Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Merci à Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger et Philip Zakas pour leurs conseils et leurs contributions au développement de LNP.

Un schéma de l’ensemble du processus est fourni à la figure 1.
1. Préparation des tampons
REMARQUE: Le filtrage stérile des tampons est fortement suggéré ici pour éliminer toutes les particules qui peuvent avoir un impact sur la qualité de l’acide nucléique et du LNP.
<ol><li>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)<ol>
<li>Préparer 1x PBS en utilisant 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4,<...

<ol>
	<li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery.">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li><li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).</li><li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. 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New England BioLabs Inc Available from: <a target="_blank" href="https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas">https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas</a> (2020)</li><li>Kastner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+manufacturing+of+size-tuned+liposomes+by+a+new+microfluidics+method+using+enhanced+statistical+tools+for+characterization.">High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).</li><li>Zhigaltsev, I. 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La reproductibilité, la rapidité et le criblage à faible volume sont des avantages importants de l’utilisation du mélange microfluidique pour former des LLP par rapport à d’autres méthodes existantes (par exemple, l’hydratation du film lipidique et l’injection d’éthanol). Nous avons démontré la reproductibilité de cette méthode sans impact sur l’efficacité d’encapsulation ou la taille des particules observée avec différents lots LNP. Il s’agit d’un critère essentiel pour que tout traiteme...

