Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Dank aan Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger en Philip Zakas voor hun begeleiding en bijdragen aan de ontwikkeling van LNP.

Een schema van het totale proces is opgenomen in figuur 1.
1. Voorbereiding van buffers
OPMERKING: Steriele filtering van de buffers wordt hier sterk aanbevolen om deeltjes te verwijderen die de nucleïnezuur- en LNP-kwaliteit kunnen beïnvloeden.
<ol><li>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)<ol>
<li>Bereid 1x PBS met 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl en 2,7 mM KCl in nucleasevrij water...

<ol>
	<li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery.">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li><li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).</li><li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano+based+drug+delivery+systems:+recent+developments+and+future+prospects.">Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects.</a> J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).</li><li>Rai, R., Alwani, S., Badea, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles+in+gene+therapy:+New+avenues+of+design+and+optimization+for+delivery+applications.">Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications.</a> Polymers. 11 (4), 745 (2019).</li><li>Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+polymer+micelles+of+controlled+size,+stability,+and+functionality+for+siRNA+delivery.">Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery.</a> ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li><li>Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer+probing+of+assembly+and+disassembly+of+short+interfering+RNA/Poly(ethylene+glycol)-Poly-L-Lysine+polyion+complex+micelles.">F&#246;rster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles.</a> Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).</li><li>Puri, A., Loomis, K., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+nanoparticles+as+pharmaceutical+drug+carriers:+from+concepts+to+clinic.">Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic.</a> Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).</li><li>Cullis, P. R., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+systems+for+enabling+gene+therapies.">Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies.</a> Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).</li><li>Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+to+the+center+of+the+cell:+Current+Nanocarrier+design+strategies+targeting+biopharmaceuticals+to+the+cytoplasm+an+nucleus.">Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).</li><li>Zhao, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+gene+delivery.">Lipid nanoparticles for gene delivery.</a> Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+in+vivo+potency+of+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).</li><li>Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+delivery+systems+for+siRNA-based+therapeutics.">Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics.</a> Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).</li><li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies:+From+concepts+to+clinical+utility.">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).</li><li>Shin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+development+and+a+potential+nanomaterial+path+forward.">COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward.</a> Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).</li><li>Thanh Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COVID-19+vaccine+development+landscape.">The COVID-19 vaccine development landscape.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).</li><li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery.">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).</li><li>Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+lipid+nanoparticles.">mRNA lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2019).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Suzuki, Y., Ishihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+activity+and+uptake+mechanism+of+siRNA-lipid+nanoparticles+with+an+asymmetric+ionizable+lipid.">Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid.</a> International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+environment+in+endocytic+compartments.">The acidic environment in endocytic compartments.</a> Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).</li><li>Maugeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+endosomal+escape+of+LNP-mRNA+and+loading+into+EVs+for+transport+to+other+cells.">Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li><li>Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Nanoscale. (45), (2019).</li><li>Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+whereby+cationic+lipids+promote+intracellular+delivery+of+polynucleic+acids.">On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids.</a> Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).</li><li>Hafez, I. M., Culis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lipid+polymorphism+in+intracellular+delivery.">Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).</li><li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery.">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).</li><li>Mui, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+polyethylene+glycol+lipid+desorption+rates+on+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+siRNA+lipid+nanoparticles.">Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).</li><li>Zukancic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+poly(Ethylene+glycol)+and+lipid+structure+in+targeted+gene+delivery+to+lymph+nodes+by+lipid+nanoparticles.">The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).</li><li>NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: <a target="_blank" href="https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas">https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas</a> (2020)</li><li>Kastner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+manufacturing+of+size-tuned+liposomes+by+a+new+microfluidics+method+using+enhanced+statistical+tools+for+characterization.">High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).</li><li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing.">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA.">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticles+for+intramuscular+administration+of+mRNA+vaccines.">Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+mRNA+to+colon+inflammatory+lesions+by+lipid-nano-particles+containing+environmentally-sensitive+lipid-like+materials+with+oleic+acid+scaffolds.">The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds.</a> Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).</li><li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+lipid+nanoparticles.">Nucleic acid lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2018).</li></ol>

Reproduceerbaarheid, snelheid en screening met een laag volume zijn belangrijke voordelen van het gebruik van microfluïdische menging om LNP's te vormen in vergelijking met andere bestaande methoden (bijv. Lipid film hydratatie en ethanolinjectie). We hebben de reproduceerbaarheid van deze methode aangetoond zonder impact op de inkapselingsefficiëntie of deeltjesgrootte waargenomen met verschillende LNP-batches. Dit is een essentieel criterium voor elk therapeutisch middel, inclusief LNP's, om klinisch beschikbaar te w...

