Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

תודה לאטול סלוג'ה, יאטין גוקארן, מריה-תרזה פראצ'יה, וולטר שוונגר ופיליפ זאקאס על הדרכתם ותרומתם לפיתוח LNP.

תרשים של התהליך הכולל מסופק באיור 1.
1. הכנת מאגרים
הערה: סינון סטרילי של המאגרים מומלץ מאוד כאן כדי להסיר כל חלקיקים אשר עשוי להשפיע על חומצת הגרעין ואיכות LNP.
<ol><li>תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS)<ol>
<li>הכן 1x PBS באמצעות 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4,...

<ol>
	<li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery.">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li><li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).</li><li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano+based+drug+delivery+systems:+recent+developments+and+future+prospects.">Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects.</a> J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).</li><li>Rai, R., Alwani, S., Badea, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles+in+gene+therapy:+New+avenues+of+design+and+optimization+for+delivery+applications.">Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications.</a> Polymers. 11 (4), 745 (2019).</li><li>Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+polymer+micelles+of+controlled+size,+stability,+and+functionality+for+siRNA+delivery.">Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery.</a> ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li><li>Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer+probing+of+assembly+and+disassembly+of+short+interfering+RNA/Poly(ethylene+glycol)-Poly-L-Lysine+polyion+complex+micelles.">F&#246;rster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles.</a> Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).</li><li>Puri, A., Loomis, K., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+nanoparticles+as+pharmaceutical+drug+carriers:+from+concepts+to+clinic.">Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic.</a> Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).</li><li>Cullis, P. R., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+systems+for+enabling+gene+therapies.">Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies.</a> Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).</li><li>Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+to+the+center+of+the+cell:+Current+Nanocarrier+design+strategies+targeting+biopharmaceuticals+to+the+cytoplasm+an+nucleus.">Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).</li><li>Zhao, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+gene+delivery.">Lipid nanoparticles for gene delivery.</a> Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+in+vivo+potency+of+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).</li><li>Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+delivery+systems+for+siRNA-based+therapeutics.">Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics.</a> Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).</li><li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies:+From+concepts+to+clinical+utility.">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).</li><li>Shin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+development+and+a+potential+nanomaterial+path+forward.">COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward.</a> Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).</li><li>Thanh Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COVID-19+vaccine+development+landscape.">The COVID-19 vaccine development landscape.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).</li><li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery.">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).</li><li>Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+lipid+nanoparticles.">mRNA lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2019).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Suzuki, Y., Ishihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+activity+and+uptake+mechanism+of+siRNA-lipid+nanoparticles+with+an+asymmetric+ionizable+lipid.">Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid.</a> International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+environment+in+endocytic+compartments.">The acidic environment in endocytic compartments.</a> Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).</li><li>Maugeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+endosomal+escape+of+LNP-mRNA+and+loading+into+EVs+for+transport+to+other+cells.">Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li><li>Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Nanoscale. (45), (2019).</li><li>Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+whereby+cationic+lipids+promote+intracellular+delivery+of+polynucleic+acids.">On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids.</a> Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).</li><li>Hafez, I. M., Culis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lipid+polymorphism+in+intracellular+delivery.">Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).</li><li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery.">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).</li><li>Mui, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+polyethylene+glycol+lipid+desorption+rates+on+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+siRNA+lipid+nanoparticles.">Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).</li><li>Zukancic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+poly(Ethylene+glycol)+and+lipid+structure+in+targeted+gene+delivery+to+lymph+nodes+by+lipid+nanoparticles.">The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).</li><li>NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: <a target="_blank" href="https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas">https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas</a> (2020)</li><li>Kastner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+manufacturing+of+size-tuned+liposomes+by+a+new+microfluidics+method+using+enhanced+statistical+tools+for+characterization.">High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).</li><li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing.">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA.">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticles+for+intramuscular+administration+of+mRNA+vaccines.">Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+mRNA+to+colon+inflammatory+lesions+by+lipid-nano-particles+containing+environmentally-sensitive+lipid-like+materials+with+oleic+acid+scaffolds.">The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds.</a> Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).</li><li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+lipid+nanoparticles.">Nucleic acid lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2018).</li></ol>

רבייה, מהירות, הקרנה בנפח נמוך הם יתרונות משמעותיים של שימוש בערבוב microfluidic כדי ליצור LNPs לעומת שיטות קיימות אחרות (למשל, הידרציה סרט השומנים הזרקת אתנול). הדגמנו את יכולת הרבייה של שיטה זו ללא השפעה על יעילות אנקפסולציה או גודל חלקיקים שנצפו עם אצוות LNP שונות. זהו קריטריון חיוני עבור כל טיפול...