Les transporteurs de médicaments sont utilisés pour protéger et délivrer un traitement aux propriétés favorables typiques, notamment une faible cytotoxicité, une biodisponibilité accrue et une stabilité améliorée1,2,3. Les nanoparticules polymères, les micelles et les particules à base de lipides ont déjà été explorées pour l’encapsulation et la livraison d’acides nucléiques4,5,6,7. Les lipides ont été utilisés dans différents types de systèmes de nanotransporteurs, y compris les liposomes, et les nanoparticules lipidiques, car ils sont biocompatibles avec une grande stabilité8. Les LNPs peuvent facilement encapsuler les acides nucléiques pour l’administration de gènes9,10. Ils protègent l’acide nucléique de la dégradation par les protéases sériques au cours de la circulation systémique11 et peuvent améliorer l’administration à des sites spécifiques, car la topographie de surface et les propriétés physiques des LNP influencent leur biodistribution12. Les LLP améliorent également la pénétration tissulaire et l’absorption cellulaire9. Des études antérieures ont démontré le succès de l’encapsulation du siRNA dans un LNP13, y compris le premier LNP disponible dans le commerce contenant du siRNA thérapeutique pour le traitement de la polyneuropathie du traitement héréditaire de l’amylose héréditaire médiée par la transthyrétine14 qui a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis et l’Agence européenne des médicaments en 2018. Plus récemment, les LNP sont à l’étude pour l’administration de fractions d’acides nucléiques plus importantes, à savoir l’ARNm et l’ADN9. En 2018, il y avait ~ 22 systèmes d’administration d’acides nucléiques à base de lipides en cours d’essais cliniques14. De plus, les ARNm contenant des LLP sont actuellement les principaux candidats et ont été utilisés pour un vaccin contre laCOVID-19 15,16. Le succès potentiel de ces thérapies géniques non virales nécessite la formation de petites particules (~ 100 nm), stables et uniformes avec une encapsulation élevée de l’acide nucléique.
L’utilisation d’un lipide ionisable comme composant principal dans la formulation LNP a montré des avantages pour la complexation, l’encapsulation et l’efficacité de l’administration14. Les lipides ionisables ont généralement une constante de dissociation acide (pKa) < 7; par exemple, le dilinoleylméthyl-4-diméthylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), le lipide ionisable utilisé dans la formulation LNP approuvée par la FDA, a un pKa de 6,4417. À faible pH, les groupes amines sur le lipide ionisable deviennent protonés et chargés positivement, ce qui permet l’assemblage avec des groupes phosphate chargés négativement sur l’ARNm et l’ADN. Le rapport des groupes amine, « N », aux groupes phosphate, « P », est utilisé pour optimiser l’assemblage. Le rapport N/P dépend des lipides et des acides nucléiques utilisés, qui varie en fonction de la formulation18. Après la formation, le pH peut être ajusté à un pH neutre ou physiologique pour permettre l’administration thérapeutique. À ces valeurs de pH, le lipide ionisable est également déprotoné, ce qui confère une charge de surface neutre au LNP.
Le lipide ionisable aide également à l’évasion endosomale19,20. Les LNP subissent une endocytose pendant l’absorption cellulaire et doivent être libérés de l’endosome afin de délivrer la cargaison d’ARNm dans le cytoplasme cellulaire ou la cargaison d’ADN au noyau21. À l’intérieur de l’endosome se trouve généralement un environnement plus acide que le milieu extracellulaire, ce qui rend le lipide ionisable chargé positivement22,23. Le lipide ionisable chargé positivement peut interagir avec des charges négatives sur la membrane lipidique endosomale, ce qui peut provoquer une déstabilisation de l’endosome permettant la libération du LNP et de l’acide nucléique. Différents lipides ionisables sont actuellement à l’étude pour améliorer l’efficacité de la distribution de la LNP, ainsi que de l’échappement endosomale14.
D’autres composants typiques d’un LNP comprennent les lipides d’aide, tels qu’un lipide de phosphatidylcholine (PC) ou de phosphoéthanolamine (PE). La 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE), la 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et la 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) sont des lipides d’aide couramment utilisés24,25. Il a été démontré que le DOPE forme une phase HEXAGONALE II inversée (HII) et améliore la transfection par fusion membranaire26,tandis que le DSPC a été pensé pour stabiliser les LNP avec sa géométrie cylindrique27. Le cholestérol est également incorporé dans la formulation afin d’augmenter la rigidité de la membrane, aidant ainsi à la stabilité du LNP. Enfin, le polyéthylène glycol conjugué aux lipides (PEG) est inclus dans la formulation pour fournir la barrière stérique nécessaire pour aider à l’auto-assemblage des particules27. Peg améliore également la stabilité de stockage des LNPs en empêchant l’agrégation. De plus, le PEG est souvent utilisé comme composant furtif et peut augmenter le temps de circulation des LLP. Cependant, cet attribut peut également poser des défis pour le recrutement des LNP en hépatocytes par le biais d’un mécanisme de ciblage endogène piloté par l’apolipoprotéine E (ApoE)28. Ainsi, des études ont étudié la longueur de la chaîne acyle pour la diffusion du PEG à partir du LNP, constatant que les longueurs courtes (C8-14) se dissocient du LNP et se prêtent mieux au recrutement d’ApoE par rapport aux longueurs d’acyle plus longues28. De plus, il a été démontré que le degré de saturation de la queue lipidique à laquelle le PEG est conjugué influence la distribution tissulaire des LLP29. Récemment, Tween 20, qui est un tensioactif couramment utilisé dans les formulations de produits pharmaceutiques biologiques et a une longue queue lipidique insaturée, s’est avéré avoir une transfection élevée dans les ganglions lymphatiques drainants par rapport au PEG-DSPE, qui transfectait en grande partie le muscle au site d’injection29. Ce paramètre peut être optimisé pour obtenir la biodistribution LNP souhaitée.
Les méthodes conventionnelles de formation de LNPs comprennent la méthode d’hydratation en couche mince et la méthode d’injectiond’éthanol 27. Bien qu’il s’agit de techniques facilement disponibles, elles exigent également beaucoup de main-d’œuvre, peuvent entraîner une faible efficacité d’encapsulation et sont difficiles à mettre à l’échelle27. Les progrès dans les techniques de mélange ont abouti à des méthodes plus faciles à mettre à l’échelle, tout en développant des particules plus uniformes27. Ces méthodes comprennent le mélange de jonction en T, le mélange à chevrons décalé et la focalisation hydrodynamique microfluidique27. Chaque méthode a une structure unique, mais toutes permettent de mélanger rapidement une phase aqueuse contenant l’acide nucléique avec une phase organique contenant les composants lipidiques, ce qui entraîne une encapsulation élevée de l’acide nucléique27. Dans ce protocole, un mélange rapide et contrôlé à travers une cartouche microfluidique est utilisé, qui utilise la conception de mélange à chevrons décalé. Ce protocole décrit la préparation, l’assemblage et la caractérisation des acides nucléiques contenant des LLP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

