OIST por su ayuda con la grabación y edición de video. Además, agradecemos a Hugo Hoedemaker por su ayuda con el desarrollo de la cirugía para exponer el tronco encefálico y al Dr. Kevin Dorgans por su ayuda con el dibujo de diagramas para figuras. Además, un gran agradecimiento a Salvatore Lacava por su narración de voz en general, así como a todos los miembros y mascotas de nRIM por su continuo apoyo al bienestar en los tiempos difíciles de COVID-19.

<ol>
	<li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+signals+in+vivo:+A+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology.">Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. , (2011).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kilohertz+two-photon+brain+imaging+in+awake+mice.">Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice.</a> Nature Methods. , (2019).</li><li>Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. 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J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine+alone+and+combined+with+diazepam+or+xylazine+in+laboratory+animals:+A+10+year+experience.">Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience.</a> Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).</li><li>Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+signs+monitoring+during+injectable+andn+inhalant+anesthesia+in+mice.">Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice.</a> Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).</li><li>Vrieler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+and+directionality+of+inferior+olive+neuron+dendrites+revealed+by+detailed+3D+characterization+of+an+extensive+morphological+library.">Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library.</a> Brain Structure and Function. , 1677-1695 (2019).</li><li>Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+nucleus+MdV+mediates+skilled+forelimb+motor+tasks.">Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks.</a> Nature. , (2014).</li><li>Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+neuroanatomical+characterization+of+single+neurons+in+the+mouse+medullary+gigantocellular+reticular+nucleus.">Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li><li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine/Xylazine.">Ketamine/Xylazine.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> eLife. 8, 1-45 (2019).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIN1PIPE:+A+Miniscope+1-Photon-Based+Calcium+Imaging+Signal+Extraction+Pipeline.">MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline.</a> Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).</li><li>. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy">https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy</a> (2020)</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+accurate+extraction+of+in+vivo+calcium+signals+from+microendoscopic+video+data.">Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data.</a> eLife. 7, 1-37 (2018).</li><li>. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/zhoupc/CNMF_E">https://github.com/zhoupc/CNMF_E</a> (2020)</li><li>De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferior+olive:+All+ins+and+outs.">Inferior olive: All ins and outs.</a> Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).</li><li>Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Subthreshold+Voltage+Oscillation+With+Cellular+Resolution+in+the+Inferior+Olive+in+vitro.">Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como el procedimiento quirúrgico implica operaciones realizadas en la región de la garganta con numerosas estructuras vitalmente críticas (arterias, nervios), es esencial que sea realizado por un investigador con habilidades quirúrgicas de alto nivel. A continuación, destacamos y comentamos varios puntos clave del procedimiento; sin embargo, debe recordarse que ninguna cantidad de consejos escritos puede suplantar la experiencia, la habilidad y la intuición del investigador.
El paso más crítico en la cirugía es la traqueotomía. Consiste en cortar la tráquea, cambiar el isoflurano del cono de la nariz al tubo de intubación, asegurar la tráquea a la piel del pecho y unir la tráquea y el tubo de intubación. Todas estas operaciones deben completarse de manera suave y rápida para evitar accidentes, como anestesia inadecuada, entrada de líquido en la tráquea o deslizamiento del tubo de intubación. Uno debe tener el protocolo claro en mente antes de cortar la tráquea.
La hemorragia es una de las principales causas de muerte animal en esta cirugía. Dado que el área del cuello es densa con vasos sanguíneos, el corte solo debe ejecutarse cuando la línea de visión está clara para evitar cortar venas y arterias invisibles. Por lo tanto, los músculos y los tejidos conectivos que oscurecen la visión deben ser removidos, y la sangre de los capilares rotos debe limpiarse antes de avanzar.
El animal se puede mantener con vida durante mucho tiempo (más de 8 horas) desde el inicio de la cirugía. Sin embargo, es importante terminar el procedimiento quirúrgico rápidamente para que haya más tiempo para examinar las neuronas del tronco encefálico cuando la condición fisiológica animal es buena. Un investigador experto puede terminar todo el procedimiento en 70 min.