נשאי סמים משמשים כדי להגן ולספק טיפול עם תכונות חיוביות טיפוסיות כולל ציטוטוקסיות נמוכה, זמינות ביולוגית מוגברת, ויציבות משופרת1,2,3. חלקיקים פולימריים, מיצלים וחלקיקים מבוססי שומנים נחקרו בעבר עבור אנקפסולציה של חומצת גרעין ואספקה4,5,6,7. שומנים שימשו סוגים שונים של מערכות nanocarrier, כולל ליפוזומים, חלקיקי שומנים בדם, כפי שהם תואמים ביולוגית עם יציבות גבוהה8. LNPs יכול בקלות לתמצת חומצות גרעין עבור אספקתגנים 9,10. הם מגנים על חומצת הגרעין מפני השפלה על ידי פרוטאזים בסרום במהלך מחזור מערכתי11 ויכולים לשפר את המסירה לאתרים ספציפיים, כמו טופוגרפיה פני השטח ואת המאפיינים הפיזיים של LNPs להשפיע על ייחוס ביולוגישלהם 12. LNPs גם לשפר את חדירת הרקמות ואת ספיגת התא9. מחקרים קודמים הדגימו את ההצלחה של אנקפסולציה siRNA בתוך LNP13, כולל LNP הראשון זמין מסחרית המכיל siRNA טיפולי לטיפול polyneuropathy של עמילואידוזיס תורשתי בתיווך transthyretin14 טיפול שאושר על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) וסוכנות התרופות האירופית בשנת 2018. לאחרונה, LNPs נחקרים על משלוח של moieties חומצת גרעין גדולה יותר, כלומר mRNA ו- DNA9. נכון ל-2018, היו ~ 22 מערכות אספקת חומצת גרעין מבוססות שומנים שעברו ניסויים קליניים14. בנוסף, mRNA המכיל LNPs הם כיום מועמדים מובילים והם מועסקים עבור חיסון COVID-1915,16. ההצלחה הפוטנציאלית של טיפולים גנטיים לא ויראליים אלה דורשת יצירת חלקיקים קטנים (~ 100 ננומטר), יציבים ואחידים עם אנקפסולציה גבוהה של חומצת הגרעין.
השימוש בשומנים מיינים כמרכיב עיקרי בניסוח LNP הראה יתרונות לתת-עור, אנקפסולציה וגמישות מסירה14. שומנים יונים בדרך כלל יש קבוע דיסוציאציה חומצה (pKa) < 7; לדוגמה, דילינולימלמתיל-4-דימתילאמינובוטיראט (D-Lin-MC3-DMA), השומנים היוניים המשמשים בניסוח LNP שאושר על ידי ה-FDA, יש pKa של 6.4417. ברמת ה-pH הנמוכה, קבוצות האמין על השומנים היונים הופכות פרוטוניות וטעונות באופן חיובי, ומאפשרות את ההרכבה עם קבוצות פוספט טעונות שליליות על mRNA ו- DNA. היחס של אמין, "N", קבוצות פוספט, "P", קבוצות משמש כדי לייעל את ההרכבה. יחס N/P תלוי שומנים וחומצות גרעין בשימוש, אשר משתנה בהתאם ניסוח18. לאחר היווצרות, ה- pH יכול להיות מותאם ל- pH נייטרלי או פיזיולוגי כדי לאפשר ניהול טיפולי. בערכי pH אלה, השומנים היוניים הוא גם deprotonated אשר מחדיר מטען משטח נייטרלי LNP.
השומנים היוניים מסייעים גם בבריחה אנדוסומלית19,20. LNPs עוברים אנדוציטוזיס במהלך ספיגת התא ויש לשחרר מן endosome על מנת להעביר את המטען mRNA לתוך ציטופלסמה התא או מטען DNA לגרעין21. בתוך אנדוזום היא בדרך כלל סביבה חומצית יותר מאשר המדיום החוץ תאי, אשר הופך את השומנים היונים טעון חיובי22,23. השומנים היונים הטעונים באופן חיובי יכולים לקיים אינטראקציה עם מטענים שליליים על קרום השומנים האנדוזום, אשר יכול לגרום לערעור היציבות של אנדוזום המאפשר את שחרורו של LNP וחומצת גרעין. שומנים שונים מיומנים נחקרים כעת לשיפור היעילות של הפצת LNP, כמו גם בריחה אנדוסומלית14.
