Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

شكرا لأتول سالوجا، ياتين غوكارن، ماريا تيريزا بيراتشيا، والتر شوينجر، وفيليب زاكاس على توجيهاتهم ومساهماتهم في تطوير الشرطة الوطنية الليبيرية.

يتم توفير تخطيطي للعملية الكلية في الشكل 1.
1. إعداد المخازن المؤقتة
ملاحظة: يتم اقتراح تصفية معقمة من المخازن المؤقتة للغاية هنا لإزالة أي الجسيمات التي قد تؤثر على حمض النوى وجودة LNP.
<ol><li>ملحي الفوسفات المخزنة مؤقتا (PBS)<ol>
<li>إعداد برنامج تلفز...

<ol>
	<li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery.">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li><li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).</li><li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano+based+drug+delivery+systems:+recent+developments+and+future+prospects.">Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects.</a> J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).</li><li>Rai, R., Alwani, S., Badea, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles+in+gene+therapy:+New+avenues+of+design+and+optimization+for+delivery+applications.">Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications.</a> Polymers. 11 (4), 745 (2019).</li><li>Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+polymer+micelles+of+controlled+size,+stability,+and+functionality+for+siRNA+delivery.">Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery.</a> ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li><li>Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer+probing+of+assembly+and+disassembly+of+short+interfering+RNA/Poly(ethylene+glycol)-Poly-L-Lysine+polyion+complex+micelles.">F&#246;rster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles.</a> Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).</li><li>Puri, A., Loomis, K., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+nanoparticles+as+pharmaceutical+drug+carriers:+from+concepts+to+clinic.">Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic.</a> Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).</li><li>Cullis, P. R., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+systems+for+enabling+gene+therapies.">Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies.</a> Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).</li><li>Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+to+the+center+of+the+cell:+Current+Nanocarrier+design+strategies+targeting+biopharmaceuticals+to+the+cytoplasm+an+nucleus.">Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).</li><li>Zhao, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+gene+delivery.">Lipid nanoparticles for gene delivery.</a> Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+in+vivo+potency+of+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).</li><li>Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+delivery+systems+for+siRNA-based+therapeutics.">Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics.</a> Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).</li><li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies:+From+concepts+to+clinical+utility.">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).</li><li>Shin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+development+and+a+potential+nanomaterial+path+forward.">COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward.</a> Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).</li><li>Thanh Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COVID-19+vaccine+development+landscape.">The COVID-19 vaccine development landscape.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).</li><li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery.">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).</li><li>Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+lipid+nanoparticles.">mRNA lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2019).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Suzuki, Y., Ishihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+activity+and+uptake+mechanism+of+siRNA-lipid+nanoparticles+with+an+asymmetric+ionizable+lipid.">Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid.</a> International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+environment+in+endocytic+compartments.">The acidic environment in endocytic compartments.</a> Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).</li><li>Maugeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+endosomal+escape+of+LNP-mRNA+and+loading+into+EVs+for+transport+to+other+cells.">Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li><li>Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Nanoscale. (45), (2019).</li><li>Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+whereby+cationic+lipids+promote+intracellular+delivery+of+polynucleic+acids.">On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids.</a> Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).</li><li>Hafez, I. M., Culis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lipid+polymorphism+in+intracellular+delivery.">Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).</li><li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery.">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).</li><li>Mui, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+polyethylene+glycol+lipid+desorption+rates+on+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+siRNA+lipid+nanoparticles.">Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).</li><li>Zukancic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+poly(Ethylene+glycol)+and+lipid+structure+in+targeted+gene+delivery+to+lymph+nodes+by+lipid+nanoparticles.">The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).</li><li>NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: <a target="_blank" href="https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas">https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas</a> (2020)</li><li>Kastner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+manufacturing+of+size-tuned+liposomes+by+a+new+microfluidics+method+using+enhanced+statistical+tools+for+characterization.">High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).</li><li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing.">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA.">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticles+for+intramuscular+administration+of+mRNA+vaccines.">Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+mRNA+to+colon+inflammatory+lesions+by+lipid-nano-particles+containing+environmentally-sensitive+lipid-like+materials+with+oleic+acid+scaffolds.">The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds.</a> Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).</li><li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+lipid+nanoparticles.">Nucleic acid lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2018).</li></ol>

تعد إمكانية إعادة الإنتاج والسرعة وانخفاض الحجم مزايا كبيرة لاستخدام خلط السائل الدقيق لتشكيل LNPs مقارنة بالطرق الأخرى الموجودة (على سبيل المثال ، ترطيب فيلم الدهون وحقن الإيثانول). لقد أثبتنا قابلية استنساخ هذه الطريقة دون أي تأثير على كفاءة التغليف أو حجم الجسيمات الملاحظ مع دفعات LNP ال?...

