Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
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アトゥル・サルヤ、ヤティン・ゴカーン、マリア・テレサ・ペラッキア、ウォルター・シュヴェンゲル、フィリップ・ザカスの指導とLNP開発への貢献に感謝します。

全体的なプロセスの概略を図 1に示します。
1. バッファの準備
注:バッファーの滅菌フィルタリングは、核酸およびLNP品質に影響を与える可能性のある微粒子を除去するために、ここで非常に推奨されています。
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩分 (PBS)<ol>
<li>8 mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137 mM NaCl、およびヌ?...

<ol>
	<li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery.">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li><li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).</li><li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano+based+drug+delivery+systems:+recent+developments+and+future+prospects.">Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects.</a> J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).</li><li>Rai, R., Alwani, S., Badea, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles+in+gene+therapy:+New+avenues+of+design+and+optimization+for+delivery+applications.">Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications.</a> Polymers. 11 (4), 745 (2019).</li><li>Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+polymer+micelles+of+controlled+size,+stability,+and+functionality+for+siRNA+delivery.">Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery.</a> ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li><li>Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer+probing+of+assembly+and+disassembly+of+short+interfering+RNA/Poly(ethylene+glycol)-Poly-L-Lysine+polyion+complex+micelles.">F&#246;rster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles.</a> Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).</li><li>Puri, A., Loomis, K., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+nanoparticles+as+pharmaceutical+drug+carriers:+from+concepts+to+clinic.">Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic.</a> Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).</li><li>Cullis, P. R., Hope, M. 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M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+delivery+systems+for+siRNA-based+therapeutics.">Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics.</a> Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).</li><li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies:+From+concepts+to+clinical+utility.">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).</li><li>Shin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+development+and+a+potential+nanomaterial+path+forward.">COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward.</a> Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).</li><li>Thanh Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COVID-19+vaccine+development+landscape.">The COVID-19 vaccine development landscape.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).</li><li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Nanoscale. (45), (2019).</li><li>Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+whereby+cationic+lipids+promote+intracellular+delivery+of+polynucleic+acids.">On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids.</a> Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).</li><li>Hafez, I. M., Culis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lipid+polymorphism+in+intracellular+delivery.">Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).</li><li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery.">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).</li><li>Mui, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+polyethylene+glycol+lipid+desorption+rates+on+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+siRNA+lipid+nanoparticles.">Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).</li><li>Zukancic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+poly(Ethylene+glycol)+and+lipid+structure+in+targeted+gene+delivery+to+lymph+nodes+by+lipid+nanoparticles.">The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).</li><li>NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: <a target="_blank" href="https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas">https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas</a> (2020)</li><li>Kastner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+manufacturing+of+size-tuned+liposomes+by+a+new+microfluidics+method+using+enhanced+statistical+tools+for+characterization.">High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).</li><li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing.">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA.">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticles+for+intramuscular+administration+of+mRNA+vaccines.">Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+mRNA+to+colon+inflammatory+lesions+by+lipid-nano-particles+containing+environmentally-sensitive+lipid-like+materials+with+oleic+acid+scaffolds.">The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds.</a> Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).</li><li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+lipid+nanoparticles.">Nucleic acid lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2018).</li></ol>

再現性、速度、および低体積スクリーニングは、マイクロ流体混合を用いて、他の既存の方法(例えば、脂質フィルム水和およびエタノール注入)と比較してLNPを形成する重要な利点である。我々は、異なるLNPバッチで観察されるカプセル化効率または粒子サイズに影響を与えなく、この方法の再現性を実証した。これは、Lnpsを含むあらゆる治療が臨床的に利用可能になるための不可欠な基準?...

