Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Tak til Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger og Philip Zakas for deres vejledning og bidrag til LNP udvikling.

Der findes et skema over den samlede proces i figur 1.
1. Udarbejdelse af buffere
BEMÆRK: Steril filtrering af bufferne er stærkt foreslået her for at fjerne eventuelle partikler, der kan påvirke nukleinsyren og LNP-kvaliteten.
<ol><li>Fosfat buffered saltvand (PBS)<ol>
<li>Forbered 1x PBS ved hjælp af 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl og 2,7 mM KCl i nucleasefrit vand og juster pH...

<ol>
	<li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery.">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li><li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).</li><li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano+based+drug+delivery+systems:+recent+developments+and+future+prospects.">Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects.</a> J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).</li><li>Rai, R., Alwani, S., Badea, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles+in+gene+therapy:+New+avenues+of+design+and+optimization+for+delivery+applications.">Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications.</a> Polymers. 11 (4), 745 (2019).</li><li>Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+polymer+micelles+of+controlled+size,+stability,+and+functionality+for+siRNA+delivery.">Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery.</a> ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li><li>Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer+probing+of+assembly+and+disassembly+of+short+interfering+RNA/Poly(ethylene+glycol)-Poly-L-Lysine+polyion+complex+micelles.">F&#246;rster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles.</a> Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).</li><li>Puri, A., Loomis, K., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+nanoparticles+as+pharmaceutical+drug+carriers:+from+concepts+to+clinic.">Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic.</a> Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).</li><li>Cullis, P. R., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+systems+for+enabling+gene+therapies.">Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies.</a> Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).</li><li>Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+to+the+center+of+the+cell:+Current+Nanocarrier+design+strategies+targeting+biopharmaceuticals+to+the+cytoplasm+an+nucleus.">Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).</li><li>Zhao, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+gene+delivery.">Lipid nanoparticles for gene delivery.</a> Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+in+vivo+potency+of+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).</li><li>Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+delivery+systems+for+siRNA-based+therapeutics.">Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics.</a> Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).</li><li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies:+From+concepts+to+clinical+utility.">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).</li><li>Shin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+development+and+a+potential+nanomaterial+path+forward.">COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward.</a> Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).</li><li>Thanh Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COVID-19+vaccine+development+landscape.">The COVID-19 vaccine development landscape.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).</li><li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery.">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).</li><li>Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+lipid+nanoparticles.">mRNA lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2019).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Suzuki, Y., Ishihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+activity+and+uptake+mechanism+of+siRNA-lipid+nanoparticles+with+an+asymmetric+ionizable+lipid.">Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid.</a> International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+environment+in+endocytic+compartments.">The acidic environment in endocytic compartments.</a> Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).</li><li>Maugeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+endosomal+escape+of+LNP-mRNA+and+loading+into+EVs+for+transport+to+other+cells.">Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li><li>Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Nanoscale. (45), (2019).</li><li>Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+whereby+cationic+lipids+promote+intracellular+delivery+of+polynucleic+acids.">On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids.</a> Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).</li><li>Hafez, I. M., Culis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lipid+polymorphism+in+intracellular+delivery.">Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).</li><li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery.">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).</li><li>Mui, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+polyethylene+glycol+lipid+desorption+rates+on+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+siRNA+lipid+nanoparticles.">Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).</li><li>Zukancic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+poly(Ethylene+glycol)+and+lipid+structure+in+targeted+gene+delivery+to+lymph+nodes+by+lipid+nanoparticles.">The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).</li><li>NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: <a target="_blank" href="https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas">https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas</a> (2020)</li><li>Kastner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+manufacturing+of+size-tuned+liposomes+by+a+new+microfluidics+method+using+enhanced+statistical+tools+for+characterization.">High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).</li><li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing.">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA.">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticles+for+intramuscular+administration+of+mRNA+vaccines.">Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+mRNA+to+colon+inflammatory+lesions+by+lipid-nano-particles+containing+environmentally-sensitive+lipid-like+materials+with+oleic+acid+scaffolds.">The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds.</a> Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).</li><li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+lipid+nanoparticles.">Nucleic acid lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2018).</li></ol>

Reproducerbarhed, hastighed og lavvolumenscreening er betydelige fordele ved at bruge mikrofluidisk blanding til at danne LNPs sammenlignet med andre eksisterende metoder (f.eks. lipidfilmhydrering og ethanolinjektion). Vi har vist reproducerbarheden af denne metode uden indvirkning på indkapslingseffektivitet eller partikelstørrelse observeret med forskellige LNP-partier. Dette er et væsentligt kriterium for, at alle terapeutiske, herunder LNP'er, bliver klinisk tilgængelige.