وتستخدم شركات نقل الأدوية لحماية وتقديم العلاجية مع خصائص مواتية نموذجية بما في ذلك السمية الخلوية منخفضة, زيادة التوافر البيولوجي, وتحسين الاستقرار1,2,3. وقد تم استكشاف الجسيمات النانوية البوليمرية، micelles، والجسيمات القائمة على الدهون سابقا لتغليف الحمض النووي والتسليم4،5،6،7. وقد استخدمت الدهون في أنواع مختلفة من أنظمة النانوكارير، بما في ذلك الليبوسومات، والجسيمات النانوية الدهنية، لأنها متوافقة بيولوجيا مع استقرار عالية8. LNPs يمكن تغليف بسهولة الأحماض النووية لتسليم الجينات9،10. أنها تحمي حمض النوى من التدهور عن طريق بروتياز المصل خلال الدورة الدموية الجهازية11 ويمكن تحسين التسليم إلى مواقع محددة، كما التضاريس السطحية والخصائص الفيزيائية للNPs تؤثر على التوزيع الحيوي12. LNPs أيضا تحسين اختراق الأنسجة وامتصاصالخلوية 9. وقد أظهرت الدراسات السابقة نجاح تغليف سيرنا داخل LNP13، بما في ذلك أول علاج LNP متاح تجاريا يحتوي على علاج siRNA لعلاج اعتلال الأعصاب من الداء النشواني الوراثي بوساطة transthyretin14 العلاج الذي وافقت عليه إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) ووكالة الأدوية الأوروبية في عام 2018. في الآونة الأخيرة ، ويجري دراسة LNPs لتسليم أكبر moieties حمض النوى ، وهي ميرنا والحمض النووي9. اعتبارا من عام 2018 ، كان هناك ~ 22 نظاما لتوصيل الحمض النووي القائم على الدهون تخضع لتجارب سريرية14. بالإضافة إلى ذلك، ميرنا التي تحتوي على LNPs هي حاليا المرشحين الرئيسيين، وقد استخدمت للقاح COVID-1915،16. النجاح المحتمل لهذه العلاجات الجينية غير الفيروسية يتطلب تشكيل جزيئات صغيرة (~ 100 نانومتر) ومستقرة وموحدة مع تغليف عالية من الحمض النووي.
وقد أظهرت استخدام الدهون المؤينة كعنصر رئيسي في صياغة الشرطة الوطنية الليبيرية مزايا للتعقيد والتغليف والتسليم effciciency14. الدهون المؤينة وعادة ما يكون ثابت فصيل حمض (pKa) < 7; على سبيل المثال، ديلينوليمثيل-4-ديميثيلامينوبوتيرات (د-لين-MC3-DMA)، والدهون المؤينة المستخدمة في صياغة LNP وافقت ادارة الاغذية والعقاقير، لديه pKa من 6.4417. في انخفاض الرقم الهيدروجيني ، تصبح مجموعات الأمين على الدهون المؤينة بروتونات ومحملة بشكل إيجابي ، مما يسمح للتجميع مع مجموعات فوسفات مشحونة سلبا على الحمض النووي الريبي والحمض النووي. وتستخدم نسبة أمين ، "ن" ، والمجموعات إلى الفوسفات ، "ف" ، مجموعات لتحسين التجميع. تعتمد نسبة N/P على الدهون والأحماض النووية المستخدمة ، والتي تختلف وفقا للصياغة18. بعد التشكيل ، يمكن تعديل درجة الحموضة إلى درجة الحموضة المحايدة أو الفسيولوجية للسماح بالإدارة العلاجية. في هذه القيم درجة الحموضة، يتم أيضا إزالة الدهون المؤينة التي تضفي شحنة سطح محايدة إلى الشرطة الوطنية الليبيرية.
الدهون المؤينة يساعد أيضا في الهروب endosomal19،20. LNPs الخضوع لداء الغدد الصماء أثناء امتصاص الخلوية ويجب أن يطلق سراحه من الاندوسوم من أجل تسليم البضائع مرنا في سيتوبلازم الخلية أو الحمض النووي البضائع إلى النواة21. داخل الانسوم هو عادة بيئة أكثر حمضية من الوسط خارج الخلية، مما يجعل الدهون المؤينة مشحونة إيجابيا22،23. يمكن أن تتفاعل الدهون المؤينة المشحونة إيجابيا مع الشحنات السلبية على غشاء الدهون الاندوسومالي ، والتي يمكن أن تسبب زعزعة استقرار الإنسوم مما يسمح بإطلاق LNP وحمض النيوكليك. ويجري حاليا دراسة مختلف الدهون المؤينة لتحسين فعالية كل من توزيع LNP، فضلا عن الهروب endosomal14.
