Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Takk til Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger og Philip Zakas for deres veiledning og bidrag til LNP-utvikling.

Et skjema av den overordnede prosessen finnes i figur 1.
1. Utarbeidelse av buffere
MERK: Steril filtrering av bufferne anbefales her på det sterkeste å fjerne partikler som kan påvirke nukleinsyren og LNP-kvaliteten.
<ol><li>Fosfatbufret saltvann (PBS)<ol>
<li>Forbered 1x PBS ved hjelp av 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl og 2,7 mM KCl i nukleasefritt vann og juster pH til 7,4.</li>...

<ol>
	<li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery.">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li><li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).</li><li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano+based+drug+delivery+systems:+recent+developments+and+future+prospects.">Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects.</a> J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).</li><li>Rai, R., Alwani, S., Badea, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles+in+gene+therapy:+New+avenues+of+design+and+optimization+for+delivery+applications.">Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications.</a> Polymers. 11 (4), 745 (2019).</li><li>Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+polymer+micelles+of+controlled+size,+stability,+and+functionality+for+siRNA+delivery.">Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery.</a> ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li><li>Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer+probing+of+assembly+and+disassembly+of+short+interfering+RNA/Poly(ethylene+glycol)-Poly-L-Lysine+polyion+complex+micelles.">F&#246;rster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles.</a> Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).</li><li>Puri, A., Loomis, K., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+nanoparticles+as+pharmaceutical+drug+carriers:+from+concepts+to+clinic.">Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic.</a> Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).</li><li>Cullis, P. R., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+systems+for+enabling+gene+therapies.">Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies.</a> Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).</li><li>Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+to+the+center+of+the+cell:+Current+Nanocarrier+design+strategies+targeting+biopharmaceuticals+to+the+cytoplasm+an+nucleus.">Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).</li><li>Zhao, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+gene+delivery.">Lipid nanoparticles for gene delivery.</a> Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+in+vivo+potency+of+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).</li><li>Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+delivery+systems+for+siRNA-based+therapeutics.">Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics.</a> Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).</li><li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies:+From+concepts+to+clinical+utility.">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).</li><li>Shin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+development+and+a+potential+nanomaterial+path+forward.">COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward.</a> Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).</li><li>Thanh Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COVID-19+vaccine+development+landscape.">The COVID-19 vaccine development landscape.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).</li><li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery.">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).</li><li>Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+lipid+nanoparticles.">mRNA lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2019).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Suzuki, Y., Ishihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+activity+and+uptake+mechanism+of+siRNA-lipid+nanoparticles+with+an+asymmetric+ionizable+lipid.">Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid.</a> International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+environment+in+endocytic+compartments.">The acidic environment in endocytic compartments.</a> Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).</li><li>Maugeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+endosomal+escape+of+LNP-mRNA+and+loading+into+EVs+for+transport+to+other+cells.">Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li><li>Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Nanoscale. (45), (2019).</li><li>Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+whereby+cationic+lipids+promote+intracellular+delivery+of+polynucleic+acids.">On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids.</a> Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).</li><li>Hafez, I. M., Culis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lipid+polymorphism+in+intracellular+delivery.">Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).</li><li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery.">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).</li><li>Mui, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+polyethylene+glycol+lipid+desorption+rates+on+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+siRNA+lipid+nanoparticles.">Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).</li><li>Zukancic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+poly(Ethylene+glycol)+and+lipid+structure+in+targeted+gene+delivery+to+lymph+nodes+by+lipid+nanoparticles.">The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).</li><li>NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: <a target="_blank" href="https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas">https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas</a> (2020)</li><li>Kastner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+manufacturing+of+size-tuned+liposomes+by+a+new+microfluidics+method+using+enhanced+statistical+tools+for+characterization.">High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).</li><li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing.">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA.">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticles+for+intramuscular+administration+of+mRNA+vaccines.">Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+mRNA+to+colon+inflammatory+lesions+by+lipid-nano-particles+containing+environmentally-sensitive+lipid-like+materials+with+oleic+acid+scaffolds.">The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds.</a> Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).</li><li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+lipid+nanoparticles.">Nucleic acid lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2018).</li></ol>

Reproduserbarhet, hastighet og lavvolumscreening er betydelige fordeler ved å bruke mikrofluidisk blanding til å danne LNPer sammenlignet med andre eksisterende metoder (f.eks. lipidfilmhydrering og etanolinjeksjon). Vi har demonstrert reproduserbarheten av denne metoden uten innvirkning på innkapslingseffektivitet eller partikkelstørrelse observert med forskjellige LNP-partier. Dette er et viktig kriterium for enhver terapeutisk, inkludert LNPer, å bli klinisk tilgjengelig.
