Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
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아툴 살루자, 야틴 고칸, 마리아 테레사 페라키아, 월터 슈벵거, 필립 자카스가 LNP 개발에 대한 지도와 공헌에 감사드립니다.

전체 프로세스의 회로도는 그림 1에서제공됩니다.
1. 버퍼 준비
참고: 완충제의 멸균 여과는 핵산 및 LNP 품질에 영향을 미칠 수 있는 미립자를 제거하기 위해 여기에서 매우 권장됩니다.
<ol><li>인산염 완충식식염수(PBS)<ol>
<li>8m Na2HPO4,2mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl을 사용하여 1x PBS를 뉴클레아제 자유수?...

<ol>
	<li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery.">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li><li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).</li><li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer+probing+of+assembly+and+disassembly+of+short+interfering+RNA/Poly(ethylene+glycol)-Poly-L-Lysine+polyion+complex+micelles.">F&#246;rster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles.</a> Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).</li><li>Puri, A., Loomis, K., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+nanoparticles+as+pharmaceutical+drug+carriers:+from+concepts+to+clinic.">Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic.</a> Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).</li><li>Cullis, P. R., Hope, M. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lipid+polymorphism+in+intracellular+delivery.">Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).</li><li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery.">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).</li><li>Mui, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+polyethylene+glycol+lipid+desorption+rates+on+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+siRNA+lipid+nanoparticles.">Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).</li><li>Zukancic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+poly(Ethylene+glycol)+and+lipid+structure+in+targeted+gene+delivery+to+lymph+nodes+by+lipid+nanoparticles.">The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).</li><li>NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: <a target="_blank" href="https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas">https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas</a> (2020)</li><li>Kastner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+manufacturing+of+size-tuned+liposomes+by+a+new+microfluidics+method+using+enhanced+statistical+tools+for+characterization.">High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).</li><li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing.">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA.">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticles+for+intramuscular+administration+of+mRNA+vaccines.">Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+mRNA+to+colon+inflammatory+lesions+by+lipid-nano-particles+containing+environmentally-sensitive+lipid-like+materials+with+oleic+acid+scaffolds.">The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds.</a> Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).</li><li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+lipid+nanoparticles.">Nucleic acid lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2018).</li></ol>

재현성, 속도 및 저부피 스크리닝은 다른 기존 방법(예: 지질 필름 수화 및 에탄올 주입)에 비해 LP를 형성하기 위해 미세유체 혼합을 사용하는 데 상당한 이점이 있습니다. 우리는 다른 LNP 배치로 관찰 된 캡슐화 효율이나 입자 크기에 영향을 미치지 않고이 방법의 재현성을 입증했습니다. 이것은 LP를 포함하여 어떤 치료든지, 임상적으로 유효하게 하기 위한 필수적인 기준입니다.
<p class="jove_co...

