Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Vielen Dank an Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger und Philip Zakas für ihre Anleitung und Beiträge zur LNP-Entwicklung.

Ein Schema des Gesamtprozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Vorbereitung von Puffern
HINWEIS: Eine sterile Filterung der Puffer wird hier dringend empfohlen, um Partikel zu entfernen, die die Nukleinsäure- und LNP-Qualität beeinträchtigen können.
<ol><li>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)<ol>
<li>Bereiten Sie 1x PBS mit 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl und 2,7 mM KCl in ...

<ol>
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Reproduzierbarkeit, Geschwindigkeit und Screening mit geringem Volumen sind wesentliche Vorteile der Verwendung von mikrofluidischer Mischung zur Bildung von LNPs im Vergleich zu anderen bestehenden Methoden (z. B. Lipidfilmhydratation und Ethanolinjektion). Wir haben die Reproduzierbarkeit dieser Methode ohne Einfluss auf die Verkapselungseffizienz oder Partikelgröße demonstriert, die bei verschiedenen LNP-Chargen beobachtet wurde. Dies ist ein wesentliches Kriterium für jedes Therapeutikum, einschließlich LNPs, um ...

Arzneimittelträger werden verwendet, um ein Therapeutikum mit typischen günstigen Eigenschaften zu schützen und zu liefern, einschließlich niedriger Zytotoxizität, erhöhter Bioverfügbarkeit und verbesserter Stabilität1,2,3. Polymere Nanopartikel, Mizellen und lipidbasierte Partikel wurden zuvor für die Verkapselung und Abgabe von Nukleinsäuren untersucht4,5,6,7. Lipide wurden in verschiedenen Arten von Nanocarrier-Systemen verwendet, einschließlich Liposomen und Lipid-Nanopartikeln, da sie biokompatibel mit hoher Stabilität sind8. LNPs können Leicht nukleinsäuren für die Genabgabe verkapseln9,10. Sie schützen die Nukleinsäure vor dem Abbau durch Serumproteasen während der systemischenZirkulation 11 und können die Abgabe an bestimmte Stellen verbessern, da die Oberflächentopographie und die physikalischen Eigenschaften von LNPs ihre Bioverteilung beeinflussen12. LNPs verbessern auch die Gewebepenetration und die Zellaufnahme9. Frühere Studien haben den Erfolg der siRNA-Verkapselung innerhalb eines LNP13gezeigt, einschließlich des ersten kommerziell erhältlichen LNP-haltigen siRNA-Therapeutikums zur Behandlung der Polyneuropathie der hereditären Transthyretin-vermittelten Amyloidose14-Behandlung, die 2018 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel-Agentur zugelassen wurde. In jüngerer Zeit werden LNPs für die Abgabe größerer Nukleinsäureseilen untersucht, nämlich mRNA und DNA9. Ab 2018 gab es ~ 22 lipidbasierte Nukleinsäure-Verabreichungssysteme, die sich klinischen Studien unterzogen14. Darüber hinaus sind mRNA-haltige LNPs derzeit führende Kandidaten und wurden für einen COVID-19-Impfstoffeingesetzt 15,16. Der potenzielle Erfolg dieser nicht-viralen Gentherapien erfordert die Bildung kleiner (~ 100 nm), stabiler und gleichmäßiger Partikel mit hoher Verkapselung der Nukleinsäure.
Die Verwendung eines iionisierbaren Lipids als Hauptkomponente in der LNP-Formulierung hat Vorteile für die Komplexierung, Verkapselung und Abgabeeffizienz gezeigt14. Ianisierbare Lipide haben typischerweise eine Säuredissoziationskonstante (pKa) < 7; Beispielsweise hat Dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrat (D-Lin-MC3-DMA), das iionisierbare Lipid, das in der fda zugelassenen LNP-Formulierung verwendet wird, einen pKa von 6,4417. Bei niedrigem pH-Wert werden die Amingruppen auf dem iionierbaren Lipid protoniert und positiv geladen, was die Montage mit negativ geladenen Phosphatgruppen auf mRNA und DNA ermöglicht. Das Verhältnis von Amin, "N", Gruppen zu Phosphat, "P", Gruppen wird verwendet, um die Montage zu optimieren. Das N/P-Verhältnis ist abhängig von den verwendeten Lipiden und Nukleinsäuren, was je nach Formulierungvariiert 18. Nach der Bildung kann der pH-Wert auf einen neutralen oder physiologischen pH-Wert eingestellt werden, um eine therapeutische Verabreichung zu ermöglichen. Bei diesen pH-Werten wird auch das iionierbare Lipid deprotoniert, was dem LNP eine neutrale Oberflächenladung verleiht.