Les transporteurs de médicaments à base de lipides ont été utilisés pour les systèmes d’administration cliniquement et commercialement disponibles en raison de leur petite taille, de leur biocompatibilité et de leur grande efficacité d’encapsulation. L’utilisation de nanoparticules lipidiques (LNPs) pour encapsuler les acides nucléiques est avantageuse pour protéger l’ARN ou l’ADN de la dégradation, tout en favorisant l’absorption cellulaire. Les LLP contiennent souvent plusieurs composants lipidiques, y compris un lipide ionisable, un lipide d’aide, du cholestérol et un lipide conjugué en polyéthylène glycol (PEG). Les LNPs peuvent facilement encapsuler les acides nucléiques en raison de la présence de lipides ionisables, qui, à faible pH, est cationique et permet une complexation avec de l’ARN ou de l’ADN chargé négativement. Ici, les LNPs sont formés en encapsulant l’ARN messager (ARNm) ou l’ADN plasmidique (ADNp) en mélangeant rapidement les composants lipidiques dans une phase organique et le composant acide nucléique dans une phase aqueuse. Ce mélange est effectué à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique précise, permettant l’auto-assemblage des nanoparticules tout en maintenant le flux laminaire. La taille hydrodynamique et la polydispersité sont mesurées à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). La charge de surface effective sur le LNP est déterminée en mesurant le potentiel zêta. L’efficacité d’encapsulation est caractérisée à l’aide d’un colorant fluorescent pour quantifier l’acide nucléique piégé. Des résultats représentatifs démontrent la reproductibilité de cette méthode et l’influence des différents paramètres de formulation et de procédé sur les LNP développés.

Plusieurs lots de LNP avec la même formulation lipidique et le même rapport N/P de 6 ont été développés sur des jours distincts pour démontrer la reproductibilité de la technique. Les lots 1 et 2 ont entraîné des distributions de taille qui se chevauchent avec une polydispersité similaire (Figure 2A) Aucune différence significative n’a été observée dans la taille ou l’efficacité d’encapsulation entre les deux lots différents (<strong cl...

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Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Les nanoparticules lipidiques sont développées à l’aide d’une approche de plate-forme de mélange microfluidique pour l’encapsulation de l’ARNm et de l’ADN.