약물 운반대는 낮은 세포 독성, 생체 이용률 증가 및 향상된 안정성1,2,3을포함한 전형적인 유리한 특성을 가진치료법을보호하고 전달하는 데 사용됩니다. 중합체 나노 입자, 미셀 및 지질 계 입자는 이전에 핵산 캡슐화 및전달을위해 탐구되었다4,5,6,7. 지질은 고안정성8과생체 적합성이기 때문에 지질및 지질 나노입자를 포함한 다양한 유형의 나노캐리어 시스템에서 사용되어 왔다. LP는 유전자전달9,10을위해 핵산을 쉽게 캡슐화할 수 있다. 그들은 전신 순환(11) 동안 혈청 프로테아제에 의한 분해로부터 핵산을 보호하고 LP의 표면 지형 및 물리적 특성이 그들의 생체분포에영향을 미치기 때문에 특정 부위에 대한 전달을 향상시킬 수 있다. LP는 또한 조직 침투 및 세포 섭취를 향상9. 이전 연구는 2018년 미국 식품의약국(FDA)과 유럽의약품청에서 승인한 유전성 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증14 치료의 치료 다신경병증치료제를 함유한 최초의 상용 LNP를 포함하여 LNP13내에서 siRNA 캡슐화의 성공을 입증하였다. 최근에는 LNPs가 더 큰 핵산 모이티, 즉 mRNA 및 DNA9의전달을 위해 연구되고 있다. 2018년 현재, 22개의 지질계 핵산 전달 시스템이임상시험(14)을겪고 있었다. 또한, LP를 함유하는 mRNA는 현재 주요 후보이며 COVID-19 백신15,16에채용되었다. 이러한 비 바이러스 유전자 치료에 대한 잠재적 인 성공은 작은 형성을 필요로 (~100 nm), 안정적이고 핵산의 높은 캡슐화와 균일 한 입자.
LNP 제형의 주성분으로서 이온화지질을 사용하는 것은 복합성, 캡슐화 및 전달효율(14)에대한 이점을 보여주었다. 이온화지질은 전형적으로 산성 해리 상수(pKa) < 7을 가지며; 예를 들어, 딜리놀레틸메틸-4-디메틸아미노부티레이트(D-Lin-MC3-DMA)는 FDA 승인 LNP 제형에 사용되는 이온화지질6.4417의pKa를 가지고 있다. 낮은 pH에서, 이온화 지질에 아민 그룹은 양성되고 긍정적으로 충전되어 mRNA 및 DNA에 음전하 인산염 그룹으로 조립할 수 있게 합니다. 아민의 비율, "N", 인산염에 대한 그룹, "P", 그룹은 조립을 최적화하는 데 사용된다. N/P 비는 사용되는 지질 및 핵산에 의존하며, 이는제형(18)에따라 다릅니다. 형성 후, pH는 치료 적 투여를 허용하기 위해 중성 또는 생리적 pH로 조절될 수 있다. 이러한 pH 값에서, 이온화지질은 또한 LNP에 중립 표면 전하를 부여하는 데프로톤화된다.
이온화지질은 또한 내피 탈출19,20에도움이 됩니다. LP는 세포 섭취 중 내분비증을 겪고핵(21)에세포 질 또는 DNA 화물을 세포 세포질 또는 DNA 화물로 전달하기 위해 내성에서 방출되어야 한다. 내분 내부는 전형적으로 세포외 배지보다 더 산성환경이며, 이는 이온화지질을 양산하22,23로렌더링한다. 양전하 이온지질은 내피 지질 막에 대한 음전하와 상호 작용할 수 있으며, 이는 LNP 및 핵산의 방출을 허용하는 내종의 불안정을 유발할 수 있다. 다른 이온화지질은 현재 LNP 분포의 효능을 향상시키기 위해 연구되고 있으며, 내도탈출(14).
LNP의 그밖 전형적인 분대는 인산염 (PC) 또는 인포에탄올라민 (PE) 지질과 같은 도우미 지질을 포함합니다. 1,2-Dioleoyl-sn-글리세로-3-인포에탄탄민(DOPE), 1,2-디스테로일-센-글리세로-3-인포콜린(DSPC), 및 1,2-2-디오레오틸-센-글리세로-3-인포콜린(DOPC)은 일반적으로 사용되며,24. DOPE는 반전 된 육각형 II (HII) 위상을 형성하고 멤브레인 융합(26)에의한 형질을 향상시키는 것으로 나타났으며, DSPC는 원통형 기하학적기하학적 인 27로LP를 안정화시키는 것으로 생각되고 있다. 콜레스테롤은 또한 막 강성을 증가시키기 위하여 제형에 통합되고, 그 후에 LNP의 안정성을 돕습니다. 마지막으로, 지질-공주 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 입자 자가조립(27)을돕는 데 필요한 스테릭 장벽을 제공하는 제형에 포함된다. PEG는 또한 집계를 방지하여 LP의 스토리지 안정성을 향상시킵니다. 또한 PEG는 종종 스텔스 성분으로 사용되며 LP의 순환 시간을 증가시킬 수 있습니다. 그러나, 이 속성은 또한 apolipoprotein E (ApoE)28에의해 구동되는 내인성 표적 화기 장치를 통해 간구에 LP의 모집에 대한 도전을 제기할 수 있다. 따라서, 연구는 LNP에서 PEG의 확산에 대한 아실 사슬 길이를 조사하고, 짧은 길이 (C8-14) LNP에서 해리하고 더 긴 아실 길이에 비해 ApoE 모집에 더 순종발견28. 또한, PEG가 공주되는 지질꼬리의 포화정도는LP(29)의조직 분포에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 최근에는 생물학적 약물 제품 제형에 일반적으로 사용되는 계면활성제이고 오랫동안 불포화지질꼬리를 가진 트위엔(20)은 주사부위(29)에서근육을 크게 감염시킨 PEG-DSPE에 비해 림프절배수에 높은 트랜스페션을 갖는 것으로 나타났다. 이 매개 변수는 원하는 LNP 바이오 분배를 달성하기 위해 최적화 될 수있다.
종래의 LP 성형 방법은 박막 수화 방법 및 에탄올 주입방법(27)을포함한다. 이들은 쉽게 사용할 수있는 기술이지만, 그들은 또한 노동 집약적이며, 낮은 캡슐화 효율을 초래할 수 있으며,27을확장하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 혼합 기술의 발전으로 인해 더 균일한입자(27)를개발하면서 확장할 수 있는 방법이 더 많아졌다. 이러한 방법에는 T-접합 혼합, 비틀거림 헤링본 혼합, 및 미세 유체 유체 유체 역학초점(27)이 포함됩니다. 각 방법은 독특한 구조를 가지고 있지만, 모두 지질 성분을 함유하는 유기상으로 핵산을 함유하는 수상의 신속한 혼합을 허용하여핵산(27)의높은 캡슐화를 초래한다. 이 프로토콜에서는 미세 유체 카트리지를 통한 신속하고 제어된 혼합이 사용되며, 이는 비틀거리는 헤링본 혼합 설계를 사용합니다. 이 프로토콜은 LP를 포함하는 핵산의 준비, 조립 및 특성화를 간략하게 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