Medicijndragers worden gebruikt om een therapeutisch middel te beschermen en af te leveren met typische gunstige eigenschappen, waaronder lage cytotoxiciteit, verhoogde biologische beschikbaarheid en verbeterde stabiliteit1,2,3. Polymere nanodeeltjes, micellen en op lipiden gebaseerde deeltjes zijn eerder onderzocht voor nucleïnezuurinkapseling en -afgifte4,5,6,7. Lipiden zijn gebruikt in verschillende soorten nanodragersystemen, waaronder liposomen en lipide nanodeeltjes, omdat ze biocompatibel zijn met een hoge stabiliteit8. LNP's kunnen gemakkelijk nucleïnezuren inkapselen voor genafgifte9,10. Ze beschermen het nucleïnezuur tegen afbraak door serumproteasen tijdens systemischecirculatie 11 en kunnen de afgifte op specifieke locaties verbeteren, omdat de oppervlaktetopografie en fysische eigenschappen van LNP's hun biodistributie beïnvloeden12. LNP's verbeteren ook de weefselpenetratie en cellulaire opname9. Eerdere studies hebben het succes aangetoond van siRNA-inkapseling binnen een LNP13, waaronder de eerste commercieel verkrijgbare LNP-bevattende siRNA-therapeutische voor de behandeling polyneuropathie van erfelijke transthyretine-gemedieerde amyloïdose14-behandeling die in 2018 werd goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) en het Europees Geneesmiddelenbureau. Meer recent worden LNP's bestudeerd voor de afgifte van grotere nucleïnezuurmoieties, namelijk mRNA en DNA9. Vanaf 2018 waren er ~ 22 op lipiden gebaseerde nucleïnezuurafgiftesystemen die klinische onderzoeken ondergingen14. Bovendien zijn mRNA-bevattende LNP's momenteel leidende kandidaten en zijn ze gebruikt voor een COVID-19-vaccin15,16. Het potentiële succes voor deze niet-virale gentherapieën vereist het vormen van kleine (~ 100 nm), stabiele en uniforme deeltjes met een hoge inkapseling van het nucleïnezuur.
Het gebruik van een ioniseerbare lipide als hoofdbestanddeel in de LNP-formulering heeft voordelen aangetoond voor complexatie, inkapseling en afgifte-effciciency14. Ioniseerbare lipiden hebben meestal een zuurdissociatieconstante (pKa) < 7; dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyraat (D-Lin-MC3-DMA), het ioniseerbare lipide dat wordt gebruikt in de door de FDA goedgekeurde LNP-formulering, heeft bijvoorbeeld een pKa van 6,4417. Bij lage pH worden de aminegroepen op het ioniseerbare lipide geprotoneerd en positief geladen, waardoor de assemblage met negatief geladen fosfaatgroepen op mRNA en DNA mogelijk wordt. De verhouding van amine, "N", groepen tot fosfaat, "P", groepen wordt gebruikt om de assemblage te optimaliseren. De N/P-verhouding is afhankelijk van de gebruikte lipiden en nucleïnezuren, die varieert afhankelijk van de formulering18. Na de vorming kan de pH worden aangepast aan een neutrale of fysiologische pH om therapeutische toediening mogelijk te maken. Bij deze pH-waarden wordt het ioniseerbare lipide ook gedeprotoneerd, wat een neutrale oppervlaktelading aan de LNP verleent.