רכיבים אופייניים אחרים של LNP כוללים שומנים עוזרים, כגון פוספטידילכולין (PC) או פוספוטנולמין (PE) שומנים. 1,2-דיאולאויל-סן-גליצרי-3-פוספוטנולמין (DOPE), 1,2-דיסטרויל-סן-גליצרי-3-פוספוצולין (DSPC), ו-1,2-דיאולאויל-סן-גליצרי-3-פוספוצולין (DOPC) הם ליפידים עוזרים נפוצים24,25. DOPE הוכח ליצור שלב משושה II הפוך (HII) ולשפר את transfection על ידי היתוךממברנה 26, בעוד DSPC נחשב לייצב LNPs עם הגיאומטריה הגלילית שלה27. כולסטרול משולב גם ניסוח על מנת להגביר את קשיחות הממברנה, לאחר מכן סיוע ביציבות של LNP. לבסוף, פוליאתילן גליקול מצומד שומנים בדם (PEG) כלול בניסוח כדי לספק את המחסום הסיסטרי הדרוש כדי לסייע בהרכבה עצמית חלקיקים27. PEG גם משפר את יציבות האחסון של LNPs על-ידי מניעת צבירה. יתר על כן, PEG משמש לעתים קרובות כרכיב התגנבות והוא יכול להגדיל את זמן זרימת הדם עבור LNPs. עם זאת, תכונה זו יכולה גם להציב אתגרים לגיוס LNPs להפטוציטים באמצעות מנגנון פילוח אנדוגני המונע על ידי apolipoprotein E (ApoE)28. לכן, מחקרים חקרו את אורך שרשרת האציל לפיזור PEG מה- LNP, ומצאו כי אורכים קצרים (C8-14) מנותקים מה- LNP והם נוחים יותר לגיוס ApoE בהשוואה לאורכים ארוכים יותרשל אציל 28. כמו כן, מידת הרוויה של זנב השומנים כי PEG הוא מצומד הוכח להשפיע על התפלגות הרקמה של LNPs29. לאחרונה, Tween 20, שהוא חומר פעילי שטח נפוץ בפורמולציות של מוצרי תרופות ביולוגיות ויש לו זנב שומנים ארוך ולא רווי, הוכח כבעל transfection גבוה בניקוז בלוטות הלימפה בהשוואה PEG-DSPE, אשר במידה רבה עבר את השריר באתר ההזרקה29. פרמטר זה יכול להיות ממוטב כדי להשיג את ההפצה הביולוגית הרצויה LNP.
שיטות קונבנציונליות ליצירת LNPs כוללות את שיטת הידרציה סרט דק שיטת הזרקת אתנול27. בעוד אלה הן טכניקות זמינות, הם גם עבודה אינטנסיבית, יכול לגרום יעילות אנקפסולציה נמוכה, והם מאתגרים להגדילאת 27. ההתקדמות בטכניקות ערבוב הביאה לשיטות נוחות יותר להרחבה, תוך פיתוח חלקיקים אחידים יותר27. שיטות אלה כוללות ערבוב צומת T, ערבוב הרינגבון מתנודד, ומיקוד הידרודינמי מיקרופלואידי27. לכל שיטה מבנה ייחודי, אך כולם מאפשרים ערבוב מהיר של שלב מימי המכיל את חומצת הגרעין עם שלב אורגני המכיל את רכיבי השומנים, וכתוצאה מכך אנקפסולציה גבוהה של חומצת הגרעין27. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בערבוב מהיר ומבוקר באמצעות מחסנית מיקרופלואידית, המשתמשת בעיצוב ערבוב הרינגבון המהדהד. פרוטוקול זה מתאר את ההכנה, ההרכבה והאפיון של חומצת גרעין המכילה LNPs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