지질 기반 의약품 운반대는 작은 크기, 생체 적합성 및 높은 캡슐화 효율로 인해 임상 및 시판 가능한 전달 시스템에 사용되어 왔습니다. 지질 나노 입자 (LP)를 사용하여 핵산을 캡슐화하는 것은 RNA 또는 DNA를 저하로부터 보호하는 동시에 세포 섭취를 촉진하는 데 유리하다. LP는 종종 이온화 지질, 도우미 지질, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 공액 지질을 포함한 여러 지질 성분을 포함한다. LP는 이온화성 지질 존재로 인해 핵산을 쉽게 캡슐화할 수 있으며, 이는 낮은 pH에서 양이온이며 음전하 RNA 또는 DNA로 복합화를 허용합니다. 여기서 LPPs는 수성 상에서 지질 성분의 신속한 혼합을 사용하여 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 캡슐화함으로써 형성된다. 이 혼합은 정밀한 미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 수행되므로 라미나르 흐름을 유지하면서 나노 입자 자체 조립을 허용합니다. 유체역학적 크기와 다분산성은 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 측정됩니다. LNP의 유효 표면 전하는 제타 전위를 측정하여 결정됩니다. 캡슐화 효율은 힌지된 핵산을 정량화하기 위해 형광염을 사용하는 것이 특징입니다. 대표적인 결과는 이 방법의 재현성과 상이한 제형 및 공정 파라미터가 개발된 LNP에 미치는 영향을 입증한다.

동일한 지질 제형 및 6의 N/P 비율을 가진 LP의 다중 배치는 기술의 재현성을 입증하기 위하여 별도의 일에 개발되었다. 배치 1 과 2 유사한 다분산성과 겹치는 크기 분포를 초래하였다(도2A)두 개의 상이한 배치(도2B)사이의 크기 또는 캡슐화 효율에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 캡슐화 효율은 각 배치(>98.5%)에 대해 높았으며...

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Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

지질 나노 입자는 mRNA 및 DNA 캡슐화를 위한 미세유체 혼합 플랫폼 접근 방식을 사용하여 개발됩니다.