Teknikken bes...

Legemiddelbærere brukes til å beskytte og levere en terapeutisk med typiske gunstige egenskaper, inkludert lav cytotoksisitet, økt biotilgjengelighet og forbedret stabilitet1,2,3. Polymere nanopartikler, micelles og lipidbaserte partikler har tidligere blitt utforsket for nukleinsyreinnkapsling og levering4,5,6,7. Lipider har blitt brukt i forskjellige typer nanocarrier-systemer, inkludert liposomer og lipid nanopartikler, da de er biokompatible med høy stabilitet8. LNPer kan lett innkapsle nukleinsyrer for genlevering9,10. De beskytter nukleinsyren mot nedbrytning av serumproteaser under systemisksirkulasjon 11 og kan forbedre leveringen til bestemte steder, da overflatetopografien og de fysiske egenskapene til LNPer påvirker deres biodistribusjon12. LP-er forbedrer også vevsinntrengning og cellulært opptak9. Tidligere studier har vist suksessen med siRNA-innkapsling i en LNP13, inkludert den første kommersielt tilgjengelige LNP som inneholder siRNA-terapeutisk for behandling av polyneuropati av arvelig transthyretinmediert amyloidose14-behandling som ble godkjent av United States Food and Drug Administration (FDA) og European Medicines Agency i 2018. Mer nylig blir LNPer studert for levering av større nukleinsyremoieties, nemlig mRNA og DNA9. Fra og med 2018 var det ~ 22 lipidbaserte nukleinsyreleveringssystemer som gjennomgikk kliniske studier14. I tillegg er mRNA som inneholder LNPer for tiden ledende kandidater og har blitt ansatt for en COVID-19-vaksine15,16. Den potensielle suksessen for disse ikke-virale genterapiene krever å danne små (~ 100 nm), stabile og ensartede partikler med høy innkapsling av nukleinsyren.
Bruk av en ioniserbar lipid som hovedkomponent i LNP-formuleringen har vist fordeler for hudfarge, innkapsling og levering effciciency14. Iioniserbare lipider har vanligvis en syredissosiasjonskonstant (pKa) < 7; for eksempel har dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), den irizable lipiden som brukes i FDA-godkjent LNP-formulering, en pKa på 6,4417. Ved lav pH blir amingruppene på den iioniserbare lipiden protonert og positivt ladet, noe som muliggjør montering med negativt ladede fosfatgrupper på mRNA og DNA. Forholdet mellom amin, "N", grupper til fosfat, "P", grupper brukes til å optimalisere samlingen. N / P-forholdet er avhengig av lipider og nukleinsyrer som brukes, som varierer avhengig av formuleringen18. Etter dannelsen kan pH justeres til en nøytral eller fysiologisk pH for å tillate terapeutisk administrering. Ved disse pH-verdiene er den iionizable lipiden også deprotonert som gir nøytral overflateladning til LNP.
Den irizable lipid hjelper også i endosomal flukt19,20. LP-er gjennomgår endokytose under cellulært opptak og må frigjøres fra endosomet for å levere mRNA-lasten inn i cellecytoplasma eller DNA-last til kjernen21. Inne i endosomet er vanligvis et surere miljø enn det ekstracellulære mediet, noe som gjør den irizable lipid positivt ladet22,23. Den positivt ladede ionizable lipiden kan samhandle med negative ladninger på endosom lipidmembranen, noe som kan forårsake destabilisering av endosomet som tillater frigjøring av LNP og nukleinsyre. Ulike ioniserbare lipider studeres for tiden for å forbedre effekten av både LNP-distribusjon, samt endosomal flukt14.