薬物キャリアは、低細胞毒性、バイオアベイラビリティの増加、および安定性の向上1、2、3を含む典型的な好ましい特性を有する治療を保護し、提供するために使用される。ポリマーナノ粒子、ミセル、および脂質ベースの粒子は、核酸カプセル化および送達4、5、6、7について以前に検討されてきた。脂質は、高い安定性8と生体適合性であるため、リポソーム、および脂質ナノ粒子を含む異なるタイプのナノキャリア系で使用されてきた。LNPは遺伝子送達用核酸を容易に封入できる9,10.それらは、全身循環11の間に血清プロテアーゼによる分解から核酸を保護し、特定の部位への送達を改善することができ、LNPの表面地形および物性がそれらの生物分布12に影響を及ぼす。LNPはまた、組織の浸透と細胞の取り込み9を改善します。これまでの研究では、2018年に米国食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁によって承認された遺伝性経サイレチン媒介性アミロイドーシス14治療の治療用siRNA治療を含む最初の市販LNPを含むLNP13内でのsiRNAカプセル化の成功が実証されている。最近では、Lnpは、より大きな核酸部分、すなわちmRNAとDNA9の送達のために研究されている。2018年現在、臨床試験を受けている脂質ベースの核酸送達系は~22個あった。さらに、LNPを含むmRNAは現在有力な候補であり、COVID-19ワクチン15,16に採用されている。これらの非ウイルス性遺伝子治療の潜在的な成功は、核酸のカプセル化が高い小さな(〜100nm)、安定した均一な粒子を形成する必要があります。
LNP製剤中の主成分としてのイオン化可能脂質の使用は、複素化、カプセル化、及び送達のeffciciency14に対する利点を示している。イオン化可能な脂質は、典型的には酸解離定数(pKa)を有<7;例えば、ジリノールメチル-4-ジメチルアミノブチレート(D-Lin-MC3-DMA)は、FDA承認LNP製剤に用いられるイオン化可能な脂質を、6.4417のpKaを有する。低pHでは、イオン化可能な脂質上のアミン基がプロトン化され、正に荷電し、mRNAおよびDNA上に負に荷電したリン酸基を有する組立が可能になる。アミンの比率は、「N」、リン酸塩に対する基、「P」、基が組み立てを最適化するために使用される。N/P比は、使用される脂質および核酸に依存し、製剤18によって異なる。形成後、pHは中性または生理学的pHに調節して、治療的投与を可能にすることができる。これらのpH値では、電化可能な脂質も脱プロトン化され、中性表面電荷をLNPに付与する。
このイオン化脂質は、内経脱出19,20にも役立つ。LNPは細胞取り込み中にエンドサイトーシスを受け、細胞細胞質またはDNA貨物にmRNA貨物を核21に送達するためにエンドソームから放出されなければならない。内の内部は、通常、細胞外媒体よりも酸性の環境であり、イオン性脂質を正に22、23に充電する。正に荷電したイオン化可能な脂質は、内膜脂質膜上の負電荷と相互作用し、これが、LNPおよび核酸の放出を可能にする内因性の不安定化を引き起こす可能性がある。異なる電化脂質は、現在、両方のLNP分布の有効性を改善するために研究されている、 ならびに内経体脱出14。
LNPの他の典型的な成分は、ホスファチジルコリン(PC)またはホスホエタノールアミン(PE)脂質などのヘルパー脂質を含む。1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ディステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、および1,2-ジオレオイル-snグリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)が一般的に使用されているヘルパー脂質24,25。DOPEは、反転六角形II(HII)相を形成し、膜融合26によってトランスフェクションを増強することが示されているが、DSPCはその円筒形状27でLNPsを安定化させると考えられている。コレステロールはまた、膜剛性を高めるために製剤に組み込まれ、その後、LNPの安定性を助ける。最後に、脂質共役ポリエチレングリコール(PEG)が、粒子自己集合性27に助けるために必要な立体的障壁を提供するために製剤に含まれる。また、PEG は集約を防止することで LNP のストレージの安定性を向上させます。さらに、PEG はステルスコンポーネントとしてよく使用され、LNP の循環時間を長くすることができます。しかし、この属性はまた、アポリポタンパクE(ApoE)28によって駆動される内因性標的機構を介して肝細胞へのLNPの採用に対する課題を提起する可能性がある。従って、研究は、LNPからのPEGの拡散のためのアシル鎖長さを調査し、短い長さ(C8-14)がLNPから解離し、より長いアシル長28と比較してApoE採用に対してより適性であることを発見した。また、PEGが共役する脂質尾の飽和度合いは、LNPs29の組織分布に影響を与えることを示している。近年、Tween 20は、生物学的薬剤製品製剤に一般的に使用される界面活性剤であり、長い不飽和脂質尾を有するが、PEG-DSPEと比較してリンパ節の排出において高いトランスフェクションを有することが示されたが、これは注射部位29で筋肉を大部分トランスフェクトした。このパラメータは、望ましいLNPバイオディストリビューションを達成するために最適化することができます。
LNPsの形成の従来の方法は、薄膜水和法およびエタノール注入法27を含む。これらは容易に入手できる技術であるが、それらはまた、労働集約的であり、低いカプセル化効率をもたらし、そして27をスケールアップすることは困難である。混合技術の進歩は、より均一な粒子27を開発しながら、スケールアップに適した方法をもたらしました。これらの方法には、T-接合部混合、ずらしてヘリンボーン混合、及び微流体流体力学的集化27が含まれる。各方法は、固有の構造を有するが、全ては、脂質成分を含む有機相を有する核酸を含む水相を迅速に混合することを可能にし、結果として核酸27の高い封入を生じる。このプロトコルでは、マイクロ流体カートリッジを介した迅速かつ制御混合が利用され、ずらしたヘリンボーン混合設計を採用しています。このプロトコルは、LNPを含む核酸の調製、組立、および特性を概説する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