Het ioniseerbare lipide helpt ook bij endosomale ontsnapping19,20. LNP's ondergaan endocytose tijdens cellulaire opname en moeten worden vrijgegeven uit het endosoom om de mRNA-lading in het celcytoplasma of DNA-lading naar de kern af te leveren21. In het endosoom bevindt zich meestal een meer zure omgeving dan het extracellulaire medium, waardoor het ioniseerbare lipide positief geladenis 22,23. Het positief geladen ioniseerbare lipide kan interageren met negatieve ladingen op het endosomale lipidemembraan, wat destabilisatie van het endosoom kan veroorzaken waardoor de LNP en het nucleïnezuur vrijkomen. Verschillende ioniseerbare lipiden worden momenteel bestudeerd voor het verbeteren van de werkzaamheid van zowel LNP-distributie als endosomale ontsnapping14.
Andere typische componenten van een LNP zijn helperlipiden, zoals een fosfatidylcholine (PC) of fosfoethanolamine (PE) lipide. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) zijn veelgebruikte helperlipiden24,25. Van DOPE is aangetoond dat het een omgekeerde hexagonale II (HII) fase vormt en de transfectie verbetert door membraanfusie26, terwijl van DSPC wordt gedacht dat het LNP's stabiliseert met zijn cilindrische geometrie27. Cholesterol wordt ook in de formulering opgenomen om de stijfheid van het membraan te verhogen, wat vervolgens helpt bij de stabiliteit van de LNP. Ten slotte is lipide-geconjugeerde polyethyleenglycol (PEG) opgenomen in de formulering om de nodige sterische barrière te bieden om te helpen bij de zelfassemblage van deeltjes27. PEG verbetert ook de opslagstabiliteit van LNP's door aggregatie te voorkomen. Bovendien wordt PEG vaak gebruikt als stealth-component en kan het de circulatietijd voor de LNP's verlengen. Dit attribuut kan echter ook uitdagingen opleveren voor de rekrutering van LNP's voor hepatocyten via een endogene targetingmechanisme aangedreven door apolipoproteïne E (ApoE)28. Studies hebben dus de acylketenlengte onderzocht voor diffusie van PEG uit de LNP, en vonden dat korte lengtes (C8-14) zich distantiëren van de LNP en meer vatbaar zijn voor ApoE-rekrutering in vergelijking met langere acyllengtes28. Verder is aangetoond dat de mate van verzadiging van de lipidestaart waarmee PEG is geconjugeerd, de weefselverdeling van LNP'sbeïnvloedt 29. Onlangs werd aangetoond dat Tween 20, een veelgebruikte oppervlakteactieve stof in biologische geneesmiddelformuleringen en een lange onverzadigde lipidestaart heeft, een hoge transfectie heeft in drainerende lymfeklieren in vergelijking met PEG-DSPE, die de spier op de injectieplaats grotendeels transfecteerde29. Deze parameter kan worden geoptimaliseerd om de gewenste LNP-biodistributie te bereiken.