Andre typiske komponenter i en LNP inkluderer hjelper lipider, for eksempel en fosfatidylkolin (PC) eller fosfoetanolamin (PE) lipid. 1,2-Dioleoyl-sn-glysero-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosphocholine (DSPC) og 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfocholine (DOPC) er ofte brukt hjelper lipider24,25. DOPE har vist seg å danne en omvendt sekskantet II (HII) fase og forbedre transfeksjon vedmembranfusjon 26, mens DSPC har blitt antatt å stabilisere LP-er med sin sylindriske geometri27. Kolesterol er også innlemmet i formuleringen for å øke membranstivheten, og deretter hjelpe til med stabiliteten til LNP. Til slutt er lipidkonjugert polyetylenglykol (PEG) inkludert i formuleringen for å gi den nødvendige steriske barrieren for å hjelpe til med partikkel selvmontering27. PEG forbedrer også lagringsstabiliteten til LNPer ved å forhindre aggregering. Videre brukes PEG ofte som en stealth-komponent og kan øke sirkulasjonstiden for LP-ene. Denne egenskapen kan imidlertid også by på utfordringer for rekruttering av LNPer til hepatocytter gjennom en endogen målrettingsmekanisme drevet av apolipoprotein E (ApoE)28. Studier har derfor undersøkt acylkjedelengden for diffusjon av PEG fra LNP, og funnet at korte lengder (C8-14) tar avstand fra LNP og er mer mottagelige for ApoE-rekruttering sammenlignet med lengre acyllengder28. Videre har graden av metning av lipidhalen som PEG er konjugert til vist seg å påvirke vevsfordelingen av LNPer29. Nylig ble Tween 20, som er et ofte brukt overflateaktivt middel i biologiske legemiddelproduktformuleringer og har en lang umettet lipidhale, vist seg å ha høy transfeksjon i drenering av lymfeknuter sammenlignet med PEG-DSPE, som i stor grad transfekterte muskelen på injeksjonsstedet29. Denne parameteren kan optimaliseres for å oppnå ønsket LNP biodistribusjon.
Konvensjonelle metoder for å danne LNPer inkluderer tynnfilmhydreringsmetoden og etanolinjeksjonsmetoden27. Selv om dette er lett tilgjengelige teknikker, er de også arbeidskrevende, kan resultere i lav innkapslingseffektivitet, og er utfordrende å skalere opp27. Fremskritt innen blandingsteknikker har resultert i metoder som er mer egnet til å skalere opp, samtidig som de utvikler mer ensartede partikler27. Disse metodene inkluderer T-kryssblanding, forskjøvet sildbeinblanding og mikrofluidisk hydrodynamisk fokus27. Hver metode har en unik struktur, men alle tillater rask blanding av en vandig fase som inneholder nukleinsyren med en organisk fase som inneholder lipidkomponentene, noe som resulterer i høy innkapsling av nukleinsyren27. I denne protokollen benyttes rask og kontrollert blanding gjennom en mikrofluidisk patron, som bruker den forskjøvede sildbeinblandingsdesignen. Denne protokollen skisserer fremstilling, montering og karakterisering av nukleinsyre som inneholder LNPer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

Lipidbaserte legemiddelbærere har blitt brukt til klinisk og kommersielt tilgjengelige leveringssystemer på grunn av deres lille størrelse, biokompatibilitet og høy innkapslingseffektivitet. Bruk av lipid nanopartikler (LNPer) for å innkapsle nukleinsyrer er fordelaktig for å beskytte RNA eller DNA mot nedbrytning, samtidig som det fremmer cellulært opptak. LNPer inneholder ofte flere lipidkomponenter, inkludert en ionizabel lipid, hjelperlipid, kolesterol og polyetylenglykol (PEG) konjugert lipid. LP-er kan lett innkapsle nukleinsyrer på grunn av den irizable lipidtilstedeværelsen, som ved lav pH er kationisk og muliggjør kompleksasjon med negativt ladet RNA eller DNA. Her dannes LNPer ved å innkapsle budbringeren RNA (mRNA) eller plasmid DNA (pDNA) ved hjelp av rask blanding av lipidkomponentene i en organisk fase og nukleinsyrekomponenten i en vandig fase. Denne blandingen utføres ved hjelp av en presis mikrofluidisk blandeplattform, noe som muliggjør nanopartikkel selvmontering samtidig som laminær strømning opprettholdes. Den hydrodynamiske størrelsen og polydispersiteten måles ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS). Den effektive overflateladningen på LNP bestemmes ved å måle zetapotensialet. Innkapslingseffektiviteten er preget av et fluorescerende fargestoff for å kvantifisere fanget nukleinsyre. Representative resultater viser reproduserbarheten av denne metoden og innflytelsen som forskjellige formulerings- og prosessparametere har på de utviklede LNP-ene.

Flere partier med LP-er med samme lipidformulering og N/P-forhold på 6 ble utviklet på separate dager for å demonstrere reproduserbarhet av teknikken. Parti 1 og 2 resulterte i overlappende størrelsesfordelinger med lignende polydispersitet (figur 2A) Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i størrelsen eller innkapslingseffektiviteten mellom de to forskjellige partiene (Figur 2B). Innkapslingseffektiviteten var h?...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid nanopartikler er utviklet ved hjelp av en mikrofluidisk blandeplattformtilnærming for mRNA og DNA-innkapsling.