Das iionierbare Lipid hilft auch bei der endosomalen Flucht19,20. LNPs durchlaufen während der zellulären Aufnahme eine Endozytose und müssen aus dem Endosom freigesetzt werden, um die mRNA-Ladung in das Zellzytoplasma oder die DNA-Ladung in den Zellkern21zu liefern. Im Inneren des Endosoms befindet sich typischerweise eine saurere Umgebung als das extrazelluläre Medium, wodurch das iionisierbare Lipid positiv geladen wird22,23. Das positiv geladene inisierbare Lipid kann mit negativen Ladungen auf der endoosomalen Lipidmembran interagieren, was zu einer Destabilisierung des Endosoms führen kann, was die Freisetzung von LNP und Nukleinsäure ermöglicht. Verschiedene inizierbare Lipide werden derzeit untersucht, um die Wirksamkeit sowohl der LNP-Verteilung als auch der endosomalen Flucht zu verbessern14.
Andere typische Bestandteile eines LNP sind Helferlipide, wie ein Phosphatidylcholin (PC) oder Phosphoethanolamin (PE) Lipid. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) sind häufig verwendeteHilfslipide 24,25. Es wurde gezeigt, dass DOPE eine invertierte hexagonale II (HII) -Phase bildet und die Transfektion durchMembranfusion 26verbessert, während DSPC mit seiner zylindrischen Geometrie27als stabilisierend angesehen wurde. Cholesterin wird auch in die Formulierung aufgenommen, um die Membransteifigkeit zu erhöhen und anschließend die Stabilität des LNP zu unterstützen. Schließlich ist lipidkonjugiertes Polyethylenglykol (PEG) in der Formulierung enthalten, um die notwendige sterische Barriere zur Unterstützung der Partikelselbstorganisation bereitzustellen27. PEG verbessert auch die Speicherstabilität von LNPs, indem es die Aggregation verhindert. Darüber hinaus wird PEG häufig als Stealth-Komponente verwendet und kann die Umlaufzeit für die LNPs erhöhen. Dieses Attribut kann jedoch auch Herausforderungen für die Rekrutierung von LNPs für Hepatozyten durch einen endogenen Targeting-Mechanismus darstellen, der von Apolipoprotein E (ApoE)28angetrieben wird. So haben Studien die Acylkettenlänge für die Diffusion von PEG aus dem LNP untersucht und festgestellt, dass kurze Längen (C8-14) vom LNP dissoziieren und für die ApoE-Rekrutierung im Vergleich zu längeren Acyllängen besser geeignet sind28. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der Sättigungsgrad des Lipidschwanzes, mit dem PEG konjugiert ist, die Gewebeverteilung von LNPs29beeinflusst. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Tween 20, ein häufig verwendetes Tensid in biologischen Arzneimittelformulierungen und einen langen ungesättigten Lipidschwanz aufwies, im Vergleich zu PEG-DSPE, das den Muskel an der Injektionsstelle weitgehend transfizierthat 29, eine hohe Transfektion in entwässernden Lymphknoten aufwies. Dieser Parameter kann optimiert werden, um die gewünschte LNP-Bioverteilung zu erreichen.
Konventionelle Methoden zur Bildung von LNPs umfassen die Dünnschichthydratationsmethode und die Ethanol-Injektionsmethode27. Während dies leicht verfügbare Techniken sind, sind sie auch arbeitsintensiv, können zu einer niedrigen Verkapselungseffizienz führen und sind schwierig zu skalieren27. Fortschritte in den Mischtechniken haben dazu geführt, dass Methoden leichter skaliert werden können, während gleichmäßigere Partikel entwickelt werden27. Diese Methoden umfassen T-Junction-Mixing, versetztes Fischgräten-Mischen und mikrofluidische hydrodynamische Fokussierung27. Jede Methode hat eine einzigartige Struktur, aber alle ermöglichen eine schnelle Vermischung einer wässrigen Phase, die die Nukleinsäure enthält, mit einer organischen Phase, die die Lipidkomponenten enthält, was zu einer hohen Verkapselung der Nukleinsäure27führt. In diesem Protokoll wird das schnelle und kontrollierte Mischen durch eine mikrofluidische Kartusche verwendet, die das gestaffelte Fischgräten-Mischdesign verwendet. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung, Montage und Charakterisierung von Nukleinsäure, die LNPs enthält.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