미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

이 프로토콜은 높은 재현성과 속도 및 낮은 부피를 가진 핵산을 캡슐화한 지질 나노 입자를 생성하는 데 사용될 수 있다. 제형 파라미터는 임상 적용에 기초하여 원하는 바이오 분포를 달성하기 위해 튜닝될 수 있다. 미세 유체 카트리지의 표준 헤링본 설계는 혼합 중에 빠르고 정밀하며 제어된 라미나르 흐름을 허용합니다.이 방법은 확장이 가능하며 균일하고 캡슐화된 입자를 생성할 수 있습니다. 대부분의 상업적으로 승인된 유전자 치료 제품이 바이러스 방법에 의존하므로, 이 절차는 유전자 전달에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 비 바이러스 접근법은 반복 투약이 필요한 응용 프로그램을 허용하므로 가능합니다. 간헐적인 소용돌이가 있는 유리 바이알에 각 액체 스톡 용액의 적정량을 첨가하여 시작합니다.표에 표시된 바와 같이, 533 마이크로리터의 최종 부피에 200 개의 증거 에탄올을 첨가합니다. 그런 다음 적절한 양의 mRNA 스톡을 추가하고 구연산 버퍼로 희석하여 원하는 농도에서 1.5 밀리리터의 최종 부피를 달성한다. 미세 유체 채널을 프라임하려면 먼저 표에 설명된 대로 프라이밍 매개 변수를 계측기 소프트웨어에 입력합니다.그런 다음 기기 뚜껑을 열고 미세 유체 카트리지를 회전 블록에 배치합니다. 적어도 500 마이크로리터의 에탄올을 1 밀리리터 주사기에 적재하고 주사기 끝에 거품이나 공기 간격이 없다는 것을 돌보고 주사기를 카트리지의 오른쪽 입구에 삽입합니다. 5 밀리리터 주사기를 1.5 밀리리터의 구산완충제로 적재하고 기포나 틈새가 없는 지 주사기를 카트리지의 왼쪽 입구에 삽입합니다.클립 홀더에 15밀리리터 원컬 튜브 2개를 넣고 폐기물 용기역할을 하고 Go"를 클릭하여 솔루션을 혼합합니다. 아래 파란색 표시등이 차단된 대로 프라이밍을 중지하면 늦게 열리고 원문 튜브와 주사기를 적절히 폐기합니다. 지질 나노 입자 형성의 경우, 테이블에 표시된 대로 적절한 제형 매개 변수를 설정하고 이전에 준비된 지질 혼합물로 1 밀리리터 주사기를 적재한다.주사기 팁의 공기 간격이나 거품을 제거하고 주사기를 카트리지의 오른쪽에 삽입합니다. 이전에 준비된 핵산 용액을 3 밀리리터 주사기에 적재하고 주사기 팁에 거품이나 공기 갭이 없다는 것을 돌보고, 주사기를 카트리지의 왼쪽 입구에 삽입합니다. 샘플 이름이 표시된 15 밀리리터 RNAase 프리 원칼 튜브를 왼쪽 튜브 클립에 넣고 오른쪽 튜브 클립에 15 밀리리터 폐기물 원원형튜브를 배치합니다.기기 뚜껑을 닫고 Go.the Go.lipid 및 mRNA 용액이 미세 유체 카트리지를 통해 흐르고 지질 나노 입자 용액은 원원 튜브에서 수집됩니다. 제형 공정의 끝에 원문 관을 유지한 다음, PBS와 생물학적 안전 캐비닛의 5밀리리터로 지질 나노입자를 희석시킵니다. 완충 교환을 수행하기 위해 먼저 PBS, 원심분리기 2밀리리터로 100킬로달톤 모공 크기의 초원심분리기 필터를 예세척한 다음 아래 칸에서 PBS를 비웁니다.희석된 지질 나노입자를 3개의 원심분리기 세척에 미리 세척된 초원심분리기 필터의 상단 구획에 넣고, 흐름을 버리고 처음 두 번의 세척 후 초원심분리기 필터에 PBS의 5밀리리터를 추가한다. 마지막 세척 후, 초원심분리기의 벽에 대한 지질 나노입자 용액을 몇 번 피펫하여 나노입자 용액을 뉴클레아제 없는 유리알로 옮기기 전에 나노입자 손실을 최소화한다. 그런 다음 PBS를 추가하여 필요에 따라 나노 입자 현탁액을 적절한 실험 농도 및 부피에 가져옵니다.지질 나노 입자의 캡슐화 효율을 평가하기 위해 먼저 PBS에서 작동하는 핵산 용액의 2배 연속 희석제를 제조하여 밀리리터당 500나노그램에서 시작하여 최소 5개의 희석제를 만드는 표준 곡선을 생성합니다. 