Den teknik, ...

Lægemiddelbærere bruges til at beskytte og levere en terapeutisk med typiske gunstige egenskaber, herunder lav cytotoksicitet, øget biotilgængelighed og forbedret stabilitet1,2,3. Polymere nanopartikler, micelles og lipidbaserede partikler er tidligere blevet undersøgt for nukleinsyreindkapsling og levering4,5,6,7. Lipider er blevet brugt i forskellige typer af nanocarrier systemer, herunder liposomer, og lipid nanopartikler, da de er biokompatiible med høj stabilitet8. LNPs kan let indkapsle nukleinsyrer til genlevering9,10. De beskytter nukleinsyren mod nedbrydning ved serumproceer under systemisk cirkulation11 og kan forbedre leveringen til bestemte steder, da overfladen topografi og fysiske egenskaber lnps påvirke deres biodistribution12. LNPs også forbedre væv penetration og cellulære optagelse9. Tidligere undersøgelser har vist succesen med siRNA-indkapsling inden for en LNP13, herunder den første kommercielt tilgængelige LNP, der indeholder siRNA terapeutisk til behandling af polyneuropati af arvelig transthyretin-medieret amyloidose14 behandling, der blev godkendt af United States Food and Drug Administration (FDA) og Det Europæiske Lægemiddelagentur i 2018. For nylig er LNPs ved at blive undersøgt til levering af større nukleinsyre moieties, nemlig mRNA og DNA9. Fra 2018 var der ~ 22 lipidbaserede nukleinsyreleveringssystemer, der gennemgår kliniske forsøg14. Derudover er mRNA indeholdende LNPs i øjeblikket førende kandidater og har været ansat til en COVID-19 vaccine15,16. Den potentielle succes for disse ikke-virale genterapier kræver dannelse af små (~ 100 nm), stabile og ensartede partikler med høj indkapsling af nukleinsyren.
Brug af en ionizable lipid som en hovedkomponent i LNP formuleringen har vist fordele for kompleksitet, indkapsling, og levering effciciency14. Ioniserbare lipider har typisk en syre dissociation konstant (pKa) < 7; for eksempel, dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), den ioniserbare lipid, der anvendes i FDA godkendt LNP formulering, har en pKa på 6,4417. Ved lav pH bliver amingrupperne på den ioniserbare lipid protoneret og positivt ladet, hvilket giver mulighed for samlingen med negativt ladede fosfatgrupper på mRNA og DNA. Forholdet mellem amin, "N", grupper til fosfat, "P", grupper bruges til at optimere samlingen. N/P-forholdet er afhængigt af de anvendte lipider og nukleinsyrer, som varierer afhængigt af formuleringen18. Efter dannelse kan pH-virksomheden justeres til en neutral eller fysiologisk pH-situation for at give mulighed for terapeutisk administration. Ved disse pH-værdier er den ioniserbare lipid også deprotoneret, hvilket giver lnp neutral overfladeladning.
Den ionizable lipid også hjælpemidler i endosomal flugt19,20. LNPs gennemgår endokytose under cellulær optagelse og skal frigives fra endosomet for at levere mRNA-lasten ind i cellens cytoplasma eller DNA-last til kernen21. Inde i endosomet er typisk et mere surt miljø end det ekstracellulære medium, hvilket gør den ioniserbare lipid positivt ladet22,23. Den positivt ladede ioniserbare lipid kan interagere med negative ladninger på den endosomale lipidmembran, som kan forårsage destabilisering af endosomet, der giver mulighed for frigivelse af LNP og nukleinsyre. Forskellige ioniserbare lipider er i øjeblikket ved at blive undersøgt for at forbedre effekten af både LNP distribution, samt endosomal flugt14.