Lipidbasierte Arzneimittelträger wurden aufgrund ihrer geringen Größe, Biokompatibilität und hohen Verkapselungseffizienz für klinisch und kommerziell verfügbare Verabreichungssysteme verwendet. Die Verwendung von Lipidnanopartikeln (LNPs) zur Verkapselung von Nukleinsäuren ist vorteilhaft, um die RNA oder DNA vor dem Abbau zu schützen und gleichzeitig die zelluläre Aufnahme zu fördern. LNPs enthalten oft mehrere Lipidkomponenten, darunter ein iionierbares Lipid, ein Helferlipid, Cholesterin und ein konjugiertes Lipid aus Polyethylenglykol (PEG). LNPs können Nukleinsäuren aufgrund der iionisierbaren Lipidpräsenz, die bei niedrigem pH-Wert kationisch ist und eine Komplexierung mit negativ geladener RNA oder DNA ermöglicht, leicht verkapseln. Hier werden LNPs durch Verkapselung von Boten-RNA (mRNA) oder Plasmid-DNA (pDNA) durch schnelles Mischen der Lipidkomponenten in einer organischen Phase und der Nukleinsäurekomponente in einer wässrigen Phase gebildet. Diese Mischung wird mit einer präzisen mikrofluidischen Mischplattform durchgeführt, die eine Selbstorganisation von Nanopartikeln bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des laminaren Flusses ermöglicht. Die hydrodynamische Größe und Polydispersität werden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) gemessen. Die effektive Oberflächenladung am LNP wird durch Messung des Zetapotentials bestimmt. Die Verkapselungseffizienz wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff charakterisiert, um die eingefangene Nukleinsäure zu quantifizieren. Repräsentative Ergebnisse belegen die Reproduzierbarkeit dieser Methode und den Einfluss, den unterschiedliche Formulierungs- und Prozessparameter auf die entwickelten LNPs haben.

Mehrere Chargen von LNPs mit der gleichen Lipidformulierung und dem gleichen N/P-Verhältnis von 6 wurden an verschiedenen Tagen entwickelt, um die Reproduzierbarkeit der Technik zu demonstrieren. Charge 1 und 2 führten zu überlappenden Größenverteilungen mit ähnlicher Polydispersität (Abbildung 2A) Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Größe oder Verkapselungseffizienz zwischen den beiden verschiedenen Chargen beobachtet (<strong class="xfig...

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Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-Nanopartikel werden mit einem mikrofluidischen Mischplattformansatz für die mRNA- und DNA-Verkapselung entwickelt.

