Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Grazie ad Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger e Philip Zakas per la loro guida e il loro contributo allo sviluppo di LNP.

Uno schema del processo complessivo è fornito nella Figura 1.
1. Preparazione dei buffer
NOTA: il filtraggio sterile dei tamponi è altamente consigliato qui per rimuovere eventuali particelle che possono influire sulla qualità dell'acido nucleico e dell'LNP.
<ol><li>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)<ol>
<li>Preparare 1x PBS utilizzando 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl e 2...

<ol>
	<li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery.">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li><li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).</li><li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. 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Riproducibilità, velocità e screening a basso volume sono vantaggi significativi dell'utilizzo della miscelazione microfluidica per formare LNP rispetto ad altri metodi esistenti (ad esempio, idratazione del film lipidico e iniezione di etanolo). Abbiamo dimostrato la riproducibilità di questo metodo senza alcun impatto sull'efficienza di incapsulamento o sulla dimensione delle particelle osservate con diversi lotti LNP. Questo è un criterio essenziale affinché qualsiasi terapia, compresi gli LNP, diventi clinicamen...

I vettori farmaceutici sono utilizzati per proteggere e fornire una terapia con proprietà favorevoli tipiche tra cui bassa citotossicità, aumento della biodisponibilità e miglioramento della stabilità1,2,3. Nanoparticelle polimeriche, micelle e particelle a base lipidica sono state precedentemente esplorate per l'incapsulamento e il rilascio di acidi nucleici4,5,6,7. I lipidi sono stati utilizzati in diversi tipi di sistemi nanocarrier, compresi i liposomi e le nanoparticelle lipidiche, in quanto sono biocompatibili con elevata stabilità8. Gli LNP possono facilmente incapsulare gli acidi nucleici per la consegnagenica 9,10. Proteggono l'acido nucleico dalla degradazione da parte delle proteasi sieriche durante la circolazione sistemica11 e possono migliorare la consegna a siti specifici, poiché la topografia superficiale e le proprietà fisiche delle LNP influenzano la loro biodistribuzione12. Gli LNP migliorano anche la penetrazione dei tessuti e l'assorbimento cellulare9. Studi precedenti hanno dimostrato il successo dell'incapsulamento di siRNA all'interno di un LNP13, incluso il primo LNP disponibile in commercio contenente siRNA terapeutico per il trattamento della polineuropatia del trattamento ereditario con amiloidosi14 mediata da transtiretina che è stato approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti e dall'Agenzia europea per i medicinali nel 2018. Più recentemente, gli LNP sono stati studiati per la consegna di porzioni di acido nucleico più grandi, vale a dire mRNA e DNA9. A partire dal 2018, c'erano ~ 22 sistemi di somministrazione di acidi nucleici a base lipidica sottoposti a studi clinici14. Inoltre, gli mRNA contenenti LNP sono attualmente candidati principali e sono stati impiegati per un vaccino COVID-1915,16. Il potenziale successo di queste terapie geniche non virali richiede la formazione di particelle piccole (~ 100 nm), stabili e uniformi con un elevato incapsulamento dell'acido nucleico.
L'uso di un lipide ionizzabile come componente principale nella formulazione LNP ha mostrato vantaggi per la complessazione, l'incapsulamento e l'efficienza di consegna14. I lipidi ionizzabili hanno tipicamente una costante di dissociazione acida (pKa) < 7; ad esempio, il dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), il lipide ionizzabile utilizzato nella formulazione LNP approvata dalla FDA, ha un pKa di 6,4417. A pH basso, i gruppi amminici sul lipide ionizzabile diventano protonati e caricati positivamente, consentendo l'assemblaggio con gruppi fosfato caricati negativamente su mRNA e DNA. Il rapporto tra ammina, "N", gruppi e fosfato, "P", gruppi viene utilizzato per ottimizzare l'assemblaggio. Il rapporto N/P dipende dai lipidi e dagli acidi nucleici utilizzati, che variano a seconda della formulazione18. Dopo la formazione, il pH può essere regolato su un pH neutro o fisiologico per consentire la somministrazione terapeutica. A questi valori di pH, il lipide ionizzabile viene anche deprotonato che conferisce carica superficiale neutra al LNP.