Andre typiske komponenter i en LNP omfatter hjælper lipider, såsom en fosfattidylcholin (PC) eller fosfoethanolamin (PE) lipid. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DSPC), og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DOPC) er almindeligt anvendte hjælper lipider24,25. DOPE har vist sig at danne en omvendt sekskantet II (HII) fase og forbedre transfection ved membran fusion26,mens DSPC er blevet anset for at stabilisere LNPs med sin cylindriske geometri27. Kolesterol er også indarbejdet i formuleringen for at øge membran stivhed, efterfølgende medvirken i stabiliteten af LNP. Endelig er lipid-konjugeret polyethylenglycol (PEG) inkluderet i formuleringen for at give den nødvendige steriske barriere for at hjælpe i partikel selvmontering27. PEG forbedrer også LNP'ernes lagerstabilitet ved at forhindre sammenlægning. Desuden er PEG ofte bruges som en stealth komponent og kan øge omsætningstiden for LNPs. Denne egenskab kan dog også give udfordringer for rekruttering af LNPs til hepatocytter gennem en endogen målretningsmekanisme drevet af apolipoprotein E (ApoE)28. Undersøgelser har således undersøgt acylkædelængden for diffusion af PEG fra LNP og fundet, at korte længder (C8-14) tager afstand fra LNP og er mere modtagelige for ApoE-rekruttering sammenlignet med længere acyllængder28. Endvidere har graden af mætning af lipidhale, som PEG er konjugeret til, vist sig at påvirke vævsfordelingen af LNPs29. For nylig, Tween 20, som er et almindeligt anvendt overfladeaktivt stof i biologiske lægemiddel produkt formuleringer og har en lang umættet fedtehale, viste sig at have høj transfection i dræning lymfeknuder i forhold til PEG-DSPE, som stort set transfected musklen på injektionsstedet29. Denne parameter kan optimeres for at opnå den ønskede LNP biodistribution.
Konventionelle metoder til dannelse af LNPs omfatter tyndfilmshydreringsmetoden og ethanolinjektionsmetoden27. Mens disse er let tilgængelige teknikker, de er også arbejdskrævende, kan resultere i lav indkapsling effektivitet, og er udfordrende at skalere op27. Fremskridt i blanding teknikker har resulteret i metoder mere modtagelige for at skalere op, samtidig med at udvikle mere ensartede partikler27. Disse metoder omfatter T-junction blanding, forskudt sildeben blanding, og mikrofluidisk hydrodynamisk fokus27. Hver metode har en unik struktur, men alle giver mulighed for hurtig blanding af en vandig fase, der indeholder nukleinsyren med en organisk fase, der indeholder lipidkomponenterne, hvilket resulterer i høj indkapsling af nukleinsyren27. I denne protokol anvendes hurtig og kontrolleret blanding gennem en mikrofluidisk patron, som anvender det forskudte sildebensblandingsdesign. Denne protokol beskriver forberedelse, samling og karakterisering af nukleinsyre indeholdende LNPs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

Lipid-baserede lægemiddelbærere er blevet brugt til klinisk og kommercielt tilgængelige leveringssystemer på grund af deres lille størrelse, biokompatibilitet og høje indkapslingseffektivitet. Brug af lipid nanopartikler (LNPs) til at indkapsle nukleinsyrer er fordelagtigt at beskytte RNA eller DNA fra nedbrydning, samtidig med at fremme cellulære optagelse. LNPs indeholder ofte flere lipid komponenter, herunder en ioniserbar lipid, hjælper lipid, kolesterol, og polyethylen glykol (PEG) konjugeret lipid. LNPs kan let indkapsle nukleinsyrer på grund af den ioniserbare lipid tilstedeværelse, som ved lav pH er kationisk og giver mulighed for kompleksitet med negativt ladet RNA eller DNA. Her lnsulating messenger RNA (mRNA) eller plasmid DNA (pDNA) ved hjælp af hurtig blanding af lipid komponenter i en organisk fase og nukleinsyre komponent i en vandig fase. Denne blanding udføres ved hjælp af en præcis mikrofluidisk blandingsplatform, der giver mulighed for nanopartikler selvmontering, samtidig med at laminar flow opretholdes. Den hydrodynamiske størrelse og polydispersitet måles ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS). Den effektive overfladeladning på LNP bestemmes ved at måle zetapotentialet. Indkapslingseffektiviteten er karakteriseret ved hjælp af et fluorescerende farvestof til at kvantificere fanget nukleinsyre. Repræsentative resultater viser, at denne metode er reproducerbarhed, og hvilken indflydelse forskellige formulerings- og procesparametre har på de udviklede LNP'er.