Formulere og karakterisere Lipid nanopartikler for genlevering ved hjelp av en mikrofluidisk blandeplattform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Denne protokollen kan brukes til å produsere nukleinsyre innkapslede lipid nanopartikler med høy reproduserbarhet og hastighet og lave volumer. Formuleringsparametrene kan justeres for å oppnå ønsket biofordeling basert på den kliniske applikasjonen. Standard sildbeindesign av mikrofluidisk patron gir en rask, presis og kontrollert laminær strømning under blanding.Metoden er egnet til å skalere opp og genererer ensartede, svært innkapslede partikler. Med de fleste kommersielt godkjente genterapiprodukter som er avhengige av virale metoder, kan denne prosedyren gi innsikt i genlevering, da den ikke-virale tilnærmingen tillater applikasjoner som gjentatt dosering er nødvendig for. Begynn med å tilsette riktig mengde av hver flytende lagerløsning til et hetteglass med periodisk virvel.som angitt i tabellen, etterfulgt av tilsetning av 200 bevis etanol til et endelig volum på 533 mikroliter. Tilsett deretter riktig mengde mRNA-lager og fortynn med sitratbuffer for å oppnå et sluttvolum på 1,5 milliliter ved ønsket konsentrasjon. For å klargjøre de mikrofluidiske kanalene, skriv først inn grunnparameteren i instrumentprogramvaren som beskrevet i tabellen.Deretter åpner du instrumentlokket og plasserer en mikrofluidisk patron i den roterende blokken. Legg minst 500 mikroliter etanol i en 1 milliliter sprøyte, pass på at det ikke er bobler eller lufthull på sprøytespissen og sett sprøyten inn i høyre innløp av sylinderampullen. Legg en fem milliliter sprøyte med 1,5 milliliter sitratbuffer, pass på at det ikke er luftbobler eller hull, og sett sprøyten inn i venstre innløp av patronen.Plasser to koniske rør på 15 milliliter i klipsholderne for å fungere som avfallsbeholdere og klikk Go"for å blande løsningene. Når instrumentet slutter å grunne som angitt ved at det nederste blå lyset slår seg av, åpner du det sene og avhender koniske rørene og sprøytene på riktig måte. For lipid nanopartikkeldannelse, sett de riktige formuleringsparametrene som angitt i tabellen og last en 1 milliliter sprøyte med en tidligere forberedt lipidblanding.Fjern eventuelle lufthull eller bobler i sprøytespissen og sett sprøyten inn på høyre side av sylinderampullen. Legg den tidligere tilberedte nukleinsyreoppløsningen i en 3 milliliter sprøyte, pass på at det ikke er bobler eller lufthull i sprøytespissen, og sett sprøyten inn i venstre innløp av sylinderampullen. Plasser et 15 milliliter RNAasefritt konisk rør merket med prøvenavnet i venstre rørklemme og legg et 15 milliliter avfall konisk i høyre rørklemme.Lukk instrumentlokket og klikk Go.Lipid- og mRNA-løsningene vil strømme gjennom mikrofluidpatronen, og lipid nanopartikkelløsningen samles i de koniske rørene. Behold det koniske røret på slutten av formuleringsprosessen, og fortynn deretter lipid nanopartiklene med 5 milliliter PBS og et biologisk sikkerhetsskap. Hvis du vil utføre en bufferutveksling, må du først forhåndsvaske et ultracentrifugefilter på 100 kilodalton porestørrelse med 2 milliliter PBS, sentrifuge og deretter tømme PBS fra det nederste rommet.Tilsett de fortynnede lipid nanopartiklene i det øverste rommet i det forhåndsvaskede ultracentrifugefilteret for tre sentrifugevasker, kast gjennomstrømningen og tilsett 5 milliliter PBS til ultracentrifugefilteret etter de to første vaskene. Etter den siste vasken, pipette lipid nanopartikkelløsningen mot veggene i ultracentrifugefilteret noen ganger for å minimere nanopartikkeltapet før du overfører nanopartikkelløsningen til et nukleasefritt hetteglass. Tilsett deretter PBS for å bringe nanopartikkelfjæringen til riktig eksperimentell konsentrasjon og volum etter behov.For å vurdere innkapslingseffektiviteten til lipid nanopartiklene, må du først forberede todelt seriell fortynning av arbeidskjernesyreoppløsning i PBS for å generere en standardkurve, fra 500 nanogram per milliliter og lage minst fem fortynninger. Deretter forbereder du nanopartikkelprøvefortynning i PBS for å oppnå en passende teoretisk konsentrasjon som ligger rundt midtpunktet i standardkurven. Forbered deretter ribogrønn RNA-reagens for å oppdage tilstedeværelse av RNA både i og utenfor lipid nanopartikkelen ved å blande