وتشمل المكونات النموذجية الأخرى للشرطة الوطنية الليبيرية الدهون المساعد، مثل فوسفاتيديلكولين (PC) أو فوسفوثانامين (PE) الدهون. 1،2-ديوليويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوثانولامين (DOPE)، 1،2-distearoyl-sn-glycero-3-فوسفوخ السولين (DSPC)، و 1،2-ديوليويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوتشولين (DOPC) هي شائعة الاستخدام الدهون المساعد24،25. وقد ثبت DOPE لتشكيل المرحلة السداسية الثاني المقلوب (HII) وتعزيز العدوى عن طريق الانصهار الغشاء26, في حين كان يعتقد DSPC لتحقيق الاستقرار LNPs مع هندستها أسطواني27. كما يتم دمج الكوليسترول في صياغة من أجل زيادة صلابة الغشاء، مما يساعد في وقت لاحق في استقرار الشرطة الوطنية الليبيرية. وأخيرا، يتم تضمين الجليكولات البولي إيثيلين المترافقة مع الدهون (PEG) في صياغة لتوفير حاجز الستيريك اللازم للمساعدة في التجميع الذاتي للجسيمات27. كما يحسن PEG استقرار التخزين LNPs عن طريق منع التجميع. وعلاوة على ذلك، يستخدم PEG في كثير من الأحيان كعنصر الشبح ويمكن أن تزيد من وقت التداول لLNPs. ومع ذلك، يمكن أن تشكل هذه السمة أيضا تحديات لتجنيد LNPs إلى خلايا الكبد من خلال آلية استهداف الذاتية التي يقودها apolipoprotein E (ApoE)28. وهكذا، فقد حققت الدراسات في طول سلسلة أسيل لنشر PEG من الشرطة الوطنية الليبيرية، ووجدت أن أطوال قصيرة (C8-14) ينأى عن الشرطة الوطنية الليبيرية وأكثر قابلية لتوظيف ApoE بالمقارنة مع أطوال أطول أسيل28. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن درجة تشبع ذيل الدهون التي يتم اقتران PEG بها تؤثر على توزيع الأنسجة ل LNPs29. في الآونة الأخيرة ، تبين أن توين 20 ، وهو من المواد الخافرة للأمواج شائعة الاستخدام في تركيبات منتجات الأدوية البيولوجية ولها ذيل دهون طويل غير مشبع ، لديه إصابة عالية في استنزاف الغدد الليمفاوية مقارنة ب PEG-DSPE ، والتي قامت إلى حد كبير بإصابة العضلات في موقع الحقن29. يمكن تحسين هذه المعلمة لتحقيق التوزيع الحيوي LNP المطلوب.
وتشمل الطرق التقليدية لتشكيل LNPs طريقة الترطيب رقيقة الفيلم وطريقة حقن الإيثانول27. في حين أن هذه التقنيات متاحة بسهولة ، فهي أيضا كثيفة العمالة ، ويمكن أن تؤدي إلى كفاءة تغليف منخفضة ، وتشكل تحديا لتوسيع نطاق27. وقد أدى التقدم في تقنيات الخلط في أساليب أكثر قابلية لتوسيع نطاق، في حين وضع جزيئات أكثر اتساقا27. وتشمل هذه الأساليب تي تقاطع خلط، خلط الرنجة متداخلة، وmicrofluidic الهيدروديناميكية مع التركيز27. كل طريقة لها بنية فريدة من نوعها، ولكن كل تسمح لخلط سريع لمرحلة مائي يحتوي على حمض النيوكليك مع مرحلة عضوية تحتوي على مكونات الدهون، مما أدى إلى تغليف عالية من الحمض النووي27. في هذا البروتوكول، يتم استخدام خلط سريع وتسيطر عليها من خلال خرطوشة microfluidic، والذي يستخدم تصميم خلط الرنجة متداخلة. يحدد هذا البروتوكول إعداد الحمض النووي الذي يحتوي على LNPs وتجميعه وتوصيفه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

