Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Спасибо Атулу Салудже, Ятину Гокарну, Марии-Терезе Пераккии, Вальтеру Швенгеру и Филипу Закасу за их руководство и вклад в развитие LNP.

Схема всего процесса приведена на рисунке 1.
1. Подготовка буферов
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная фильтрация буферов здесь настоятельно рекомендуется для удаления любых частиц, которые могут повлиять на качество нуклеиновой кислоты и LNP.
<ol><li>Фосф...

<ol>
	<li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery.">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li><li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).</li><li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano+based+drug+delivery+systems:+recent+developments+and+future+prospects.">Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects.</a> J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).</li><li>Rai, R., Alwani, S., Badea, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles+in+gene+therapy:+New+avenues+of+design+and+optimization+for+delivery+applications.">Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications.</a> Polymers. 11 (4), 745 (2019).</li><li>Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+polymer+micelles+of+controlled+size,+stability,+and+functionality+for+siRNA+delivery.">Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery.</a> ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li><li>Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer+probing+of+assembly+and+disassembly+of+short+interfering+RNA/Poly(ethylene+glycol)-Poly-L-Lysine+polyion+complex+micelles.">F&#246;rster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles.</a> Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).</li><li>Puri, A., Loomis, K., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+nanoparticles+as+pharmaceutical+drug+carriers:+from+concepts+to+clinic.">Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic.</a> Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).</li><li>Cullis, P. R., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+systems+for+enabling+gene+therapies.">Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies.</a> Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).</li><li>Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+to+the+center+of+the+cell:+Current+Nanocarrier+design+strategies+targeting+biopharmaceuticals+to+the+cytoplasm+an+nucleus.">Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).</li><li>Zhao, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+gene+delivery.">Lipid nanoparticles for gene delivery.</a> Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+in+vivo+potency+of+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).</li><li>Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+delivery+systems+for+siRNA-based+therapeutics.">Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics.</a> Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).</li><li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies:+From+concepts+to+clinical+utility.">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).</li><li>Shin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+development+and+a+potential+nanomaterial+path+forward.">COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward.</a> Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).</li><li>Thanh Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COVID-19+vaccine+development+landscape.">The COVID-19 vaccine development landscape.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).</li><li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery.">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).</li><li>Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+lipid+nanoparticles.">mRNA lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2019).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Suzuki, Y., Ishihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+activity+and+uptake+mechanism+of+siRNA-lipid+nanoparticles+with+an+asymmetric+ionizable+lipid.">Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid.</a> International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+environment+in+endocytic+compartments.">The acidic environment in endocytic compartments.</a> Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).</li><li>Maugeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+endosomal+escape+of+LNP-mRNA+and+loading+into+EVs+for+transport+to+other+cells.">Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li><li>Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Nanoscale. (45), (2019).</li><li>Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+whereby+cationic+lipids+promote+intracellular+delivery+of+polynucleic+acids.">On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids.</a> Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).</li><li>Hafez, I. M., Culis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lipid+polymorphism+in+intracellular+delivery.">Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).</li><li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery.">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).</li><li>Mui, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+polyethylene+glycol+lipid+desorption+rates+on+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+siRNA+lipid+nanoparticles.">Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).</li><li>Zukancic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+poly(Ethylene+glycol)+and+lipid+structure+in+targeted+gene+delivery+to+lymph+nodes+by+lipid+nanoparticles.">The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).</li><li>NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: <a target="_blank" href="https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas">https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas</a> (2020)</li><li>Kastner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+manufacturing+of+size-tuned+liposomes+by+a+new+microfluidics+method+using+enhanced+statistical+tools+for+characterization.">High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).</li><li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing.">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA.">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticles+for+intramuscular+administration+of+mRNA+vaccines.">Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+mRNA+to+colon+inflammatory+lesions+by+lipid-nano-particles+containing+environmentally-sensitive+lipid-like+materials+with+oleic+acid+scaffolds.">The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds.</a> Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).</li><li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+lipid+nanoparticles.">Nucleic acid lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2018).</li></ol>

Воспроизводимость, скорость и малый объем скрининга являются значительными преимуществами использования микрофлюидного смешивания для образования ЛНП по сравнению с другими существующими методами (например, гидратация липидной пленки и инъекция этанола). Мы продемонстрировали вос?...