Formulation et caractérisation de nanoparticules lipidiques pour la livraison de gènes à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Ce protocole peut être utilisé pour produire des nanoparticules lipidiques encapsulées d’acide nucléique avec une reproductibilité et une vitesse élevées et de faibles volumes. Les paramètres de formulation peuvent être réglés pour obtenir une distribution biologique souhaitée en fonction de l’application clinique. La conception standard à chevrons de la cartouche microfluidique permet un écoulement laminaire rapide, précis et contrôlé pendant le mélange.La méthode se prête à la mise à l’échelle et génère des particules uniformes et hautement encapsulées. La plupart des produits de thérapie génique approuvés commercialement s’appuyant sur des méthodes virales, cette procédure peut fournir un aperçu de l’administration de gènes, car son approche non virale permet des applications pour lesquelles une administration répétée est nécessaire. Commencez par ajouter la quantité appropriée de chaque solution liquide sous forme de liquide dans un flacon en verre avec vortex intermittent.comme indiqué dans le tableau, suivi de l’ajout de 200 éthanol d’épreuve à un volume final de 533 microlitres. Ajoutez ensuite la quantité appropriée de stock d’ARNm et diluez avec un tampon de citrate pour obtenir un volume final de 1,5 millilitre à la concentration souhaitée. Pour amorcer les canaux microfluidiques, entrez d’abord le paramètre d’amorçage dans le logiciel de l’instrument comme indiqué dans le tableau.Ensuite, ouvrez le couvercle de l’instrument et placez une cartouche microfluidique dans le bloc rotatif. Chargez au moins 500 microlitres d’éthanol dans une seringue de 1 millilitre, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles ou d’espaces d’air à l’extrémité de la seringue et insérez la seringue dans l’entrée droite de la cartouche. Chargez une seringue de cinq millilitres avec 1,5 millilitre de tampon de citrate, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air ou d’espaces, et insérez la seringue dans l’entrée gauche de la cartouche.Placez deux tubes coniques de 15 millilitres dans les porte-clips pour servir de conteneurs à déchets et cliquez sur Go » pour mélanger les solutions. Lorsque l’instrument cesse de s’amorcer comme l’indique la lumière bleue inférieure qui s’éteint, ouvrez le tard et jetez correctement les tubes coniques et les seringues. Pour la formation de nanoparticules lipidiques, définissez les paramètres de formulation appropriés comme indiqué dans le tableau et chargez une seringue de 1 millilitre avec un mélange lipidique préalablement préparé.Retirez les trous d’air ou les bulles dans l’embout de la seringue et insérez la seringue dans le côté droit de la cartouche. Chargez la solution d’acide nucléique préalablement préparée dans une seringue de 3 millilitres, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles ou d’espaces d’air dans l’embout de la seringue, et insérez la seringue dans l’entrée gauche de la cartouche. Placez un tube conique sans ARN de 15 millilitres étiqueté avec le nom de l’échantillon dans le clip du tube gauche et placez un conique de déchets de 15 millilitres dans le clip du tube droit.Fermez le couvercle de l’instrument et cliquez sur Go.Les solutions de lipides et d’ARNm circuleront à travers la cartouche microfluidique et la solution de nanoparticules lipidiques sera collectée dans les tubes coniques. Conservez le tube conique à la fin du processus de formulation, puis diluez les nanoparticules lipidiques avec 5 millilitres de PBS et une armoire de sécurité biologique. Pour effectuer un échange tampon, prélavez d’abord un filtre ultracentrifuge de 100 kilodaltons de la taille d’un pore avec 2 millilitres de PBS, centrifugez, puis videz le PBS du compartiment inférieur.Ajouter les nanoparticules lipidiques diluées dans le compartiment supérieur du filtre ultracentrifuge prélavé pour trois lavages à la centrifugeuse, en éliminant le flux et en ajoutant 5 millilitres de PBS au filtre ultracentrifugeur après les deux premiers lavages. Après le dernier lavage, pipettez la solution de nanoparticules lipidiques contre les parois du filtre ultracentrifuge plusieurs fois pour minimiser la perte de nanoparticules avant de transférer la solution de nanoparticules dans un flacon sans nucléase. Ajoutez ensuite du PBS pour amener la suspension de nanoparticules à la concentration expérimentale et au volume appropriés si nécessaire.Pour évaluer l’efficacité d’encapsulation des nanoparticules lipidiques, préparez d’abord deux dilutions en série de solution d’acide nucléique de travail dans PBS pour générer une courbe standard, à partir de 500 nanogrammes par millilitre et en effectuant au moins cinq dilutions. Ensuite, préparez les dilutions de l’échantillon de nanoparticules dans le PBS pour obtenir une concentration théorique appropriée qui se situe autour