وقد استخدمت ناقلات الأدوية القائمة على الدهون لأنظمة التسليم المتاحة سريريا وتجاريا بسبب صغر حجمها، وعدم التوافق البيولوجي، وكفاءة التغليف العالية. استخدام الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) لتغليف الأحماض النووية مفيد لحماية الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي من التدهور ، مع تعزيز امتصاص الخلوية أيضا. غالبا ما تحتوي LNPs على مكونات دهون متعددة بما في ذلك الدهون المؤينة والدهون المساعد والكوليسترول والبولي إيثيلين غليكول (PEG) الدهون المترافقة. يمكن ل LNPs تغليف الأحماض النووية بسهولة بسبب وجود الدهون المؤينة ، والتي في درجة الحموضة المنخفضة هي cationic وتسمح بالتعقيد مع الحمض النووي الريبي المشحون سلبيا أو الحمض النووي. هنا تتشكل LNPs عن طريق تغليف رسول الحمض النووي الريبي (مرنا) أو الحمض النووي البلازميد (pDNA) باستخدام الخلط السريع للمكونات الدهنية في مرحلة عضوية وعنصر حمض النيوكليك في مرحلة مائي. يتم إجراء هذا الخلط باستخدام منصة خلط دقيقة microfluidic، مما يسمح للتجميع الذاتي الجسيمات النانوية مع الحفاظ على تدفق صفح. يتم قياس حجم الهيدروديناميك والتعددية باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS). يتم تحديد الشحنة السطحية الفعالة على LNP من خلال قياس إمكانات زيتا. تتميز كفاءة التغليف باستخدام صبغة فلورية لقياس الحمض النووي المحاصر. وتبين النتائج التمثيلية إمكانية استنساخ هذه الطريقة والتأثير الذي يترتب على مختلف معايير الصياغة والعملية على الأساليب غير الرسمية المتقدمة.