נשאי תרופות מבוססי שומנים שימשו למערכות אספקה זמינות קלינית ומסחרית בשל גודלן הקטן, תאימות ביולוגית ויעילות אנקפסולציה גבוהה. השימוש בננו-חלקיקי שומנים בדם (LNPs) כדי לתמצת חומצות גרעין הוא יתרון כדי להגן על ה- RNA או ה- DNA מפני השפלה, תוך קידום ספיגת התאים. LNPs מכילים לעתים קרובות רכיבי שומנים מרובים כולל שומנים מיומנים, שומנים עוזרים, כולסטרול, פוליאתילן גליקול (PEG) שומנים מצומדים. LNPs יכול בקלות לתמצת חומצות גרעין בשל נוכחות שומנים מיונן, אשר ב- pH נמוך הוא קטי ומאפשר קומפלקס עם RNA טעון שלילית או DNA. כאן LNPs נוצרים על ידי אנקפסולציה RNA messenger (mRNA) או DNA plasmid (pDNA) באמצעות ערבוב מהיר של רכיבי השומנים בשלב אורגני ואת רכיב חומצת הגרעין בשלב מימי. ערבוב זה מתבצע באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית מדויקת, המאפשרת הרכבה עצמית ננו-חלקיקית תוך שמירה על זרימת למינאר. הגודל ההידרודינמי והפולידיספרסיות נמדדים באמצעות פיזור אור דינמי (DLS). מטען פני השטח היעיל על LNP נקבע על ידי מדידת פוטנציאל הזטה. יעילות אנקפסולציה מאופיינת באמצעות צבע פלואורסצנטי כדי לכמת חומצת גרעין לכודה. תוצאות מייצגות מדגימות את יכולת הרבייה של שיטה זו ואת ההשפעה שיש לפרמטרים שונים של ניסוח ותהליכים על ה- LNPs המפותחים.