Flere partier lnps med samme lipidformulering og N/P-forhold på 6 blev udviklet på separate dage for at demonstrere reproducerbarhed af teknikken. Parti 1 og 2 resulterede i overlappende størrelsesfordelinger med tilsvarende polydispersitet (figur 2A) Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i størrelsen eller indkapslingseffektiviteten mellem de to forskellige partier (figur 2B). Indkapslingseffektiviteten var høj...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid nanopartikler er udviklet ved hjælp af en mikrofluidisk blanding platform tilgang til mRNA og DNA indkapsling.

Formulering og karakterisering lipid nanopartikler til genlevering ved hjælp af en mikrofluidisk blandingsplatform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Denne protokol kan bruges til at producere nukleinsyre indkapslet lipid nanopartikler med høj reproducerbarhed og hastighed og lave mængder. Formuleringsparametrene kan indstilles til at opnå en ønsket biofordeling baseret på den kliniske anvendelse. Standard sildeben design af mikrofluidiske patron giver en hurtig, præcis og kontrolleret laminar flow under blanding.Metoden er modtagelig for opskalering og genererer ensartede, meget indkapslede partikler. Med de fleste kommercielt godkendte genterapiprodukter, der er afhængige af virale metoder, kan denne procedure give indsigt i genlevering, da dens ikke-virale tilgang tillader applikationer, hvor gentag dosering er nødvendig. Begynd med at tilføje den passende mængde af hver flydende lageropløsning til et glasglas med intermitterende hvirvler.som angivet i tabellen, efterfulgt af tilsætning af 200 korrekt ethanol til et endeligt volumen på 533 mikroliter. Tilsæt derefter den passende mængde mRNA-lager og fortynd med citratbuffer for at opnå et endeligt volumen på 1,5 milliliter i den ønskede koncentration. For at prime de mikrofluidiske kanaler skal du først indtaste primingparameteren i instrumentsoftwaren som skitseret i tabellen.Åbn derefter instrumentlåget, og placer en mikrofluidisk patron i den roterende blok. Læg mindst 500 mikroliter ethanol i en 1 milliliter sprøjte, idet der ikke er bobler eller lufthuller ved sprøjtespidsen, og sæt sprøjten i patronens højre indløb. Læg en fem milliliter sprøjte med 1,5 milliliter citratbuffer, idet der ikke er luftbobler eller huller, og sæt sprøjten i patronens venstre indløb.Placer to 15 milliliter koniske rør i klippeholderne for at tjene som affaldsbeholdere og klik på Go"for at blande løsningerne. Når instrumentet holder op med at grunde som angivet af det nederste blå lys, der slukker, skal du åbne det sene og bortskaffe de koniske rør og sprøjter korrekt. For lipid nanopartikler dannelse, indstille de relevante formulering parametre som angivet i tabellen og indlæse en 1 milliliter sprøjte med en tidligere forberedt lipid mix.Fjern eventuelle lufthuller eller bobler i sprøjtespidsen, og sæt sprøjten i højre side af patronen. Læg den tidligere forberedte nukleinsyreopløsning i en 3 milliliter sprøjte, idet der ikke er bobler eller lufthuller i sprøjtespidsen, og sæt sprøjten i patronens venstre indløb. Placer en 15 milliliter RNAase-fri koniske rør mærket med prøven navn i venstre rør klip og placere en 15 milliliter affald koniske i højre rør klip.Luk instrumentlåget, og klik på Go.Lipid- og mRNA-løsningerne strømmer gennem den mikrofluidiske patron, og lipid nanopartikleropløsningen opsamles i de koniske rør. Bevar det koniske rør i slutningen af formuleringsprocessen, fortynd derefter lipid nanopartiklerne med 5 milliliter PBS og et biologisk sikkerhedsskab. For at udføre en buffer udveksling, først forvaske en 100 kilodalton pore størrelse ultracentrifuge filter med 2 milliliter PBS, centrifuge, og derefter tømme PBS fra det nederste rum.Tilsæt de fortyndede lipid nanopartikler til det øverste rum i det forvaskede ultracentrifugfilter til tre centrifugevask, kassér flow-through og tilsætning af 5 milliliter PBS til ultracentrifugfilteret efter de to første vasker. Efter den sidste vask, pipette lipid nanopartikler opløsning mod væggene i ultracentrifuge filter et par gange for at minimere nanopartikler tab, før du overfører nanopartikler løsning til en nuclease-fri hætteglas. Derefter tilsættes PBS at bringe nanopartikler suspension til passende eksperimentel koncentration og volumen efter behov.For at vurdere indkapslingseffektiviteten af lipid nanopartiklerne skal du først forberede dobbelte serielle fortyndinger af fungerende nukleinsyreopløsning i PBS for at generere en