Formulierung und Charakterisierung von Lipid-Nanopartikeln für die Genabgabe mit einer mikrofluidischen Mischplattform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um nukleinsäureverkapselte Lipid-Nanopartikel mit hoher Reproduzierbarkeit und Geschwindigkeit und geringen Volumina herzustellen. Die Formulierungsparameter können abgestimmt werden, um eine gewünschte Bioverteilung basierend auf der klinischen Anwendung zu erreichen. Das Standard-Fischgrätendesign der mikrofluidischen Kartusche ermöglicht eine schnelle, präzise und kontrollierte laminare Strömung während des Mischens.Das Verfahren ist skalierbar und erzeugt gleichmäßige, stark verkapselte Partikel. Da die meisten kommerziell zugelassenen Gentherapieprodukte auf viralen Methoden basieren, kann dieses Verfahren Einblicke in die Genabgabe geben, da sein nicht-viraler Ansatz Anwendungen ermöglicht, für die eine wiederholte Dosierung erforderlich ist. Beginnen Sie mit der Zugabe der entsprechenden Menge jeder flüssigen Stammlösung zu einer Glasfläschchen mit intermittierendem Wirbeln.wie in der Tabelle angegeben, gefolgt von der Zugabe von 200 Proof-Ethanol zu einem Endvolumen von 533 Mikrolitern. Dann die entsprechende Menge an mRNA-Stamm hinzufügen und mit Citratpuffer verdünnen, um ein Endvolumen von 1,5 Millilitern in der gewünschten Konzentration zu erreichen. Um die mikrofluidischen Kanäle zu grundieren, geben Sie zunächst den Priming-Parameter wie in der Tabelle beschrieben in die Gerätesoftware ein.Öffnen Sie als Nächstes den Instrumentendeckel und legen Sie eine mikrofluidische Patrone in den rotierenden Block. Laden Sie mindestens 500 Mikroliter Ethanol in eine 1-Milliliter-Spritze, achten Sie darauf, dass sich an der Spritzenspitze keine Blasen oder Luftspalte befinden, und führen Sie die Spritze in den rechten Einlass der Patrone ein. Laden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit 1,5 Milliliter Citratpuffer, achten Sie darauf, dass keine Luftblasen oder Lücken vorhanden sind, und führen Sie die Spritze in den linken Einlass der Patrone ein.Legen Sie zwei 15 Milliliter konische Rohre in die Cliphalter, die als Abfallbehälter dienen, und klicken Sie auf "Go", um die Lösungen zu mischen. Wenn das Instrument aufhört zu grundieren, wie durch das abschaltende blaue Licht unten angezeigt, öffnen Sie das späte und entsorgen Sie die konischen Röhren und Spritzen ordnungsgemäß. Für die Bildung von Lipidnanopartikeln stellen Sie die entsprechenden Formulierungsparameter wie in der Tabelle angegeben ein und laden Sie eine 1-Milliliter-Spritze mit einer zuvor vorbereiteten Lipidmischung auf.Entfernen Sie alle Luftspalte oder Blasen in der Spritzenspitze und setzen Sie die Spritze in die rechte Seite der Patrone ein. Laden Sie die zuvor hergestellte Nukleinsäurelösung in eine 3-Milliliter-Spritze, achten Sie darauf, dass sich keine Blasen oder Luftspalte in der Spritzenspitze befinden, und führen Sie die Spritze in den linken Einlass der Patrone ein. Legen Sie ein 15 Milliliter RNAase-freies konisches RNAase-Röhrchen mit dem Probennamen in den linken Röhrchenclip und legen Sie ein 15 Milliliter Abfallkonisch in den rechten Röhrchenclip.Schließen Sie den Instrumentendeckel und klicken Sie auf Go.Die Lipid- und mRNA-Lösungen fließen durch die mikrofluidische Kartusche und die Lipid-Nanopartikellösung wird in den konischen Röhrchen gesammelt. Behalten Sie das konische Röhrchen am Ende des Formulierungsprozesses bei und verdünnen Sie dann die Lipidnanopartikel mit 5 Millilitern PBS und einer biologischen Sicherheitswerkbank. Um einen Pufferaustausch durchzuführen, waschen Sie zuerst einen 100 Kilodalton Porengroßen-Ultrazentrifugenfilter mit 2 Millilitern PBS, Zentrifuge, vor und entleeren Sie dann das PBS aus dem unteren Fach.Die verdünnten Lipid-Nanopartikel werden für drei Zentrifugenwäschen in das obere Fach des vorgewaschenen Ultrazentrifugenfilters geben, den Durchfluss entsorgen und dem Ultrazentrifugenfilter nach den ersten beiden Wäschen 5 Milliliter PBS zugefügen. Nach der letzten Wäsche pipetten Sie die Lipid-Nanopartikellösung einige Male gegen die Wände des Ultrazentrifugenfilters, um den Nanopartikelverlust zu minimieren, bevor Sie die Nanopartikellösung in eine nukleasefreie Durchstechflasche überführt. Fügen Sie dann PBS hinzu, um die Nanopartikelsuspension bei Bedarf auf die entsprechende experimentelle Konzentration und das entsprechende Volumen zu bringen.Um die Verkapselungseffizienz der Lipid-Nanopartikel zu beurteilen, bereiten Sie zunächst zweifache