אצוות מרובות של LNPs עם אותו ניסוח שומנים ויחס N/ P של 6 פותחו בימים נפרדים כדי להפגין רבייה של הטכניקה. אצווה 1 ו-2 הביאה לחלוקת גודל חופפת עם פולידיספרסיות דומה (איור 2A)לא נצפה הבדל משמעותי בגודל או ביעילות אנקפסולציה בין שתי האצוות השונות (איור 2B).</...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

חלקיקי שומנים מפותחים באמצעות גישה פלטפורמת ערבוב microfluidic עבור mRNA ו- DNA אנקפסולציה.

גיבוש ואפיון חלקיקי שומנים בדם לאספקת גנים באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

פרוטוקול זה יכול לשמש לייצור חלקיקי שומנים אנקפסולציה חומצת גרעין עם רבייה גבוהה ומהירות ונפחים נמוכים. ניתן לכוונן את פרמטרי הניסוח כדי להשיג הפצה ביולוגית רצויה המבוססת על היישום הקליני. עיצוב הרינגבון הסטנדרטי של מחסנית המיקרופלואידית מאפשר זרימת למינאר מהירה, מדויקת ומבוקרת במהלך הערבוב.השיטה מקובלת על קנה המידה ומייצרת חלקיקים אחידים, מאוד עטופים. עם רוב מוצרי ריפוי גנטי שאושרו מסחרית מסתמכים על שיטות ויראליות, הליך זה יכול לספק תובנה על אספקת גנים, כמו הגישה הלא ויראלית שלה מאפשרת יישומים שעבורם מנון חוזר יש צורך. התחל על ידי הוספת הכמות המתאימה של כל פתרון מלאי נוזלי בקבוקון זכוכית עם מערבולת לסירוגין.כפי שצוין בטבלה, ואחריו תוספת של 200 אתנול הוכחה לנפח סופי של 533 מיקרוליטרים. לאחר מכן להוסיף את הכמות המתאימה של מלאי mRNA לדלל עם חוצץ ציטוט כדי להשיג נפח סופי של 1.5 מיליליטר בריכוז הרצוי. כדי להפעיל את הערוצים המיקרופלואידיים, הזינו תחילה את הפרמטר priming לתוכנת המכשיר כפי שמתואר בטבלה.לאחר מכן, פתח את מכסה המכשיר והכנס מחסנית מיקרופלואידית לתוך הבלוק המסתובב. לטעון לפחות 500 microliters של אתנול לתוך מזרק 1 מיליליטר, לטפל בכך שאין בועות או מרווחי אוויר בקצה המזרק ולהכניס את המזרק לתוך הכניסה הימנית של המחסנית. לטעון מזרק חמישה מיליליטר עם 1.5 מיליליטר של חוצץ סיטראט, דואג כי אין בועות אוויר או פערים, ולהכניס את המזרק לתוך הכניסה השמאלית של המחסנית.מניחים שני צינורות חרוטיים 15 מיליליטר לתוך מחזיקי קליפ לשמש מיכלי פסולת ולחץ Go "כדי לערבב את הפתרונות. כאשר המכשיר מפסיק להתגבש כפי שצוין על ידי האור הכחול התחתון כיבוי, לפתוח מאוחר כראוי להיפטר הצינורות החרוט ומזרקים. להיווצרות חלקיקי שומנים בדם, להגדיר את הפרמטרים ניסוח המתאים כפי שצוין בטבלה לטעון מזרק 1 מיליליטר עם תערובת שומנים שהוכן בעבר.הסר את כל מרווחי האוויר או בועות בקצה המזרק ולהכניס את המזרק לצד ימין של המחסנית. לטעון את פתרון חומצת גרעין שהוכן בעבר לתוך מזרק 3 מיליליטר, לטפל בכך שאין בועות או מרווחי אוויר בקצה המזרק, ולהכניס את המזרק לתוך הכניסה השמאלית של המחסנית. מניחים צינור חרוט ללא RNAase 15 מיליליטר שכותרתו עם שם המדגם לתוך קליפ הצינור השמאלי ומניחים חרוט פסולת 15 מיליליטר בסרטון הצינור הימני.סגור את מכסה המכשיר ולחץ Go.פתרונות השומנים וה- mRNA יזרמו דרך המחסנית המיקרופלואידית ופתרון הננו-חלקיקים השומנים ייאסף בצינורות החרוט. שמור על הצינור החרוט בסוף תהליך ניסוח, ולאחר מכן לדלל את חלקיקי השומנים עם 5 מיליליטר של PBS וארון בטיחות ביולוגי. כדי לבצע חילופי חיץ, תחילה לשטוף מראש מסנן נקבוביות בגודל 100 קילודלטון אולטרה צנטריפוגה עם 2 מיליליטר של PBS, צנטריפוגה, ולאחר מכן לרוקן את PBS מהתא התחתון.הוסף את חלקיקי השומנים המדוללים לתא העליון של מסנן האולטרה-צנטריפוגה שנשטף מראש לשלושה שטיפות צנטריפוגות, תוך השלכת הזרימה דרך והוספת 5 מיליליטר של PBS למסנן האולטרה-צנטריפוגה לאחר שתי השטיפות הראשונות. לאחר הכביסה האחרונה, pipette פתרון ננו חלקיקים שומנים על הקירות של מסנן ultracentrifuge כמה פעמים כדי למזער את אובדן הננו-חלקיקים לפני העברת פתרון הננו-חלקיקים לחתונה ללא נוקלאז. לאחר מכן להוסיף PBS להביא את ההשעיה ננו-חלקיקים לריכוז ניסיוני מתאים ונפח לפי הצורך.