تم تطوير دفعات متعددة من LNPs بنفس تركيبة الدهون ونسبة N /P من 6 في أيام منفصلة لإثبات قابلية إعادة إنتاج هذه التقنية. وأسفرت الدفعة 1 و 2 عن تداخل توزيعات الحجم مع تعدد تشتت مماثل(الشكل 2A)لم يلاحظ أي فرق كبير في الحجم أو كفاءة التغليف بين الدفعتين المختلفتين<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

يتم تطوير الجسيمات النانوية الدهنية باستخدام نهج منصة خلط microfluidic لتغليف الحمض النووي الريبي والحمض النووي.

صياغة وتميز الجسيمات النانوية الدهنية لتسليم الجينات باستخدام منصة خلط Microfluidic

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنتاج جسيمات نانوية دهون مغلفة بحمض النيوكليك مع قابلية عالية للاستنساخ والسرعة وأحجام منخفضة. يمكن ضبط معلمات التركيب لتحقيق التوزيع الحيوي المطلوب استنادا إلى التطبيق السريري. يسمح التصميم القياسي لخرطوشة الميكروفلويديك بتدفق صفيحة سريعة ودقيقة وخاضعة للرقابة أثناء الاختلاط.الأسلوب قابل للتوسع ويولد جزيئات موحدة مغلفة للغاية. مع معظم منتجات العلاج الجيني المعتمدة تجاريا التي تعتمد على الأساليب الفيروسية ، يمكن أن يوفر هذا الإجراء نظرة ثاقبة على تسليم الجينات ، حيث يسمح نهجه غير الفيروسي بالتطبيقات التي يكون التسريب المتكرر ضروريا لها. ابدأ بإضافة الكمية المناسبة من كل محلول مخزون سائل إلى قارورة زجاجية ذات دوامة متقطعة.كما هو مبين في الجدول، يليه إضافة 200 الإيثانول دليل إلى حجم النهائي من 533 ميكرولتر. ثم أضف الكمية المناسبة من مخزون مرنا وتمييع مع العازلة سيترات لتحقيق حجم النهائي من 1.5 ملليلتر في التركيز المطلوب. لتهيئة القنوات microfluidic، أدخل أولا المعلمة فتيلة في برنامج الصك على النحو المبين في الجدول.بعد ذلك، افتح غطاء الجهاز وضع خرطوشة microfluidic في كتلة الدورية. تحميل ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من الإيثانول في حقنة 1 ملليلتر، مع الحرص على أنه لا توجد فقاعات أو فجوات الهواء في طرف الحقنة وإدراج الحقنة في المدخل الأيمن للخرطوشة. قم بتحميل حقنة سعة 5 ملليلترات مع 1.5 ملليلتر من العازلة سيترات، مع الحرص على عدم وجود فقاعات الهواء أو الثغرات، وإدراج الحقنة في المدخل الأيسر للخرطوشة.ضع أنبوبين مخروطيين 15 ملليلتر في حاملات القصاصات لتكون بمثابة حاويات نفايات وانقر فوق Go "لخلط الحلول. عندما يتوقف الصك فتيلة كما هو مبين من قبل الضوء الأزرق السفلي إيقاف، وفتح في وقت متأخر والتخلص بشكل صحيح من الأنابيب المخروطية والمحاقن. لتشكيل الجسيمات النانوية الدهنية، قم بتعيين معلمات التركيب المناسبة كما هو مبين في الجدول وحمل حقنة 1 ملليلتر بمزيج من الدهون تم إعداده مسبقا.قم بإزالة أي فجوات هوائية أو فقاعات في طرف الحقنة وأدخل الحقنة في الجانب الأيمن من الخرطوشة. قم بتحميل محلول الحمض النووي المعد مسبقا في حقنة 3 ملليلتر ، مع الحرص على عدم وجود فقاعات أو فجوات في الهواء في طرف الحقنة ، وإدخال الحقنة في المدخل الأيسر للخرطوشة. ضع أنبوبا مخروطيا خاليا من RNAase 15 ملليلترا يحمل اسم العينة في مقطع الأنبوب الأيسر وضع مخروطي نفايات 15 ملليلتر في مقطع الأنبوب الأيمن.إغلاق غطاء الصك وانقر فوق Go.The الدهون وحلول مرنا سوف تتدفق من خلال خرطوشة microfluidic وسيتم جمع محلول الجسيمات النانوية الدهون في الأنابيب مخروطية. احتفظ بالأنبوب المخروطي في نهاية عملية التركيب ، ثم قم بتخفيف الجسيمات النانوية الدهنية مع 5 ملليلتر من PBS وخزانة السلامة البيولوجية. لإجراء تبادل عازلة، أولا غسل مسبق 100 كيلودالتون المسام حجم مرشح الطرد المركزي الفائق مع 2 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي، ومن ثم تفريغ برنامج تلفزيوني من المقصورة السفلية.أضف الجسيمات النانوية الدهنية المخففة إلى المقصورة العلوية لمرشح الطرد المركزي الفائق الذي تم غسله مسبقا لثلاثة غسالات طرد مركزي ، مع التخلص من التدفق وإضافة 5 ملليلترات من PBS إلى فلتر الطرد المركزي الفائق بعد أول غسلين. بعد الغسيل الأخير ، قم بتسميد محلول الجسيمات النانوية الدهنية مقابل جدران فلتر الطرد المركزي الفائق عدة مرات لتقليل فقدان الجسيمات النانوية قبل نقل محلول الجسيمات النانوية إلى قارورة خالية من النيوكليز. ثم إضافة برنامج تلفزيوني لجلب تعليق الجسيمات النانوية إلى التركيز التجريبي المناسب وحجم حسب الضرورة.