standardkurve, der starter fra 500 nanogram pr. milliliter og laver mindst fem fortyndinger. Derefter forberede nanopartikler prøve fortyndinger i PBS at opnå en passende teoretisk koncentration, der ligger omkring midtpunktet af standardkurven. Forbered derefter ribogrøn RNA reagenset for at detektere tilstedeværelsen af RNA både inden for og uden for lipid nanopartikler ved at blande de relevante mængder RNA reagens, Triton X100 og PBS.For derefter at opdage tilstedeværelsen af RNA uden for den flydende nanopartikler blandes de relevante mængder RNA-reagenser og PBS kun. Belastning replikerer af nukleinsyre standard og lipid nanopartikler løsninger i en sort fluorescens-stand 96 brønd plade, derefter tilføje en lige stor mængde RNA kvantificering reagens med, og uden Triton X100 til standard og prøve replikater. Ryst pladen i pladelæseren i fem minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys for at opnå en grundig blanding af prøverne, og mål derefter fluorescensen på en mikropladelæser ved en excitationsbølgelængde på 480 nanometer og en emissionsbølgelængde på 520 nanometer.For at måle lipidnanopartiklernes hydrodynamiske størrelse og polydispersitet fortyndes først nanopartiklerne 40 gange i PBS og tilsæt opløsningen til en semi mikrokuvette. Læg cuvette på Zetasizer og vælg en standardprocedure for at indstille instrumentet til at måle nanopartiklerne i henhold til deres materiale, dispergeringsmiddel, temperatur og celletype. Klik derefter på Start"for at måle lipid nanopartiklernes hydrodynamiske størrelse og polydispersitet.For at måle Zeta-potentialet i lipid nanopartikler fortyndes nanopartiklerne 40 gange i nucleasefrit vand og indlæse opløsningen i et cuvette til påfyldningslinjen. Læg cuvette i en Zeta potentiel analysator, idet de tager sig af, at elektroderne kommer i kontakt med instrumentet, og sæt instrumentet til at måle Zeta-potentialet i henhold til lipid nanopartiklernes specifikke sammensætning. Klik derefter på Start"for at måle Zeta lipid nanopartikler potentiale.I denne analyse blev der udviklet flere partier lipid nanopartikler med samme lipidformulering og forholdet mellem amin og fosfat på separate dage for at demonstrere teknikkens reproducerbarhed. Som observeret udviste partier et og to overlappende størrelsesfordelinger med en lignende polydispersering uden væsentlige forskelle i størrelsen eller indkapslingseffektiviteten mellem partierne. Typisk fremkalder ændringer i formuleringsparametrene nogle små, men statistisk signifikante forskelle.For eksempel resulterer reduktion af forholdet mellem amin og fosfat i et fald på 4% i indkapslingseffektiviteten med en samtidig stigning i nanopartiklernes hydrodynamiske diameter. Lipid nanopartikler formuleret med forskellige ioniserbare lipider, men det samme amin til fosfatforhold, udviser en betydelig ændring i indkapslingseffektiviteten samt små forskelle i partikeldiameteren. Indkapslingen af plasmid DNA resulterer i større partikler i forhold til mRA indkapsle lipid nanopartikler, selv om begge typer af nanopartikler demonstrere en lignende indkapsling effektivitet.Ændringer i flowhastighed proces parameter, dog ikke påvirker lipid nanopartikler udvikling. Lipid nanopartikler har gode anvendelser, det perfekte eksempel er de nyligt godkendte COVID-19 vacciner. Denne teknik fungerer som et godt værktøjssæt og baner vejen for fremtidige anvendelser ved at tillade screening af formulering af underekstremitet.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Levering og transfektion i Human bugspytkirtelkræftceller hjælp epidermal vækstfaktor receptor-målrettede Gelatine-baseret Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering af Polymeric Gene Delivery nanopartikler ved Nanopartikel Tracking Analyse og Højkapacitetsforskning Flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell Klemme som en robust, Mikrofluid Intracellulær Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analyserer Blanding Inhomogeniteter i en mikrofluidapparat af Individuel Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipidnanopartikler (SLNs) til intracellulær målretning Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En Mikrofluid platform for High-throughput Single-celle Isolering og Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikrofluid Platform med Multiplexed Elektronisk Detection for fysisk sporing af partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En mikrofluid Platform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...