Лекарственные носители используются для защиты и доставки терапевтических средств с типичными благоприятными свойствами, включая низкую цитотоксичность, повышенную биодоступность и улучшенную стабильность1,2,3. Полимерные наночастицы, мицеллы и частицы на основе липидов ранее были исследованы для инкапсуляции и доставки нуклеиновых кислот4,5,6,7. Липиды были использованы в различных типах нанонесушек, включая липосомы и липидные наночастицы, поскольку они биосовместимы с высокой стабильностью8. ЛНПцы могут легко инкапсулировать нуклеиновые кислоты для доставки генов9,10. Они защищают нуклеиновую кислоту от деградации сывороточными протеазами во время системного кровообращения11 и могут улучшить доставку к определенным участкам, так как топография поверхности и физические свойства ЛМП влияют на их биораспределение12. ЛНПЦ также улучшают проникновение в ткани и клеточное поглощение9. Предыдущие исследования продемонстрировали успех инкапсуляции siRNA в LNP13,включая первый коммерчески доступный LNP, содержащий siRNA терапевтический для лечения полинейропатии наследственного транстиретин-опосредованного амилоидоза14, который был одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) и Европейским агентством по лекарственным средствам в 2018 году. Совсем недавно ЛНПц изучаются для доставки более крупных фрагментов нуклеиновых кислот, а именно мРНК и ДНК9. По состоянию на 2018 год было ~ 22 системы доставки нуклеиновых кислот на основе липидов, проходящие клинические испытания14. Кроме того, мРНК, содержащие ЛНВ, в настоящее время являются ведущими кандидатами и используются для вакцины от COVID-1915,16. Потенциальный успех этих невирусных генных терапий требует формирования небольших (~ 100 нм), стабильных и однородных частиц с высокой инкапсуляцией нуклеиновой кислоты.
Использование ионизируемого липида в качестве основного компонента в составе LNP показало преимущества для комплексования, инкапсуляции и эффективности доставки14. Ионизируемые липиды обычно имеют константу кислотной диссоциации (pKa) < 7; например, дилинолейлметил-4-диметиламинобутират (D-Lin-MC3-DMA), ионизируемый липид, используемый в одобренном FDA препарате LNP, имеет pKa 6,4417. При низком рН аминные группы на ионизируемом липиде становятся протонированными и положительно заряженными, что позволяет проводить сборку с отрицательно заряженными фосфатными группами на мРНК и ДНК. Для оптимизации сборки используется отношение аминов, «N», групп к фосфатам, «Р», группам. Соотношение N/P зависит от используемых липидов и нуклеиновых кислот, которое варьируется в зависимости от состава18. После образования рН может быть скорректирован до нейтрального или физиологического рН, чтобы обеспечить терапевтическое введение. При этих значениях рН ионизируемый липид также депротонируется, что придает нейтральный поверхностный заряд LNP.
Ионизируемый липид также помогает в эндосомальномпобеге19,20. ЛНВ подвергаются эндоцитозу во время клеточного поглощения и должны быть освобождены из эндосомы, чтобы доставить груз мРНК в цитоплазму клетки или груз ДНК в ядро21. Внутри эндосомы обычно находится более кислая среда, чем внеклеточная среда, которая делает ионизируемый липид положительно заряженным22,23. Положительно заряженный ионизируемый липид может взаимодействовать с отрицательными зарядами на эндосомальной липидной мембране, что может вызвать дестабилизацию эндосомы, что позволяет высвобождать LNP и нуклеиновую кислоту. Различные ионизируемые липиды в настоящее время изучаются для повышения эффективности как распределения LNP, так и эндосомального побега14.
Другие типичные компоненты LNP включают хелперные липиды, такие как фосфатидилхолин (PC) или фосфоэтаноламин (PE) липид. 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC) и 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC) обычно используются хелперные липиды24,25. Было показано, что DOPE образует перевернутую гексагональную фазу II (HII) и усиливает трансфекцию путем слияния мембран26,в то время как DSPC, как полагают, стабилизирует ЛНП с его цилиндрической геометрией27. Холестерин также включен в состав для повышения жесткости мембраны, что впоследствии способствует стабильности LNP. Наконец, липид-конъюгированный полиэтиленгликоль (ПЭГ) включен в состав для обеспечения необходимого стерического барьера для помощи в самосборке частиц27. PEG также повышает стабильность хранения ЛНВ, предотвращая агрегацию. Кроме того, PEG часто используется в качестве скрытого компонента и может увеличить время циркуляции для ЛНП. Однако этот признак может также создавать проблемы для рекрутирования ЛНПц в гепатоциты через эндогенный механизм таргетирования, управляемый аполипопротеином Е (АпоЭ)28. Таким образом, исследования исследовали длину ациловой цепи для диффузии ПЭГ из LNP, обнаружив, что короткие длины (C8-14) диссоциируют от LNP и более поддаются набору ApoE по сравнению с более длинными ациламидлин 28. Кроме того, было показано, что степень насыщения липидного хвоста, с которым конъюгируется ПЭГ, влияет на распределение в тканях ЛНПц29. Недавно было показано, что Tween 20, который является широко используемым поверхностно-активным веществом в составах биологических лекарственных средств и имеет длинный ненасыщенный липидный хвост, имеет высокую трансфекцию в дренируемых лимфатических узлах по сравнению с PEG-DSPE, который в значительной степени трансфицировал мышцу в месте инъекции29. Этот параметр может быть оптимизирован для достижения желаемого биораспределения LNP.
Традиционные способы формирования ЛНФ включают метод тонкопленочной гидратации и метод впрыска этанола27. Хотя это легкодоступные методы, они также являются трудоемкими, могут привести к низкой эффективности инкапсуляции и сложно масштабировать до27. Достижения в методах смешивания привели к тому, что методы более поддаются масштабированию, в то же время разрабатывая более однородные частицы27. Эти методы включают смешивание Т-образных переходов, смешивание елочкой в шахматном порядке и микрофлюидную гидродинамическую фокусировку27. Каждый способ имеет уникальную структуру, но все они позволяют быстро смешивать водный этап, содержащий нуклеиновую кислоту, с органической фазой, содержащей липидные компоненты, что приводит к высокой инкапсуляции нуклеиновой кислоты27. В этом протоколе используется быстрое и контролируемое смешивание через микрофлюидный картридж, который использует конструкцию смешивания елочкой в шахматном порядке. Этот протокол описывает получение, сборку и характеристику нуклеиновых кислот, содержащих ЛНВ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