Si bien el método proporciona una vista limpia de las superficies ventrales del cerebro, desafortunadamente es imposible hacerlo sin realizar una traqueotomía, así como eliminar una cantidad significativa de tejido en la región de la garganta. Por lo tanto, no se puede permitir que el animal se despierte de la anestesia. Además, a pesar de que es posible mantener al animal con vida durante muchas horas con un ajuste cuidadoso de la administración de anestésicos, el mantenimiento de la temperatura corporal y la hidratación, es inevitable que la experimentación prolongada eventualmente conduzca al debilitamiento de la condición animal. Se deja a la experiencia del investigador considerar la duración máxima de las grabaciones estables.
Otra limitación potencial del método como se describe aquí es que como la lente GRIN no se inserta en el parénquima cerebral, sólo las neuronas relativamente superficiales (~ 150-200 μm) pueden ser examinadas. Mientras que la implantación quirúrgica de la lente GRIN es técnicamente posible, el método de cirugía aguda no permite suficiente tiempo para que las neuronas se recuperen del estrés oxidativo y la presencia de sangre después de la implantación probablemente degradará la calidad de la imagen más allá de lo aceptable.
A pesar de las preocupaciones antedichos, creemos que ésta es la primera vez que un método para la proyección de imagen in vivo de las neuronas del IO se presenta. Permite el examen de la actividad espaciotemporal en las neuronas IO en el contexto in vivo en presencia de entradas aferentes intactas de los sistemas sensoriales, así como las señales de los núcleos cerebelosos y la unión mesodiencefálica22,una hazaña que no ha sido posible hasta ahora. Con este método, la función de la IO ahora se puede investigar en mayor profundidad con la combinación de estimulación sensorial y optogenética. En particular, con la evolución de las imágenes de voltaje (como nuestro método reciente para la obtención de imágenes de voltaje en el IO 23),esperamos que el método quirúrgico presentado inspire a numerosos investigadores a asumir el desafío de investigar cómo el IO contribuye a la generación de picos complejos cerebelosos.

El objetivo principal de la neurociencia de sistemas es comprender cómo los patrones de actividad espaciotemporal de las redes neuronales contribuyen a la generación de comportamiento animal. Por lo tanto, la metodología de imágenes fluorescentes que utiliza sondas sensibles al calcio se ha convertido en la última década en una herramienta principal para examinar la actividad de la red neuronal en animales vivos1,2,ya que permite la visualización de dicha dinámica a través de escalas espaciales que van desde células individuales hasta circuitos de mesoescala. En los últimos años, el enfoque común donde los circuitos neuronales en estructuras cerebrales superficiales (como las cortezas cerebrales o cerebelosas) se crean imágenes a través de una ventana craneal transparente3 se ha complementado con el uso de lentes de índice de refracción de gradiente (GRIN)4 que permiten el examen de la dinámica de la red en estructuras cerebrales profundas. Las lentes GRIN actualmente disponibles permiten llegar a estructuras de varios milímetros de profundidad, como la amígdala de ratón, el hipocampo y los gangliosbasales 5. Sin embargo, muchas regiones de interés, como varios núcleos en la médula ventral, se encuentran significativamente más profundos, colocándolos en el extremo del alcance de la lente GRIN.
Aquí, describimos cómo superar esta dificultad aprovechando la accesibilidad relativamente fácil de la médula a través del aspecto ventral del cerebro. Utilizando ratones adultos donde la aceituna inferior (IO), un núcleo en la médula ventral, ha sido transfectada viralmente con un sensor de calcio GCaMP6s, describimos los pasos quirúrgicos (modificados del método descrito originalmente en Khosrovani et al. 20076)para colocar una lente GRIN en la superficie ventral del cerebro de un ratón anestesiado. Usando un microscopio miniatura, demostramos la viabilidad de registrar actividad neuronal en tales regiones extremadamente ventrales del cerebro. Si bien el procedimiento es necesariamente una cirugía de no supervivencia y no se puede realizar experimentación en animales despiertos, el método permite el examen de la dinámica de red intacta en el contexto de la estimulación sensorial u otra vía aferente, proporcionando ventajas claras sobre los enfoques ex vivo, como el uso de preparaciones de rebanadas agudas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene, USA</td>
			<td>100844-AAV9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable suture with 6 mm half circle needle</td>
			<td>Natume, Japan</td>
			<td>L6-60N2</td>
			<td>hook needle with thread</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorption triangles</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18105-03</td>
			<td>Surgical sponges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscopes</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>M50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo curved tip needle holder with lock</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12061-01</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>Sanyo, Japan</td>
			<td>HUBY-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate suture tying forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Suture Tying Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson rongeur curved tip</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>16221-14</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam absorbable gelatin sponge</td>
			<td>Pfizer, USA</td>
			<td>0315-08</td>