serielle Verdünnungen der arbeitenden Nukleinsäurelösung in PBS vor, um eine Standardkurve zu erzeugen, beginnend mit 500 Nanogramm pro Milliliter und mindestens fünf Verdünnungen. Als nächstes bereiten Sie die Nanopartikelprobenverdünnungen in PBS vor, um eine geeignete theoretische Konzentration zu erreichen, die um den Mittelpunkt der Standardkurve liegt. Bereiten Sie dann das ribogrüne RNA-Reagenz vor, um das Vorhandensein von RNA sowohl innerhalb als auch außerhalb des Lipidnanopartikels nachzuweisen, indem Sie die entsprechenden Mengen an RNA-Reagenz, Triton X100 und PBS mischen.Um dann das Vorhandensein von RNA außerhalb des flüssigen Nanopartikels nachzuweisen, mischen Sie nur die entsprechenden Mengen an RNA-Reagenzien und PBS. Laden Sie Replikate des Nukleinsäurestandards und Lipid-Nanopartikellösungen in eine schwarze fluoreszenzfähige 96-Well-Platte, fügen Sie dann ein gleiches Volumen an RNA-Quantifizierungsreagenz mit und ohne Triton X100 zum Standard hinzu und proben repliziert. Schütteln Sie die Platte im Plattenleser fünf Minuten lang bei Lichttemperatur, um eine gründliche Durchmischung der Proben zu erhalten, und messen Sie dann die Fluoreszenz auf einem Mikroplattenleser bei einer Anregungswellenlänge von 480 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 520 Nanometern.Um die hydrodynamische Größe und Polydispersität der Lipid-Nanopartikel zu messen, verdünnen Sie zuerst die Nanopartikellösung 40-mal in PBS und geben Sie die Lösung in eine Halbmikroküvette. Laden Sie die Küvette auf den Zetasizer und wählen Sie ein Standardarbeitsverfahren, um das Instrument so einzustellen, dass die Nanopartikel nach Material, Dispergiermittel, Temperatur und Zelltyp gemessen werden. Klicken Sie dann auf Start", um die hydrodynamische Größe und Polydispergierigkeit der Lipidnanopartikel zu messen.Um das Zeta-Potential von Lipid-Nanopartikeln zu messen, verdünnen Sie die Nanopartikellösung 40-mal in nukleasefreiem Wasser und laden Sie die Lösung in eine Küvette zur Fülllinie. Laden Sie die Küvette in einen Zeta-Potentialanalysator, achten Sie darauf, dass die Elektroden mit dem Instrument in Kontakt kommen, und stellen Sie das Instrument so ein, dass das Zeta-Potential entsprechend der spezifischen Zusammensetzung der Lipid-Nanopartikel gemessen wird. Klicken Sie dann auf Start", um das Zeta-Lipid-Nanopartikelpotenzial zu messen.In dieser Analyse wurden an verschiedenen Tagen mehrere Chargen von Lipidnanopartikeln mit der gleichen Lipidformulierung und dem gleichen Amin-Phosphat-Verhältnis entwickelt, um die Reproduzierbarkeit der Technik zu demonstrieren. Wie beobachtet, wiesen die Chargen eins und zwei überlappende Größenverteilungen mit einer ähnlichen Polydispergierigkeit auf, wobei keine signifikanten Unterschiede in der Größe oder Verkapselungseffizienz zwischen den Chargen beobachtet wurden. Typischerweise führen Änderungen der Formulierungsparameter zu kleinen, aber statistisch signifikanten Unterschieden.Zum Beispiel führt die Verringerung des Amin-Phosphat-Verhältnisses zu einer Abnahme der Verkapselungseffizienz um 4%, mit einer gleichzeitigen Erhöhung des hydrodynamischen Durchmessers der Nanopartikel. Lipid-Nanopartikel, die mit verschiedenen iionisierbaren Lipiden, aber dem gleichen Amin-Phosphat-Verhältnis formuliert sind, weisen eine signifikante Veränderung der Verkapselungseffizienz sowie leichte Unterschiede im Partikeldurchmesser auf. Die Verkapselung von Plasmid-DNA führt zu größeren Partikeln im Vergleich zu mRA-verkapselnden Lipid-Nanopartikeln, obwohl beide Arten von Nanopartikeln eine ähnliche Verkapselungseffizienz aufweisen.Änderungen des Prozessparameters der Durchflussrate haben jedoch keinen Einfluss auf die Lipid-Nanopartikel-Entwicklung. Lipid-Nanopartikel haben großartige Anwendungen, das perfekte Beispiel sind die kürzlich zugelassenen COVID-19-Impfstoffe. Diese Technik dient als großartiges Werkzeugset und ebnet den Weg für zukünftige Anwendungen, indem sie das Screening der Formulierung unterer Extremitäten ermöglicht.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gentransfer und Transfektion in humanen Pankreaskarzinom-Zellen mit Epidermal Growth Factor Gelatin-Based Engineered Nanovektoren Rezeptor-gezielte

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Forschung

Biotechnik

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analyse von Misch Inhomogenität in einer mikrofluidischen Vorrichtung von Microscale Schlieren Technik

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...