Conventionele methoden voor het vormen van LNP's omvatten de dunnefilmhydratatiemethode en ethanolinjectiemethode27. Hoewel dit direct beschikbare technieken zijn, zijn ze ook arbeidsintensief, kunnen ze resulteren in een lage inkapselingsefficiëntie en zijn ze een uitdaging om op teschalen 27. Vooruitgang in mengtechnieken heeft geresulteerd in methoden die beter kunnen worden opgeschaald, terwijl meer uniforme deeltjes wordenontwikkeld 27. Deze methoden omvatten T-junctiemenging, gespreide visgraatmenging en microfluïdische hydrodynamische focus27. Elke methode heeft een unieke structuur, maar ze maken allemaal een snelle menging mogelijk van een waterige fase die het nucleïnezuur bevat met een organische fase die de lipidecomponenten bevat, wat resulteert in een hoge inkapseling van het nucleïnezuur27. In dit protocol wordt gebruik gemaakt van snel en gecontroleerd mengen door een microfluïdische cartridge, die het verspringende visgraatmengontwerp gebruikt. Dit protocol schetst de voorbereiding, assemblage en karakterisering van nucleïnezuur dat LNP's bevat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

Op lipiden gebaseerde medicijndragers zijn gebruikt voor klinisch en commercieel beschikbare toedieningssystemen vanwege hun kleine formaat, biocompatibiliteit en hoge inkapselingsefficiëntie. Het gebruik van lipide nanodeeltjes (LNP's) om nucleïnezuren in te kapselen is voordelig om het RNA of DNA te beschermen tegen afbraak, terwijl het ook de cellulaire opname bevordert. LNP's bevatten vaak meerdere lipidecomponenten, waaronder een ioniseerbare lipide, helperlipide, cholesterol en polyethyleenglycol (PEG) geconjugeerd lipide. LNP's kunnen gemakkelijk nucleïnezuren inkapselen vanwege de ioniseerbare lipideaanwezigheid, die bij lage pH kationisch is en complexatie mogelijk maakt met negatief geladen RNA of DNA. Hier worden LNP's gevormd door het inkapselen van boodschapper-RNA (mRNA) of plasmide-DNA (pDNA) met behulp van snelle menging van de lipidecomponenten in een organische fase en de nucleïnezuurcomponent in een waterige fase. Dit mengen wordt uitgevoerd met behulp van een nauwkeurig microfluïdisch mengplatform, waardoor zelfassemblage van nanodeeltjes mogelijk is met behoud van de laminaire stroom. De hydrodynamische grootte en polydispersiteit worden gemeten met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS). De effectieve oppervlaktelading op de LNP wordt bepaald door de zetapotentiaal te meten. De inkapselingsefficiëntie wordt gekenmerkt met behulp van een fluorescerende kleurstof om ingesloten nucleïnezuur te kwantificeren. Representatieve resultaten tonen de reproduceerbaarheid van deze methode en de invloed die verschillende formulerings- en procesparameters hebben op de ontwikkelde LNP's.

Meerdere batches LNP's met dezelfde lipideformulering en N / P-verhouding van 6 werden op afzonderlijke dagen ontwikkeld om de reproduceerbaarheid van de techniek aan te tonen. Batch 1 en 2 resulteerden in overlappende grootteverdelingen met vergelijkbare polydispersiteit (Figuur 2A) Er werd geen significant verschil waargenomen in de grootte of inkapselingsefficiëntie tussen de twee verschillende batches (figuur 2B). De inkapse...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipide nanodeeltjes worden ontwikkeld met behulp van een microfluïdische mengplatformbenadering voor mRNA- en DNA-inkapseling.

Het formuleren en karakteriseren van lipide nanodeeltjes voor genafgifte met behulp van een microfluïdisch mengplatform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Dit protocol kan worden gebruikt om nucleïnezuur ingekapselde lipide nanodeeltjes te produceren met een hoge reproduceerbaarheid en snelheid en lage volumes. De formuleringsparameters kunnen worden afgestemd om een gewenste bioverdeling te bereiken op basis van de klinische toepassing. Het standaard visgraatontwerp van de microfluïdische cartridge maakt een snelle, nauwkeurige en gecontroleerde laminaire stroom tijdens het mengen mogelijk.De methode is vatbaar voor schaalvergroting en genereert uniforme, sterk ingekapselde deeltjes. Omdat de meeste commercieel goedgekeurde gentherapieproducten afhankelijk zijn van virale methoden, kan deze procedure inzicht geven in de genafgifte, omdat de niet-virale aanpak toepassingen mogelijk maakt waarvoor herhaalde toediening noodzakelijk is. Begin met het toevoegen van de juiste hoeveelheid van elke vloeibare bouillonoplossing aan een glazen injectieflacon met intermitterende vortexing.zoals aangegeven in de tabel, gevolgd door de toevoeging van 200 bewijsethanol aan een eindvolume van 533 microliter. Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid mRNA-voorraad toe en verdun met citraatbuffer om een eindvolume van 1,5 milliliter bij de gewenste concentratie te bereiken. Om de microfluïdische kanalen te primen, voert u eerst de primingparameter in de instrumentsoftware in zoals beschreven in de tabel.Open vervolgens het deksel van het instrument en plaats een microfluïdische patroon in het roterende blok. Laad ten minste 500 microliter ethanol in een spuit van 1 milliliter, zorg ervoor dat er geen bellen of luchtspleten aan de punt van de spuit zitten en steek de spuit in de rechterinlaat van de patroon. Laad een spuit van vijf milliliter met 1,5 milliliter citraatbuffer, zorg ervoor dat er geen luchtbellen of openingen zijn en steek de spuit in de linkerinlaat van de patroon.Plaats twee conische buizen van 15 milliliter in de cliphouders om als afvalcontainers te dienen en klik op Go"om de oplossingen te mengen. Wanneer het instrument stopt met primen zoals aangegeven door het uitschakelen van het blauwe lampje aan de onderkant, opent u de late en gooit u de conische buizen en spuiten op de juiste manier weg. Stel voor de vorming van lipide nanodeeltjes de juiste formuleringsparameters in zoals aangegeven in de tabel en laad een spuit van 1 milliliter met een eerder bereid lipidenmengsel.Verwijder eventuele luchtspleten of bubbels in de punt van de spuit en steek de spuit in de rechterkant van de patroon. Laad de eerder bereide nucleïnezuuroplossing in een spuit van 3 milliliter, zorg ervoor dat er geen bellen of luchtspleten in de punt van de spuit zitten en steek de spuit in de linkerinlaat van de patroon. Plaats een RNAasevrije conische buis van 15 milliliter met het label monsternaam in de linkerbuisclip en plaats een 15 milliliter afval conisch in de rechterbuisclip.Sluit het deksel van het instrument en klik op Go.De lipide- en mRNA-oplossingen stromen door de microfluïdische cartridge en de lipide nanodeeltjesoplossing wordt verzameld in de conische buizen. Houd de conische buis aan het einde van het formuleringsproces vast en verdun vervolgens de lipide nanodeeltjes met 5 milliliter PBS en een biologische veiligheidskast. Om een bufferuitwisseling uit te voeren, wast u eerst een ultracentrifugefilter van 100 kilodalton poriegrootte voor met 2 milliliter PBS, centrifuge en leegt u vervolgens de PBS vanuit het onderste compartiment.Voeg de verdunde lipide nanodeeltjes toe aan het bovenste compartiment van het voorgewassen ultracentrifugefilter voor drie centrifugewasbeurten, gooi de doorstroming weg en voeg 5 milliliter PBS toe aan het ultracentrifugefilter na de eerste twee wasbeurten. Pipetteer na de laatste wasbeurt de lipide nanodeeltjesoplossing een paar keer tegen de wanden van het ultracentrifugefilter om het verlies van nanodeeltjes te minimaliseren voordat de nanodeeltjesoplossing wordt overgebracht naar een nucleasevrije injectieflacon. Voeg vervolgens PBS toe om de suspensie van de nanodeeltjes zo nodig in de juiste experimentele concentratie en volume te brengen.Om de inkapselingsefficiëntie van de lipide nanodeeltjes te beoordelen, bereidt u eerst tweevoudige seriële verdunningen van werkende nucleïnezuuroplossing in PBS om een standaardcurve te genereren, beginnend bij 500 nanogram per milliliter en met ten minste vijf verdunningen. Bereid vervolgens de verdunningen van het nanodeeltjesmonster in PBS voor om een geschikte theoretische concentratie te bereiken die rond het middelpunt van de standaardcurve ligt. Bereid vervolgens het ribogroene RNA-reagens voor om de aanwezigheid van RNA zowel binnen als buiten het lipide nanodeeltje te detecteren door de