Il lipide ionizzabile aiuta anche nella fuga endosomiale19,20. Gli LNP subiscono endocitosi durante l'assorbimento cellulare e devono essere rilasciati dall'endosoma per consegnare il carico di mRNA nel citoplasma cellulare o nel carico di DNA al nucleo21. All'interno dell'endosoma c'è tipicamente un ambiente più acido rispetto al mezzo extracellulare, che rende il lipide ionizzabile caricato positivamente22,23. Il lipide ionizzabile caricato positivamente può interagire con cariche negative sulla membrana lipidica endosomiale, che può causare la destabilizzazione dell'endosoma consentendo il rilascio dell'LNP e dell'acido nucleico. Diversi lipidi ionizzabili sono attualmente in fase di studio per migliorare l'efficacia sia della distribuzione LNP, sia della fuga endosomiale14.
Altri componenti tipici di un LNP includono lipidi helper, come un fosfatidilcolina (PC) o fosfoetanolammina (PE) lipide. 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (DOPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) sono lipidi helper comunemente usati24,25. DoPE ha dimostrato di formare una fase esagonale invertita II (HII) e migliorare la trasfezione mediante fusione di membrana26, mentre DSPC è stato pensato per stabilizzare LNP con la sua geometria cilindrica27. Il colesterolo è anche incorporato nella formulazione al fine di aumentare la rigidità della membrana, aiutando successivamente nella stabilità del LNP. Infine, il polietilenglicole coniugato con lipidi (PEG) è incluso nella formulazione per fornire la barriera sterica necessaria per aiutare nell'autoassemblaggio delle particelle27. PEG migliora anche la stabilità di archiviazione degli LNP impedendo l'aggregazione. Inoltre, PEG è spesso usato come componente stealth e può aumentare il tempo di circolazione per gli LNP. Tuttavia, questo attributo può anche porre sfide per il reclutamento di LNP negli epatociti attraverso un meccanismo di targeting endogeno guidato dall'apolipoproteina E (ApoE)28. Pertanto, gli studi hanno studiato la lunghezza della catena acilico per la diffusione del PEG dall'LNP, scoprendo che le lunghezze corte (C8-14) si dissociano dall'LNP e sono più suscettibili al reclutamento di ApoE rispetto alle lunghezze acilice più lunghe28. Inoltre, il grado di saturazione della coda lipidica a cui PEG è coniugato ha dimostrato di influenzare la distribuzione tissutale di LNP29. Recentemente, Tween 20, che è un tensioattivo comunemente usato nelle formulazioni di farmaci biologici e ha una lunga coda lipidica insatura, ha dimostrato di avere un'elevata trasfezione nei linfonodi drenanti rispetto a PEG-DSPE, che ha in gran parte trasfettato il muscolo nel sito di iniezione29. Questo parametro può essere ottimizzato per ottenere la biodistribuzione LNP desiderata.
I metodi convenzionali di formazione degli LNP includono il metodo di idratazione a film sottile e il metodo di iniezione di etanolo27. Mentre queste sono tecniche prontamente disponibili, sono anche ad alta intensità di lavoro, possono comportare una bassa efficienza di incapsulamento e sono difficili da scalare fino a27. I progressi nelle tecniche di miscelazione hanno portato a metodi più suscettibili di scalare, mentre sviluppano particelle più uniformi27. Questi metodi includono la miscelazione a giunzione T, la miscelazione a spina di pesce sfalsata e la messa a fuoco idrodinamica microfluidica27. Ogni metodo ha una struttura unica, ma tutti consentono una rapida miscelazione di una fase acquosa contenente l'acido nucleico con una fase organica contenente i componenti lipidici, con conseguente elevato incapsulamento dell'acido nucleico27. In questo protocollo, viene utilizzata una miscelazione rapida e controllata attraverso una cartuccia microfluidica, che impiega il design di miscelazione a spina di pesce sfalsato. Questo protocollo delinea la preparazione, l'assemblaggio e la caratterizzazione dell'acido nucleico contenente LNP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