لتقييم كفاءة تغليف الجسيمات النانوية الدهنية ، قم أولا بإعداد تخفيفات متسلسلة ذات شقين من محلول الحمض النووي العامل في PBS لتوليد منحنى قياسي ، بدءا من 500 نانوغرام لكل ملليلتر وجعل ما لا يقل عن خمسة تمييعات. بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيف عينة الجسيمات النانوية في PBS لتحقيق تركيز نظري مناسب يقع حول نقطة الوسط للمنحنى القياسي. ثم إعداد كاشف الحمض النووي الريبي الأخضر ريبو للكشف عن وجود الحمض النووي الريبي داخل وخارج الجسيمات النانوية الدهنية عن طريق خلط الكميات المناسبة من كاشف الحمض النووي الريبي، تريتون X100 وبرنامج تلفزيوني.ثم، للكشف عن وجود الحمض النووي الريبي خارج الجسيمات النانوية السائلة، مزيج الكميات المناسبة من الكواشف الحمض النووي الريبي وبرنامج تلفزيوني فقط. تحميل يكرر معيار الحمض النووي وحلول الجسيمات النانوية الدهون في لوحة البئر 96 الفلورية السوداء قادرة، ثم إضافة حجم متساو من كاشف الحمض النووي الريبي الكمي مع، ودون تريتون X100 إلى معيار وعينة يكرر. هز اللوحة في قارئ اللوحة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء للحصول على خلط شامل للعينات ، ثم قياس الفلورسينس على قارئ لوحة صغيرة على طول موجي مثير من 480 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 520 نانومتر.لقياس حجم الهيدروديناميكية وتشتت البولي من الجسيمات النانوية الدهنية، تمييع أولا محلول الجسيمات النانوية 40 مرة في برنامج تلفزيوني وإضافة الحل إلى cuvette شبه صغيرة. تحميل cuvette على زيتايزر واختيار إجراء التشغيل القياسية لتعيين الصك لقياس الجسيمات النانوية وفقا للمواد، المشتتة، ودرجة الحرارة ونوع الخلية. ثم انقر فوق ابدأ"لقياس حجم الهيدروديناميكية وتشتت بولي من الجسيمات النانوية الدهنية.لقياس إمكانات زيتا من الجسيمات النانوية الدهنية، تمييع محلول الجسيمات النانوية 40 مرة في المياه الخالية من النيوكليز وتحميل الحل في cuvette إلى خط التعبئة. قم بتحميل الكوفيت في محلل زيتا المحتمل ، مع الحرص على أن الأقطاب الكهربائية تتصل بالأداة ، وتعيين الأداة لقياس إمكانات زيتا وفقا للتركيبة المحددة للجسيمات النانوية الدهنية. ثم انقر فوق ابدأ"لقياس إمكانات الجسيمات النانوية الدهنية زيتا.في هذا التحليل، تم تطوير دفعات متعددة من الجسيمات النانوية الدهنية بنفس تركيبة الدهون ونسبة الأمين إلى الفوسفات في أيام منفصلة لإثبات قابلية تكرار هذه التقنية. وكما لوحظ، أظهرت الدفعتان الأولى والكبدية توزيعات متداخلة الحجم مع تشتت مماثل للبولي، دون ملاحظة اختلافات كبيرة في الحجم أو كفاءة التغليف بين الدفعات. وعادة ما تؤدي التغيرات في بارامترات الصياغة إلى بعض الاختلافات الصغيرة والهانة إحصائيا.على سبيل المثال، يؤدي خفض نسبة الأمين إلى الفوسفات إلى انخفاض بنسبة 4٪ في كفاءة التغليف، مع زيادة مصاحبة في القطر الهيدروديناميكي للجسيمات النانوية. الجسيمات النانوية الدهنية وضعت مع الدهون المؤينة المختلفة ولكن نفس نسبة الأمين إلى الفوسفات، تظهر تغييرا كبيرا في كفاءة التغليف، فضلا عن اختلافات طفيفة في قطر الجسيمات. يؤدي تغليف الحمض النووي البلازميد إلى جزيئات أكبر مقارنة بجسيمات نانوية دهون مغلفة بال mRA ، على الرغم من أن كلا النوعين من الجسيمات النانوية يظهران كفاءة تغليف مماثلة.ومع ذلك، لا تؤثر التغييرات في معلمة عملية معدل التدفق على تطور الجسيمات النانوية الدهنية. الجسيمات النانوية الدهنية لها تطبيقات كبيرة، والمثال المثالي هو اللقاحات COVID-19 التي تمت الموافقة عليها مؤخرا. هذه التقنية بمثابة مجموعة أدوات كبيرة ويمهد الطريق للتطبيقات في المستقبل من خلال السماح لفحص صياغة الطرف السفلي.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

تسليم الجينات والخلايا البشرية في ترنسفكأيشن سرطان البنكرياس باستخدام مستقبلات عامل نمو البشرة استهداف الجيلاتين المستندة Nanovectors المهندسة

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

تقييم توصيل الجينات البوليمرية الجسيمات النانوية من تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر وعالية الإنتاجية قياس التدفق الخلوي

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

تحليل خلط التجانس في جهاز ميكروفلويديك التي كتبها الميكروسكيل انعراجي تقنية

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

الصلبة الدهون النانوية (SLNs) لاستهداف التطبيقات بين الخلايا

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

منصة ميكروفلويديك مع تعدد كشف الالكترونية لتتبع المكانية من الجسيمات

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

منصة موائع جزيئية "التصوير الطولي" في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...