			<td>Hemostatic gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-Capillary Nanoinjection</td>
			<td>Neurostar, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>For virus vector injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps with serrated tip</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11052-10</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Implantation rod</td>
			<td>Inscopix, USA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>It is part of the nVoke2 system. It&#39;s designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo</td>
			<td>Zoetis, UK</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION</td>
			<td>Daiichi Sankyo, Japan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark, USA</td>
			<td></td>
			<td>Cleaning tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Beveler</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900</td>
			<td>Neurostar, Germany</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter</td>
			<td>Starr Life Sciences, PA, USA</td>
			<td>MouseOxPlus</td>
			<td>Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system</td>
			<td>Inscopix, USA</td>
			<td>1000-003026</td>
			<td>Miniature microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohaus Compact Scales</td>
			<td>Ohaus, USA</td>
			<td>CS 200</td>
			<td>Scale used to weight animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Otsuka Normal Saline</td>
			<td>Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological-biological temperature controller system</td>
			<td>SuperTech Instruments, Hungary</td>
			<td>TMP-5b</td>
			<td>Thermal pad for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length</td>
			<td>Inscopix, USA</td>
			<td>1050-002214</td>
			<td>Gradient-refractive index (GRIN) lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q114-53-10NP glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>112017</td>
			<td>Customized&#160; quartz glass capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety IV Catheter 20G</td>
			<td>B. Braun, Germany</td>
			<td>4251652-03</td>
			<td>20 gauage catheter used to prepare intubation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand paper</td>
			<td>ESCO, Japan</td>
			<td>EA366MC</td>
			<td>Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Muromachi Kikai, Japan</td>
			<td>10010-00</td>
			<td>Used to cut the tip of quartz glass pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system</td>
			<td>Kent Scientific, USA</td>
			<td>SOMNO</td>
			<td>Provides precise control of isoflurane flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgic XT Plus drill</td>
			<td>NSK</td>
			<td>Y1002774</td>
			<td>For virus vector injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>Terumo, Japan</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 25G</td>
			<td>Top, Japan</td>
			<td>00819</td>
			<td>Used to make blunt and bended needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 26G</td>
			<td>Terumo, Japan</td>
			<td>NN-2613S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrive 2100 Professional Trimmer</td>
			<td>Thrive, Japan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Shaver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-T&#252;bingen spring scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Surgery tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Hayashi Pure Chemical, Japan</td>
			<td>22000255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet sensitive skin</td>
			<td>Veet, Canada</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Hair removal cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine Jelly 2 % 30ml</td>
			<td>Aspen Japan,&#160; Japan</td>
			<td>871214</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging in mouse inferior olive

La aceituna inferior (IO), un núcleo en la médula ventral, es la única fuente de fibras trepadoras que forman una de las dos vías de entrada que entran en el cerebelo. Io se ha propuesto de largo para ser crucial para el control del motor y su actividad se considera actualmente estar en el centro de muchas hipótesis del motor y de las funciones cognoscitivas del cerebelo. Mientras que su fisiología y función han sido relativamente bien estudiadas a nivel unicelular in vitro, actualmenteno hay informes sobre la organización de la actividad de la red IO en animales vivos. Esto es en gran parte debido a la localización anatómica extremadamente desafiadora del IO, haciéndolo difícil sujetar a los métodos fluorescentes convencionales de la proyección de imagen, donde una trayectoria óptica se debe crear a través del cerebro entero situado dorsal a la región de interés.
Aquí describimos un método alternativo para obtener el estado de la técnica - datos de la proyección de imagen del calcio del nivel de la red io. El método se aprovecha de la ubicación ventral extrema de la IO e implica un procedimiento quirúrgico para insertar una lente de índice de refracción de gradiente (GRIN) a través de las vísceras del cuello para entrar en contacto con la superficie ventral del sensor de calcio GCaMP6s que expresa IO en ratones anestesiados. Una grabación representativa de la proyección de imagen del calcio se demuestra para demostrar la viabilidad de registrar actividad de la neurona io después de la cirugía. Si bien se trata de una cirugía de no supervivencia y las grabaciones deben llevarse a cabo bajo anestesia, evita el daño a los núcleos del tronco encefálico críticos para la vida y permite la realización de una gran variedad de experimentos que investigan los patrones de actividad espaciotemporal y la integración de entrada en el IO. Este procedimiento con modificaciones se podía utilizar para las grabaciones en otras, regiones adyacentes del médula oblonga ventral.