脂質ベースの薬物キャリアは、サイズが小さく、生体適合性、高いカプセル化効率のために、臨床的および商業的に入手可能な送達システムに使用されてきました。核酸をカプセル化する脂質ナノ粒子(LnPs)の使用は、RNAまたはDNAを分解から保護するのに有利であり、細胞の取り込みを促進する。LNPは、多くの場合、イオン化可能な脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール(PEG)結合脂質を含む複数の脂質成分を含みます。LNPは、イオン化可能な脂質存在に起因する核酸を容易に封入することができ、これは低pHでカチオンであり、負に荷電したRNAまたはDNAとの複合体化を可能にする。ここでLNPは、有機相中の脂質成分と核酸成分を水相で迅速に混合してメッセンジャーRNA(mRNA)またはプラスミドDNA(pDNA)を封入することによって形成される。この混合は精密なマイクロ流体混合プラットフォームを使用して行われ、層流を維持しながらナノ粒子自己集合を可能にする。流体力学のサイズと多分散は、ダイナミック光散乱(DLS)を使用して測定されます。LNP上の有効表面電荷はゼータ電位を測定することによって決定される。カプセル化効率は、蛍光色素を使用して、封じ込められた核酸を定量化することを特徴としている。代表的な結果は、この方法の再現性と、異なる製剤およびプロセスパラメータが開発されたLNPに及ぼす影響を示す。

同じ脂質製剤と6のN/P比を有するLNPの複数のバッチを別々の日に開発し、この技術の再現性を実証した。バッチ1と2は、類似した多分散性を有する重なり合うサイズ分布をもたらした(図2A)2つの異なるバッチ間のサイズまたはカプセル化効率に有意な差は認められなかった(図2B)。カプセル化効率はバッチ毎に高く(>98.5%)、サ?...

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Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