I vettori di farmaci a base lipidica sono stati utilizzati per i sistemi di somministrazione clinicamente e commercialmente disponibili grazie alle loro piccole dimensioni, alla biocompatibilità e all'elevata efficienza di incapsulamento. L'uso di nanoparticelle lipidiche (LNP) per incapsulare gli acidi nucleici è vantaggioso per proteggere l'RNA o il DNA dalla degradazione, promuovendo al contempo l'assorbimento cellulare. Gli LNP contengono spesso più componenti lipidici tra cui un lipide ionizzabile, lipide helper, colesterolo e lipide coniugato polietilenglicole (PEG). Gli LNP possono facilmente incapsulare gli acidi nucleici a causa della presenza lipidica ionizzabile, che a basso pH è cationica e consente la complessazione con RNA o DNA caricati negativamente. Qui gli LNP sono formati incapsulando l'RNA messaggero (mRNA) o il DNA plasmidico (pDNA) utilizzando una rapida miscelazione dei componenti lipidici in una fase organica e della componente dell'acido nucleico in una fase acquosa. Questa miscelazione viene eseguita utilizzando una precisa piattaforma di miscelazione microfluidica, che consente l'autoassemblaggio delle nanoparticelle mantenendo il flusso laminare. Le dimensioni idrodinamiche e la polidispersità sono misurate utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS). La carica superficiale effettiva sull'LNP è determinata misurando il potenziale zeta. L'efficienza di incapsulamento è caratterizzata utilizzando un colorante fluorescente per quantificare l'acido nucleico intrappolato. Risultati rappresentativi dimostrano la riproducibilità di questo metodo e l'influenza che i diversi parametri di formulazione e di processo hanno sui LNP sviluppati.

Più lotti di LNP con la stessa formulazione lipidica e rapporto N/P di 6 sono stati sviluppati in giorni separati per dimostrare la riproducibilità della tecnica. I lotti 1 e 2 hanno determinato distribuzioni dimensionali sovrapposte con polidispersità simile (Figura 2A) Non è stata osservata alcuna differenza significativa nelle dimensioni o nell'efficienza di incapsulamento tra i due diversi lotti (Figura 2B). L'efficienza ...

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Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Le nanoparticelle lipidiche sono sviluppate utilizzando un approccio di piattaforma di miscelazione microfluidica per l'incapsulamento di mRNA e DNA.

Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Questo protocollo può essere utilizzato per produrre nanoparticelle lipidiche incapsulate in acido nucleico con elevata riproducibilità e velocità e bassi volumi. I parametri di formulazione possono essere regolati per ottenere una biodis distribuzione desiderata in base all'applicazione clinica. Il design standard a spina di pesce della cartuccia microfluidica consente un flusso laminare rapido, preciso e controllato durante la miscelazione.Il metodo è suscettibile di scalare verso l'alto e genera particelle uniformi e altamente incapsulate. Con la maggior parte dei prodotti di terapia genica approvati commercialmente che si basano su metodi virali, questa procedura può fornire informazioni sulla consegna genica, poiché il suo approccio non virale consente applicazioni per le quali è necessario ripetere il dosaggio. Iniziare aggiungendo la quantità appropriata di ciascuna soluzione liquida in un flaconcino di vetro con vortice intermittente.come indicato nella tabella, seguito dall'aggiunta di 200 etanolo proof a un volume finale di 533 microlitri. Quindi aggiungere la quantità appropriata di mRNA e diluire con tampone citrato per ottenere un volume finale di 1,5 millilitri alla concentrazione desiderata. Per innescare i canali microfluidici, inserire prima il parametro di priming nel software dello strumento come indicato nella tabella.Quindi, aprire il coperchio dello strumento e posizionare una cartuccia microfluidica nel blocco rotante. Caricare almeno 500 microlitri di etanolo in una siringa da 1 millilitro, facendo attenzione che non ci siano bolle o spazi d'aria sulla punta della siringa e inserire la siringa nell'ingresso destro della cartuccia. Caricare una siringa da cinque millilitri con 1,5 millilitri di tampone citrato, facendo attenzione che non vi siano bolle d'aria o spazi vuoti e inserire la siringa nell'ingresso sinistro della cartuccia.Posizionare due tubi conici da 15 milliliter nei portagottere per fungere da contenitori per rifiuti e fare clic su Vai per mescolare le soluzioni. Quando lo strumento smette di innescare come indicato dalla luce blu inferiore che si spegne, aprire il ritardo e smaltire correttamente i tubi conici e le siringhe. Per la formazione di nanoparticelle lipidiche, impostare i parametri di formulazione appropriati come indicato nella tabella e caricare una siringa da 1 millilitro con una miscela lipidica precedentemente preparata.Rimuovere eventuali vuoti d'aria o bolle nella punta della siringa e inserire la siringa sul lato destro della cartuccia. Caricare la soluzione di acido nucleico precedentemente preparata in una siringa da 3 millilitro, facendo attenzione che non vi siano bolle o vuoti d'aria nella punta della siringa e inserire la siringa nell'ingresso sinistro della cartuccia. Posizionare un tubo conico privo di RNAasi da 15 millilitro etichettato con il nome del campione nella clip del tubo sinistro e posizionare un conico di scarto da 15 millilitro nella clip del tubo destro.Chiudere il coperchio dello strumento e fare clic su Vai.Le soluzioni lipidiche e mRNA fluiranno attraverso la cartuccia microfluidica e la soluzione di nanoparticelle lipidiche verrà raccolta nei tubi conici. Trattenere il tubo conico alla fine del processo di formulazione, quindi diluire le nanoparticelle lipidiche con 5 millilitri di PBS e un armadio di sicurezza biologica. Per eseguire uno scambio tampone, prima prelavare un filtro ultracentrifuga da 100 kilodalton con 2 millilitri di PBS, centrifuga, quindi svuotare il PBS dal compartimento inferiore.Aggiungere le nanoparticelle lipidiche diluite al compartimento superiore del filtro ultracentrifuga pre-lavato per tre lavaggi centrifughi, eliminando il flusso passante e aggiungendo 5 millilitri di PBS al filtro ultracentrifugato dopo i primi due lavaggi. Dopo l'ultimo lavaggio, pipettare la soluzione di nanoparticelle lipidiche contro le pareti del filtro ultracentrifuga un paio di volte per ridurre al minimo la perdita di nanoparticelle prima di trasferire la soluzione di nanoparticelle in un flaconcino privo di nucleasi. Quindi aggiungere PBS per portare la sospensione di nanoparticelle alla concentrazione e al volume sperimentali appropriati, se necessario.Per valutare l'efficienza di incapsulamento delle nanoparticelle lipidiche, preparare prima due diluizioni seriali della soluzione di acido nucleico funzionante in PBS per generare una curva standard, a partire da 500 nanogrammi per millilitro e facendo almeno cinque diluizioni. Quindi, preparare le diluizioni del campione di nanoparticelle in PBS per ottenere una concentrazione