du point médian de la courbe standard. Ensuite, préparez le réactif d’ARN vert ribo pour détecter la présence d’ARN à l’intérieur et à l’extérieur de la nanoparticule lipidique en mélangeant les quantités appropriées de réactif d’ARN, Triton X100 et PBS.Ensuite, pour détecter la présence d’ARN à l’extérieur de la nanoparticule liquide, mélangez les quantités appropriées de réactifs d’ARN et de PBS uniquement. Les réplications de charge de l’étalon d’acide nucléique et des solutions de nanoparticules lipidiques dans une plaque noire de 96 puits capable de fluorescence, puis ajoutent un volume égal de réactif de quantification de l’ARN avec et sans Triton X100 à l’étalon et l’échantillon se réplique. Agiter la plaque dans le lecteur de plaques pendant cinq minutes à température ambiante à l’abri de la lumière pour obtenir un mélange complet des échantillons, puis mesurer la fluorescence sur un lecteur de microplaques à une longueur d’onde d’excitation de 480 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 520 nanomètres.Pour mesurer la taille hydrodynamique et la polydispersité des nanoparticules lipidiques, diluez d’abord la solution de nanoparticules 40 fois dans du PBS et ajoutez la solution à une semi micro cuvette. Chargez la cuvette sur le Zetasizer et choisissez une procédure d’utilisation standard pour régler l’instrument afin de mesurer les nanoparticules en fonction de leur matériau, de leur dispersant, de leur température et de leur type de cellule. Cliquez ensuite sur Démarrer pour mesurer la taille hydrodynamique et la polydispersité des nanoparticules lipidiques.Pour mesurer le potentiel zêta des nanoparticules lipidiques, diluer la solution de nanoparticules 40 fois dans de l’eau sans nucléase et charger la solution dans une cuvette jusqu’à la ligne de remplissage. Chargez la cuvette dans un analyseur de potentiel Zeta, en faisant attention à ce que les électrodes entrent en contact avec l’instrument, et réglez l’instrument pour mesurer le potentiel Zeta en fonction de la composition spécifique des nanoparticules lipidiques. Cliquez ensuite sur Démarrer pour mesurer le potentiel de nanoparticules lipidiques Zeta.Dans cette analyse, plusieurs lots de nanoparticules lipidiques avec la même formulation lipidique et le même rapport amine/phosphate ont été développés sur des jours distincts pour démontrer la reproductibilité de la technique. Comme on l’a observé, les lots un et deux présentaient des distributions de taille qui se chevauchaient avec une poly dispersion similaire, sans différence significative observée dans la taille ou l’efficacité d’encapsulation entre les lots. En règle générale, les changements dans les paramètres de formulation induisent des différences petites mais statistiquement significatives.Par exemple, la diminution du rapport amine/phosphate entraîne une diminution de 4% de l’efficacité d’encapsulation, avec une augmentation concomitante du diamètre hydrodynamique des nanoparticules. Les nanoparticules lipidiques formulées avec différents lipides ionisables mais le même rapport amine/phosphate, présentent un changement significatif dans l’efficacité d’encapsulation ainsi que de légères différences dans le diamètre des particules. L’encapsulation de l’ADN plasmidique donne des particules plus grosses par rapport aux mRA encapsulant des nanoparticules lipidiques, bien que les deux types de nanoparticules démontrent une efficacité d’encapsulation similaire.Cependant, les modifications apportées au paramètre du processus de débit n’ont pas d’impact sur le développement des nanoparticules lipidiques. Les nanoparticules lipidiques ont d’excellentes applications, l’exemple parfait étant les vaccins COVID-19 récemment approuvés. Cette technique constitue un excellent ensemble d’outils et ouvre la voie à de futures applications en permettant le dépistage de la formulation des membres inférieurs.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Livraison de gènes et transfection de cellules humaines de cancer du pancréas en utilisant facteur de croissance épidermique ciblant les récepteurs des base de gélatine nanovecteurs Conçu

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Recherche

Bio-ingénierie

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bicouche lipidique des vésicules génération utilisant microfluidique jets

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analyse Inhomogénéité mélange dans un dispositif microfluidique par Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solide Lipid nanoparticules (SLN) Applications pour le ciblage intracellulaire

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Plate-forme microfluidique avec multiplexée Détection électronique pour le suivi spatial des particules

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Une plate-forme microfluidique d’imagerie longitudinales chez Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...