juiste hoeveelheden RNA-reagens, Triton X100 en PBS, te mengen.Om vervolgens de aanwezigheid van RNA buiten het vloeibare nanodeeltje te detecteren, mengt u de juiste hoeveelheden RNA-reagentia en alleen PBS. Laad repliceert van de nucleïnezuurstandaard en lipide nanodeeltjesoplossingen in een zwarte fluorescentie-capabele 96-putplaat, voeg vervolgens een gelijk volume RNA-kwantificeringsreagens toe met en zonder Triton X100 aan de standaard en monsterrepliceert. Schud de plaat in de plaatlezer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht om een grondige menging van de monsters te verkrijgen en meet vervolgens de fluorescentie op een microplaatlezer bij een excitatiegolflengte van 480 nanometer en een emissiegolflengte van 520 nanometer.Om de hydrodynamische grootte en polydispergeeriteit van de lipide nanodeeltjes te meten, verdunt u eerst de nanodeeltjesoplossing 40 keer in PBS en voegt u de oplossing toe aan een semi-microcuvet. Laad de cuvette op de Zetasizer en selecteer een standaard bedieningsprocedure om het instrument in te stellen om de nanodeeltjes te meten op basis van hun materiaal, dispergeermiddel, temperatuur en celtype. Klik vervolgens op Start om de hydrodynamische grootte en polydispergeeriteit van de lipide nanodeeltjes te meten.Om het Zeta-potentieel van lipide nanodeeltjes te meten, verdunt u de nanodeeltjesoplossing 40 keer in nucleasevrij water en laadt u de oplossing in een cuvette naar de vullijn. Laad de cuvette in een Zeta-potentiaalanalysator, zorg ervoor dat de elektroden contact maken met het instrument en stel het instrument in om de Zeta-potentiaal te meten volgens de specifieke samenstelling van de lipide nanodeeltjes. Klik vervolgens op Start"om het Zeta lipide nanodeeltjespotentiaal te meten.In deze analyse werden meerdere batches lipide nanodeeltjes met dezelfde lipideformulering en amine/fosfaatverhouding op afzonderlijke dagen ontwikkeld om de reproduceerbaarheid van de techniek aan te tonen. Zoals waargenomen, vertoonden batches één en twee overlappende grootteverdelingen met een vergelijkbare polydispergeeriteit, zonder significante verschillen waargenomen in de grootte of inkapselingsefficiëntie tussen de batches. Doorgaans veroorzaken veranderingen in de formuleringsparameters enkele kleine maar statistisch significante verschillen.Het verlagen van de amine-fosfaatverhouding resulteert bijvoorbeeld in een afname van 4% in de inkapselingsefficiëntie, met een gelijktijdige toename van de hydrodynamische diameter van de nanodeeltjes. Lipide nanodeeltjes geformuleerd met verschillende ioniseerbare lipiden maar dezelfde amine-fosfaatverhouding, vertonen een significante verandering in de inkapselingsefficiëntie en kleine verschillen in de deeltjesdiameter. De inkapseling van plasmide-DNA resulteert in grotere deeltjes in vergelijking met mRA die lipide nanodeeltjes inkapselen, hoewel beide soorten nanodeeltjes een vergelijkbare inkapselingsefficiëntie vertonen.Veranderingen in de stroomsnelheidsprocesparameter hebben echter geen invloed op de ontwikkeling van lipide nanodeeltjes. Lipide nanodeeltjes hebben geweldige toepassingen, het perfecte voorbeeld zijn de onlangs goedgekeurde COVID-19-vaccins. Deze techniek dient als een geweldige gereedschapsset en maakt de weg vrij voor toekomstige toepassingen door screening van de formulering van de onderste ledematen mogelijk te maken.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Levering en Transfectie in Human alvleesklierkankercellen met epidermale groeifactor receptor-gerichte Gelatine-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Het analyseren van Mengen Inhomogeniteit in een microfluïdische apparaat door Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipidenanodeeltjes (SLN) voor intracellulaire targeting Toepassingen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluïdische Platform met multiplexverzending elektronische detectie voor ruimtelijke Tracking van Deeltjes

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Een Microfluidic Platform voor het longitudinale beeldvorming in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...