脂質ナノ粒子は、mRNAおよびDNAカプセル化のためのマイクロ流体混合プラットフォームアプローチを用いて開発される。

マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

このプロトコルは、高い再現性と速度と低い体積で核酸をカプセル化した脂質ナノ粒子を生成するために使用することができます。製剤パラメータは、臨床応用に基づいて所望のバイオ分布を達成するように調整することができる。マイクロ流体カートリッジの標準的なヘリンボーン設計は、混合中に迅速、精密、制御された層流を可能にします。この方法はスケールアップに適しており、均一で高度に封入された粒子を生成します。ウイルス法に依存するほとんどの商業的に承認された遺伝子治療産物では、この手順は、その非ウイルスアプローチが繰り返し投薬が必要なアプリケーションを可能にするので、遺伝子送達に関する洞察を提供することができる。まず、各液体ストック溶液の適切な量を、断続的な渦を伴うガラスバイアルに添加します。表に示されているように、533マイクロリットルの最終容積に200の証拠エタノールを添加した。次に、適切な量のmRNAストックを加え、クエン酸緩衝液で希釈して、所望の濃度で1.5ミリリットルの最終体積を達成します。マイクロ流体チャネルをプライミングするには、まず、表に示すように、プライミングパラメータを計測器ソフトウェアに入力します。次に、器具の蓋を開け、マイクロ流体カートリッジを回転ブロックに入れます。少なくとも500マイクロリットルのエタノールを1ミリリットルのシリンジに積み込み、シリンジ先端に泡やエアギャップが存在しないのに注意し、注射器をカートリッジの右入口に挿入します。5 ミリリットルのシリンジに1.5ミリリットルのクエン酸バッファーをロードし、気泡や隙間が存在しないよう注意し、カートリッジの左入口に注射器を挿入します。2つの15ミリリットルの円錐形チューブをクリップホルダーに入れ、廃棄物容器として機能し、Go"をクリックしてソリューションを混合します。底の青色光が止まっているように、楽器がプライミングを停止したら、遅く開き、円錐形のチューブと注射器を適切に処分します。脂質ナノ粒子形成の場合、表に示されているように適切な製剤パラメータを設定し、あらかじめ調製した脂質ミックスで1ミリリットルのシリンジをロードする。シリンジチップのエアギャップや泡を取り除き、シリンジをカートリッジの右側に挿入します。前に調製した核酸溶液を3ミリリットルのシリンジにロードし、シリンジ先端に気泡やエアギャップが存在しないのを考慮し、注射器をカートリッジの左入口に挿入します。サンプル名でラベル付けされた15ミリリットルのRNAaseフリー円錐チューブを左チューブクリップに入れ、右チューブクリップに15ミリリットルの廃棄物円錐形を入れます。装置の蓋を閉じて Go.Go.をクリックします。脂質および mRNA 溶液はマイクロ流体カートリッジを流れ、脂質ナノ粒子溶液は円錐形のチューブに集められます。製剤プロセスの最後に円錐形のチューブを保持し、その後、PBSと生物学的安全キャビネットの5ミリリットルで脂質ナノ粒子を希釈します。バッファー交換を行うために、まずPBS、遠心分離機の2ミリリットルで100キロダルトン孔サイズの超遠心分離フィルターを前洗いし、次に、底部コンパートメントからPBSを空にします。希釈した脂質ナノ粒子を3回の遠心洗浄用の前洗い超遠心分離フィルターの上部コンパートメントに追加し、フロースルーを破棄し、最初の2回の洗浄後にPBSを超遠心分離フィルターに5ミリリットル加えます。最後の洗浄後、超遠心分離フィルターの壁に対して脂質ナノ粒子溶液をピペットし、ナノ粒子溶液をヌクレアーゼを含まないバイアルに移す前にナノ粒子の損失を最小限に抑える。次にPBSを添加し、必要に応じてナノ粒子懸濁液を適切な実験濃度及び体積に持ち込む。脂質ナノ粒子のカプセル化効率を評価するために、まずPBSで働く核酸溶液の2倍の連続希釈を調製して標準曲線を生成し、1ミリリットル当たり500ナノグラムから始まり、少なくとも5つの希釈液を作る。次に、PBSでナノ粒子サンプル希釈液を調製し、標準曲線の中間点の周りにある適切な理論濃度を達成する。次に、リボグリーンRNA試薬を調製し、適切な量のRNA試薬であるTriton X100とPBSを混合して、脂質ナノ粒子の内外のRNAの存在を検出します。次いで、液体ナノ粒子の外側のRNAの存在を検出し、適切な量のRNA試薬とPBSのみを混合する。核酸標準溶液と脂質ナノ粒子溶液を黒色蛍光度対応96ウェルプレートに積み込み、その後、トリトンX100を用いて、かつトリトンX100を使用せず、等量のRNA定量試薬を加え、サンプル複製を行います。プレートリーダーのプレートを光から保護された室温で5分間振ってサンプルの完全な混合を得てから、マイクロプレートリーダーの蛍光を480ナノメートルの励起波長と520ナノメートルの発光波長で測定します。脂質ナノ粒子の流体力学的サイズおよびポリ分散度を測定するために、まずPBSでナノ粒子溶液を40回希釈し、その溶液をセミマイクロキュベットに加える。ゼタサイザーにキュヴェットをロードし、材料、分散剤、温度および細胞タイプに従ってナノ粒子を測定する器具を設定する標準的な操作手順を選択する。次に「開始」をクリックして、脂質ナノ粒子の流体力学サイズとポリ分散度を測定します。脂質ナノ粒子のゼータ電位を測定するには、ナノ粒子溶液をヌクレアーゼを含まない水で40倍希釈し、溶液をキュベットに充填ラインにロードする。電極が機器と接触するように、ゼータ電位分析装置にキュベットをロードし、脂質ナノ粒子の特定の構成に応じてゼータ電位を測定する装置を設定します。次に「開始」をクリックして、ゼータの脂質ナノ粒子電位を測定します。この分析では、同じ脂質製剤とアミン対リン酸比を有する脂質ナノ粒子の複数のバッチを別々の日に開発し、その技術の再現性を実証した。観察されたように、バッチ1と2は、類似したポリ分散性を有する重複サイズ分布を示し、バッチ間のサイズまたはカプセル化効率に有意な差は認められなかった。典型的には、製剤パラメータの変化は、いくつかの小さいけれども統計的に有意な差を誘発する。例えば、アミン対リン酸比を減少させると、カプセル化効率が4%減少し、ナノ粒子の流体力学的直径が増加する。脂質ナノ粒子は、異なるイオン化可能脂質を配合したが、同じアミン対リン酸比を用いて、カプセル化効率の著しい変化を示すとともに、粒子径のわずかな違いを示す。プラスミドDNAのカプセル化は、mRAカプセル化された脂質ナノ粒子と比較してより大きな粒子をもたらすが、両方のタイプのナノ粒子は同様のカプセル化効率を示す。しかし、流量プロセスパラメータの変化は、脂質ナノ粒子の発達に影響を与えない。脂質ナノ粒子は素晴らしい用途を持ち、完璧な例は最近承認されたCOVID-19ワクチンである。この技術は、優れたツールセットとして機能し、下肢製剤スクリーニングを可能にすることによって、将来のアプリケーションへの道を開きます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

上皮成長因子受容体をターゲットとしたゼラチンベースのエンジニアNanovectorsを使用してヒト膵臓癌細胞における遺伝子デリバリーとトランスフェクション

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

マイクロスケールシュリーレン法によるマイクロ流体デバイス内の混合不均一性の分析

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

細胞内ターゲティングアプリケーションのための固体脂質ナノ粒子（SLNs）

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける縦断的イメージングのためのマイクロ流体プラットフォーム

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...