כדי להעריך את יעילות אנקפסולציה של חלקיקי השומנים, ראשית להכין דילול סדרתי כפול של פתרון חומצת גרעין עבודה PBS כדי ליצור עקומה סטנדרטית, החל 500 ננוגרם למיליליטר ועושה לפחות חמישה דילולים. לאחר מכן, להכין את דילול מדגם חלקיקים ב- PBS כדי להשיג ריכוז תיאורטי מתאים השוכן סביב נקודת האמצע של העקומה הסטנדרטית. לאחר מכן להכין את ריאגנט RNA ירוק ריבו כדי לזהות נוכחות של RNA בתוך ומחוץ חלקיק השומנים על ידי ערבוב הכמויות המתאימות של ריאגנט RNA, טריטון X100 ו- PBS.לאחר מכן, כדי לזהות את נוכחותו של RNA מחוץ לחלקיק הנוזלי, לערבב את הכמויות המתאימות של ריאגנטים RNA ו- PBS בלבד. עומס משכפל את הפתרונות הסטנדרטיים של חומצת הגרעין וננו-חלקיקי השומנים ללוח 96 באר שחור בעל יכולת פלואורסצנטיות, ולאחר מכן הוסף נפח שווה של ריאגנט כימות RNA עם, וללא טריטון X100 לשכפולים הסטנדרטיים והמדגמיים. לנער את הצלחת בקורא הלוח במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור כדי לקבל ערבוב יסודי של הדגימות, ולאחר מכן למדוד את הפלואורסצנטיות על קורא מיקרו-לוח אורך גל עירור של 480 ננומטר ואורך גל פליטה של 520 ננומטר.כדי למדוד את הגודל ההידרודינמי ואת פיזור פולי של חלקיקי השומנים, תחילה לדלל את פתרון הננו-חלקיקים 40 פעמים ב- PBS ולהוסיף את הפתרון למיקרו cuvette למחצה. טען את cuvette על Zetasizer ולבחור הליך הפעלה סטנדרטי כדי להגדיר את המכשיר כדי למדוד את הננו-חלקיקים על פי החומר שלהם, פיזור, טמפרטורה וסוג התא. לאחר מכן לחץ על התחל"כדי למדוד את הגודל ההידרודינמי ואת פיזור פולי של חלקיקי השומנים.כדי למדוד את פוטנציאל זטה של חלקיקי שומנים בדם, לדלל את פתרון הננו-חלקיקים 40 פעמים במים ללא נוקלאז ולהעמיס את הפתרון לתוך cuvette לקו המילוי. טען את cuvette לתוך מנתח פוטנציאלי זטה, דואג כי האלקטרודות ליצור קשר עם המכשיר, ולהגדיר את המכשיר כדי למדוד את הפוטנציאל זטה על פי האיפור הספציפי של חלקיקי השומנים. לאחר מכן לחץ על התחל"כדי למדוד את פוטנציאל הננו-חלקיקים השומנים של זטה.בניתוח זה, קבוצות מרובות של חלקיקי שומנים בדם עם אותו ניסוח שומנים ויחס אמין לפוספט פותחו בימים נפרדים כדי להדגים את יכולת הרבייה של הטכניקה. כפי שנצפה, אצוות אחת ושתיים הציגו התפלגות גודל חופפת עם פיזור פולי דומה, ללא הבדלים משמעותיים שנצפו בגודל או ביעילות אנקפסולציה בין האצוות. בדרך כלל, שינויים בפרמטרים ניסוח לגרום כמה הבדלים קטנים אך משמעותיים סטטיסטית.לדוגמה, הפחתת יחס האמין לפוספט גורמת לירידה של 4% ביעילות האנקפסולציה, עם עלייה במקביל בקוטר ההידרודינמי של הננו-חלקיקים. חלקיקי שומנים בדם מנוסחים עם שומנים שונים, אך אותו יחס אמין לפוספט, מציגים שינוי משמעותי ביעילות אנקפסולציה, כמו גם הבדלים קלים בקוטר החלקיקים. אנקפסולציה של DNA plasmid תוצאות חלקיקים גדולים יותר לעומת mRA אנקפסולציה חלקיקי שומנים, אם כי שני סוגי חלקיקים להפגין יעילות אנקפסולציה דומה.שינויים בפרמטר תהליך קצב הזרימה, עם זאת, אינם משפיעים על התפתחות הננו-חלקיקים של השומנים. חלקיקי השומנים יש יישומים גדולים, הדוגמה המושלמת להיות חיסוני COVID-19 שאושרו לאחרונה. טכניקה זו משמשת ערכת כלים נהדרת וסוללת את הדרך ליישומים עתידיים על ידי מתן אפשרות להקרנת ניסוח גפיים תחתונות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

משלוח ין transfection ב אדם בתאי סרטן הלבלב באמצעות גורם גדילה עוריות קולטן במיקוד לטין מבוסס Nanovectors מתוכנן

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

ניתוח inhomogeneity ערבוב במכשיר microfluidic על ידי טכניקת microscale Schlieren

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...