다음으로, 표준 곡선의 중간점 주위에 놓여 있는 적절한 이론적 농도를 달성하기 위해 PBS에서 나노입자 시료 희석을 준비한다. 그런 다음 리보 그린 RNA 시약을 준비하여 적절한 양의 RNA 시약, 트리톤 X100 및 PBS를 혼합하여 지질 나노 입자의 내부 및 외부 RNA의 존재를 감지합니다.이어서, 액체 나노입자 의 외부 RNA의 존재를 검출하기 위해, 적절한 양의 RNA 시약 및 PBS만 혼합한다. 적재는 핵산 표준 및 지질 나노 입자 용액을 검은 형광 가능 96 웰 플레이트로 복제한 다음, 표준 및 샘플 복제에 트리톤 X100을 사용하여 동일한 양의 RNA 정량화 시약을 첨가합니다. 샘플의 철저한 혼합을 얻기 위해 빛으로부터 보호실온에서 5 분 동안 플레이트 판독기의 플레이트를 흔들어 샘플을 철저히 혼합한 다음 480 나노미터의 난사 파장 및 520 나노미터의 방출 파장에서 마이크로 플레이트 판독기의 형광을 측정합니다.지질 나노 입자의 유체 역학 적 크기와 폴리 분산도를 측정하기 위해 먼저 PBS에서 나노 입자 용액을 40 번 희석하고 세미 마이크로 큐벳에 용액을 추가합니다. 큐벳을 제타제기에 적재하고 표준 작동 절차를 선택하여 재료, 분산제, 온도 및 세포 유형에 따라 나노 입자를 측정하도록 계측기를 설정합니다. 그런 다음 시작"을 클릭하여 지질 나노 입자의 유체 역학 크기와 다중 분산성을 측정합니다.지질 나노 입자의 제타 전위를 측정하기 위해 핵이없는 물에서 나노 입자 용액을 40 번 희석하고 용액을 충진 선에 큐벳으로 로드합니다. 전극이 계측기와 접촉하는 것을 주의하여 큐벳을 제타 전위 분석기로 적재하고, 지질 나노 입자의 특정 구성에 따라 제타 전위를 측정하는 계측기를 설정합니다. 그런 다음 시작"을 클릭하여 제타 지질 나노 입자 전위를 측정합니다.본 분석에서, 동일한 지질 제제및 인산염 비에 아민을 가진 지질 나노입자의 다중 배치는 기술의 재현성을 입증하기 위해 별도의 날에 개발되었다. 관찰된 바와 같이, 일괄 처리는 1개와 2개의 부분이 유사한 폴리 분산증과 겹치는 크기 분포를 나타내었으며, 배치 간의 크기 또는 캡슐화 효율에서 관찰된 큰 차이가 없습니다. 전형적으로, 제형 파라미터의 변화는 일부 작지만 통계적으로 유의한 차이를 유도한다.예를 들어, 인산염 비에 아민을 감소시키는 것은 캡슐화 효율이 4% 감소하며, 나노입자의 유체역학적 직경이 수반된다. 다른 이온화 성지질로 제조되었지만 인산염 비율에 동일한 아민으로 제조된 지질 나노 입자는 캡슐화 효율뿐만 아니라 입자 직경의 약간의 차이를 나타낸다. 플라스미드 DNA의 캡슐화는 지질 나노 입자를 캡슐화하는 mRA에 비해 더 큰 입자를 초래하지만, 나노 입자의 두 유형은 유사한 캡슐화 효율을 입증하지만.그러나 유량 공정 파라미터의 변화는 지질 나노입자 개발에 영향을 미치지 않는다. 지질 나노 입자는 훌륭한 응용 프로그램을 가지고, 최근 승인 된 COVID-19 백신인 완벽한 예. 이 기술은 훌륭한 도구 세트 역할을하며 낮은 사지 제형 검사를 허용하여 향후 응용 프로그램을 위한 길을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

표피 성장 인자를 사용하여 인간의 췌장 암 세포의 유전자 전달 및 Transfection은 다행 기반 엔지니어링된 Nanovectors를 수용체 타겟

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

연구

생체공학

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

마이크로 스케일 슐 리렌 기술에 의해 미세 유체 소자 믹싱 비균질성 분석

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

고체 지질 나노 입자 (SLNs) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...