Aquí presentamos una grabación representativa obtenida con el método según lo descrito. La Figura 6a muestra la ubicación de las celdas de E/S brillantemente etiquetadas visualizadas durante el experimento. Las rayas diagonales oscuras son vasos sanguíneos. Tenga en cuenta el brillo variable de las células individuales, resultante de la eficacia de transfección variable. En el panel figura 6b mostramos las trazas de intensidad de fluorescencia normalizada media (deltaF/F) obtenidas de la somata indicada con colores y números en el panel a. Las deflexiones ascendentes representan aumentos transitorios en calcio intracelular. Observe cómo el diferente nivel de expresión de GCaMP6s (reflejado en el brillo de la celda en el panel a) conduce a relaciones de señal a ruido (SNR) variables.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62222/62222fig06.jpg"> Figura 6:Ejemplo de registro de la actividad de las neuronas IO en ratón anestesiado. ( a ) Ejemplo representativo de una grabación después del filtrado espacial. Los puntos brillantes son los somata neuronales IO, varios de los cuales se han indicado como regiones de interés (ROIs, números coloreados). Las rayas oscuras son vasos sanguíneos. b) Ejemplo de trazas deltaF/F obtenidas de las IDI indicadas en el panel a. Las deflexiones hacia arriba reflejan aumentos en la señal de calcio. Barra de escala en a=10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62222/62222fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Presentamos un protocolo para exponer el médula oblonga del ratón adulto del lado ventral. Mediante el uso de una lente de índice de refracción de gradiente con un microscopio en miniatura, las imágenes de calcio se pueden utilizar para examinar la actividad de los somatas neuronales oliva inferiores in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

La aceituna inferior es la parte más ventral de la médula, y por lo tanto es extremadamente difícil de alcanzar en un animal vivo. Aquí, presentamos un protocolo para exponer el tronco cerebral del ratón adulto desde el lado ventral, y usamos lentes GRIN para registrar la actividad neuronal en las neuronas de olivo inferiores que expresan sensores de calcio. Este método evita daños en el tronco encefálico crítico para la vida y permite investigaciones sobre patrones de actividad espacial-temporales e integración de entrada en la aceituna inferior.Dado que la operación se realiza en la región compleja de la garganta con muchas estructuras vitales, es esencial que sea realizada por un investigador con habilidades quirúrgicas de alto nivel. Prepare un tubo de intubación cortando una hendidura de 5 a 6 milímetros de largo y 0,8 milímetros de ancho de la punta de un catéter de calibre 20. Prepare una aguja roma y curva cortando la punta, lije la superficie de fractura y dóblala con el alicate.Esto se utilizará para apoyar una tráquea durante la traqueotomía. Diluir 15 miligramos por mililitro de ketamina con solución salina al 15% Montar herramientas de cirugía y consumibles. Establezca la almohadilla de calefacción a 38 grados Celsius.Gire la nosecone 180 grados horizontalmente en el marco estereotáxico. Pesar el ratón cuya aceituna inferior fue previamente transfectada por GCaMP6s portadores de virus, y calcular la cantidad de ketamina diluida para inyección. Prellene la caja de inducción con isoflurano al 5%, y anestesiar el ratón.Monte el ratón en el marco estereotáxico, lado ventral hacia arriba. Afeitarse la garganta del ratón y el área del muslo. Retire el vello residual con crema de depilación.Aplicar tópicamente jalea de xilocaína en la piel de la garganta. Monitoree la temperatura del ratón con un sensor térmico rectal. Inyecte un mililitro solución salina precalentada por vía intraperitoneal.Evaluar la profundidad de la anestesia por un fuerte pellizco en los dedos de los dedos de los dedos de los miembros posteriores. No se debe evocar ninguna respuesta detectable. Haga una incisión vertical en la piel de la garganta a lo largo de la línea media.Separe la piel del cuello de las vísceras debajo de ella usando el método de disección contundente y corte la piel. Libere las glándulas salivales del tejido conectivo, y voltéeelas lateralmente para exponer la tráquea músculo-cubierta esternotiroides. Inyectar por vía intraperitoneal la primera dosis