de aktuelle mengdene RNA-reagens, Triton X100 og PBS.Deretter, for å oppdage tilstedeværelsen av RNA utenfor den flytende nanopartikkelen, bland bare de aktuelle mengdene RNA-reagenser og PBS. Last replikeringer av nukleinsyrestandarden og lipid nanopartikkelløsningene i en svart fluorescens-kompatibel 96 brønnplate, legg deretter til et likt volum RNA kvantifiseringsreagens med, og uten Triton X100 til standarden og prøven replikerer. Rist platen i plateleseren i fem minutter ved romtemperatur beskyttet mot lys for å få en grundig blanding av prøvene, og mål deretter fluorescensen på en mikroplateleser ved en eksitasjonsbølgelengde på 480 nanometer og en utslippsbølgelengde på 520 nanometer.For å måle den hydrodynamiske størrelsen og polydispersjonen til lipid nanopartiklene, fortynn først nanopartikkeloppløsningen 40 ganger i PBS og tilsett løsningen til en halvmikroklopet. Legg cuvette på Zetasizer og velg en standard operasjonsprosedyre for å stille inn instrumentet til å måle nanopartiklene i henhold til materiale, dispergeringsmiddel, temperatur og celletype. Klikk deretter startknappen for å måle den hydrodynamiske størrelsen og polydispersjonen til lipid nanopartiklene.For å måle Zeta-potensialet til lipid nanopartikler, fortynn nanopartikkelløsningen 40 ganger i nukleasefritt vann og last løsningen inn i en cuvette til fylllinjen. Last cuvette inn i en Zeta potensiell analysator, pass på at elektrodene tar kontakt med instrumentet, og sett instrumentet til å måle Zeta-potensialet i henhold til den spesifikke sammensetningen av lipid nanopartikler. Klikk deretter start"for å måle Zeta lipid nanopartikkelpotensialet.I denne analysen ble flere partier lipid nanopartikler med samme lipidformulering og amin til fosfatforhold utviklet på separate dager for å demonstrere teknikkens reproduserbarhet. Som observert viser partier en og to overlappende størrelsesfordelinger med lignende polydispergering, uten signifikante forskjeller observert i størrelsen eller innkapslingseffektiviteten mellom partiene. Vanligvis induserer endringer i formuleringsparametrene noen små, men statistisk signifikante forskjeller.For eksempel resulterer reduksjon av amin til fosfatforhold i en 4% reduksjon i innkapslingseffektiviteten, med en samtidig økning i nanopartiklenes hydrodynamiske diameter. Lipid nanopartikler formulert med forskjellige ioniserbare lipider, men det samme amin-til-fosfatforholdet, viser en betydelig endring i innkapslingseffektiviteten samt små forskjeller i partikkeldiameteren. Innkapslingen av plasmid-DNA resulterer i større partikler sammenlignet med mRA-innkapsling av lipid nanopartikler, selv om begge typer nanopartikler viser en lignende innkapslingseffektivitet.Endringer i strømningshastighetsprosessparameteren påvirker imidlertid ikke lipid nanopartikkelutviklingen. Lipid nanopartikler har gode applikasjoner, det perfekte eksemplet er de nylig godkjente COVID-19-vaksinene. Denne teknikken fungerer som et flott verktøysett og baner vei for fremtidige applikasjoner ved å tillate skjemaeringsscreening i underekstremiteter.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Levering og Transfeksjon i Human kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp av epidermal vekstfaktorreseptor målrettede Gelatin-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjelp av en Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering av polymere Gene levering Nanopartikler av nanopartikler Tracking Analysis og High-throughput flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell klemme som en robust, Microfluidic Intracellulær Levering Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidbllag Vesikkel Generation Bruke Microfluidic Spyling

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analysere Blanding inhomogeneity i et mikrofluid Device av mikro Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanopartikler (SLNs) for Intracellulær målretting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikrofluid plattform for High-throughput encellede Isolering og kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic Plattform med multiplekset Electronic Detection for Spatial Sporing av partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En Microfluidic plattform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...