teorica appropriata che si trova intorno al punto medio della curva standard. Quindi preparare il reagente di RNA verde ribo per rilevare la presenza di RNA sia all'interno che all'esterno della nanoparticella lipidica mescolando le quantità appropriate di reagente RNA, Triton X100 e PBS.Quindi, per rilevare la presenza di RNA al di fuori della nanoparticella liquida, mescolare le quantità appropriate di reagenti RNA e PBS solo. Il carico replica lo standard dell'acido nucleico e le soluzioni di nanoparticelle lipidiche in una piastra a 96 pozzetti capace di fluorescenza nera, quindi aggiunge un volume uguale di reagente di quantificazione dell'RNA con e senza Triton X100 allo standard e il campione replica. Agitare la piastra nel lettore di piastre per cinque minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce per ottenere una miscelazione accurata dei campioni, quindi misurare la fluorescenza su un lettore di micropiasche a una lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 520 nanometri.Per misurare le dimensioni idrodinamiche e la polidisperienza delle nanoparticelle lipidiche, prima diluire la soluzione di nanoparticelle 40 volte in PBS e aggiungere la soluzione a una semi micro cuvetta. Caricare la cuvetta sullo Zetasizer e selezionare una procedura operativa standard per impostare lo strumento per misurare le nanoparticelle in base al loro materiale, disperdente, temperatura e tipo di cella. Quindi fare clic su Start"per misurare la dimensione idrodinamica e la polidisperività delle nanoparticelle lipidiche.Per misurare il potenziale Zeta delle nanoparticelle lipidiche, diluire la soluzione di nanoparticelle 40 volte in acqua priva di nucleasi e caricare la soluzione in una cuvetta fino alla linea di riempimento. Caricare la cuvetta in un analizzatore di potenziale Zeta, facendo attenzione che gli elettrodi entrino in contatto con lo strumento e impostare lo strumento per misurare il potenziale Zeta in base alla composizione specifica delle nanoparticelle lipidiche. Quindi fare clic su Start"per misurare il potenziale delle nanoparticelle lipidiche Zeta.In questa analisi, più lotti di nanoparticelle lipidiche con la stessa formulazione lipidica e il rapporto ammina-fosfato sono stati sviluppati in giorni separati per dimostrare la riproducibilità della tecnica. Come osservato, i lotti uno e due presentavano distribuzioni dimensionali sovrapposte con una simile polidisperibilità, senza differenze significative osservate nelle dimensioni o nell'efficienza di incapsulamento tra i lotti. In genere, i cambiamenti nei parametri di formulazione inducono alcune piccole ma statisticamente significative differenze.Ad esempio, la diminuzione del rapporto ammina-fosfato si traduce in una diminuzione del 4% dell'efficienza di incapsulamento, con un concomitante aumento del diametro idrodinamico delle nanoparticelle. Le nanoparticelle lipidiche formulate con diversi lipidi ionizzabili ma lo stesso rapporto ammina-fosfato, mostrano un cambiamento significativo nell'efficienza di incapsulamento e lievi differenze nel diametro delle particelle. L'incapsulamento del DNA plasmidico si traduce in particelle più grandi rispetto alle nanoparticelle lipidiche che incapsulano mRA, sebbene entrambi i tipi di nanoparticelle dimostrino un'efficienza di incapsulamento simile.I cambiamenti nel parametro del processo della portata, tuttavia, non influiscono sullo sviluppo delle nanoparticelle lipidiche. Le nanoparticelle lipidiche hanno grandi applicazioni, l'esempio perfetto sono i vaccini COVID-19 recentemente approvati. Questa tecnica funge da ottimo set di strumenti e apre la strada a future applicazioni consentendo lo screening della formulazione degli arti inferiori.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Consegna dei geni e trasfezione in cellule umane di cancro al pancreas con Epidermal Growth Factor Receptor mirati Nanovectors Progettato a base di gelatina

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Ricerca

Bioingegneria

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

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Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

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In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

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Solid Lipid nanoparticelle (linfonodi sentinella) Applicazioni per intracellulare targeting

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

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Una piattaforma microfluidica per Imaging longitudinale in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...