de ketamina diluida a cinco mililitro por kilogramo de peso animal.Divida cuidadosamente el músculo esternotiroideo a lo largo de la línea media con la punta de un pórceps fino para exponer la tráquea. Desprenda la tráquea de los vasos sanguíneos y del esófago con el fórceps usando método embotado de la disección. Inyecte una segunda dosis de ketamina diluida a 2,5 mililitros por kilogramo de peso animal.Inserte de manera transversal una aguja roma debajo de la tráquea. Levante la tráquea con la aguja roma. Haga que el hilo de sutura vaya alrededor del tercer anillo de tráquea, caudal de la glándula tiroides, con una aguja de medio círculo.Haga cuatro lazos del instrumento en este anillo. Perfore la piel del pecho con la misma aguja de semicírculo y conduzca el hilo a través de la piel. Levante suavemente la tráquea con el hilo y corte la tráquea caudal a la glándula tiroides.Tire de la tráquea hacia la piel del pecho. Levante la abertura de la tráquea agregando un pequeño pedazo de esponja quirúrgica debajo de ella. Retire cualquier líquido restante dentro de la punta de apertura de la tráquea con una tira delgada de tejido de limpieza.Cambie el flujo de isoflurano de la nosecona estereotáxica al tubo de intubación. Inserte el tubo de intubación en la tráquea. Asegúrese de que parte de la hendidura en el tubo permanezca fuera de la tráquea para permitir la respiración.Fije la tráquea a la piel del pecho del ratón haciendo tres a cuatro lazos del instrumento. Ate la tráquea con el hilo de sutura para asegurar el tubo de intubación. Corte el músculo esternotiroideo a lo largo de las fibras musculares con las medidas de control del órceps fino.Corte la parte aislada con las tijeras de resorte. Libere cuidadosamente la tráquea y la laringe sobrantes del músculo para minimizar el daño en los vasos sanguíneos en el músculo. Retire la tráquea y la laringe sobrantes.Libere el esófago del tejido unido con fórceps y córtuelo con tijeras de resorte. Retire el músculo longitudinal que cubre el tronco encefálico y el arco ventral del atlas. Retire el músculo que cubre el arco ventral del atlas y el tubérculo anterior.Cortar los arcos ventrales del atlas con el rongeur. Retire el tubérculo anterior del atlas. Extraiga la sangre y el líquido para ver el agujero magno y el tronco encefálico.Expanda el foramen magnum eliminando el hueso occipital con el rongeur. Retire el cartílago y pelar cuidadosamente la capa perióstico de la duramadre con los pórceps finos para tener una visión clara del tronco encefálico ventral. Sujete el sensor spO2 en el muslo del ratón para controlar los signos vitales como la frecuencia cardíaca, la saturación de oxígeno y la frecuencia respiratoria.Monte la lente GRIN en la varilla de implantación. Limpie la lente cuidadosamente con un 70% de tejido de limpieza empapado en etanol. Fije la varilla de implantación en el marco estereotáxico y monte el microscopio en miniatura en la varilla de implantación.Agregue varias gotas de solución salina en el área del tronco encefálico para la inmersión de la lente GRIN. Acércate al tronco encefálico con la lente GRIN. GCaMP6s que expresan neuronas de oliva inferiores en el área superficial se pueden encontrar en una región en forma de rectángulo, alrededor de 0.5 a 1.7 milímetros rostrales al atlas restante, y alrededor de 2.6 a 1.1 milímetros laterales a la línea media.Encienda el LED azul de excitación en el microscopio en miniatura para localizar las neuronas de oliva inferiores transfectadas GCaMP6s. Las neuronas muestran diferente intensidad de fluorescencia basal debido a varios GCaMP6s nivel de expresión. El cambio de nivel de calcio de la somata de la neurona oliva inferior circundada en el video de la izquierda nos mostrará delta F dividido por F trazas a la derecha.Aunque el ratón se mantiene caliente e hidratado, inevitablemente se debilitará por la anestesia prolongada y la cirugía. Es esencial mantener la duración de la cirugía corta para que la condición física del ratón sea buena para la grabación. Un investigador experto puede terminar la cirugía en 70 minutos.Este método, con modificaciones, se puede utilizar para estudiar otras regiones adyacentes del médula oblonga ventral.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Investigación

Neurociencias

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