Носители лекарств на основе липидов использовались для клинически и коммерчески доступных систем доставки из-за их небольшого размера, биосовместимости и высокой эффективности инкапсуляции. Использование липидных наночастиц (ЛНФ) для инкапсуляции нуклеиновых кислот выгодно для защиты РНК или ДНК от деградации, а также способствует поглощению клеток. ЛНП часто содержат несколько липидных компонентов, включая ионизируемый липид, хелперный липид, холестерин и конъюгированный липид полиэтиленгликоля (ПЭГ). ЛНФ могут легко инкапсулировать нуклеиновые кислоты благодаря ионизируемому липидному присутствию, которое при низком рН является катионным и позволяет комплексовать с отрицательно заряженной РНК или ДНК. Здесь ЛНП образуются путем инкапсуляции матричной РНК (мРНК) или плазмидной ДНК (пДНК) с использованием быстрого смешивания липидных компонентов в органической фазе и компонента нуклеиновой кислоты в водной фазе. Это смешивание выполняется с использованием точной микрофлюидной платформы смешивания, позволяющей самосборку наночастиц при сохранении ламинарного потока. Гидродинамический размер и полидисперсность измеряются с помощью динамического рассеяния света (DLS). Эффективный поверхностный заряд на LNP определяется путем измерения дзета-потенциала. Эффективность инкапсуляции характеризуется с использованием флуоресцентного красителя для количественной оценки застрявленной нуклеиновой кислоты. Репрезентативные результаты демонстрируют воспроизводимость этого метода и влияние, которое различные рецептурные и технологические параметры оказывают на разработанные ЛМП.

Несколько партий ЛНП с одинаковым липидным составом и соотношением N/P 6 были разработаны в отдельные дни, чтобы продемонстрировать воспроизводимость метода. Партии 1 и 2 привели к перекрытию размерных распределений с аналогичной полидисперсностью(рисунок 2...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Липидные наночастицы разработаны с использованием микрофлюидного подхода к смешиванию платформы для инкапсуляции мРНК и ДНК.

Формулирование и характеристика липидных наночастиц для доставки генов с использованием платформы микрофлюидного смешивания

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Этот протокол может быть использован для получения инкапсулированных липидных наночастиц нуклеиновых кислот с высокой воспроизводимостью и скоростью и низкими объемами. Параметры состава могут быть настроены для достижения желаемого биораспределения на основе клинического применения. Стандартная конструкция картриджа «елочка» обеспечивает быстрый, точный и контролируемый ламинарной поток во время перемешивания.Метод поддается масштабированию и генерирует однородные, высокоинкапсулированные частицы. Поскольку большинство коммерчески одобренных продуктов генной терапии полагаются на вирусные методы, эта процедура может дать представление о доставке генов, поскольку ее невирусный подход позволяет использовать приложения, для которых необходимо повторное дозирование. Начните с добавления соответствующего количества каждого жидкого раствора в стеклянный флакон с прерывистым вихрем.как указано в таблице, с последующим добавлением 200 пробного этанола к конечному объему в 533 микролитра. Затем добавляют соответствующее количество запаса мРНК и разбавляют цитратным буфером для достижения конечного объема в 1,5 миллилитра при желаемой концентрации. Чтобы загрунтовать микрофлюидные каналы, сначала введите параметр грунтовки в программное обеспечение прибора, как указано в таблице.Затем откройте крышку прибора и поместите микрофлюидный картридж во вращающийся блок. Загрузите не менее 500 микролитров этанола в шприц размером 1 миллилитр, позаботясь о том, чтобы на кончике шприца не было пузырьков или воздушных зазоров, и вставьте шприц в правое отверстие картриджа. Загрузите пятимиллилитровой шприц с 1,5 миллилитрами цитратного буфера, заботясь о том, чтобы не было пузырьков воздуха или зазоров, и вставьте шприц в левое впускное отверстие картриджа.Поместите две конические трубки по 15 миллилитров в держатели зажимов, чтобы они служили контейнерами для отходов, и нажмите кнопку «Перейти», чтобы смешать растворы. Когда инструмент перестанет грунтовать, как указано отключением нижнего синего света, откройте поздний и правильно утилизируйте конические трубки и шприцы. Для образования липидных наночастиц устанавливают соответствующие параметры состава, как указано в таблице, и нагружают шприц 1 миллилитр предварительно приготовленной липидной смесью.Удалите воздушные зазоры или пузырьки в наконечнике шприца и вставьте шприц в правую сторону картриджа. Загрузите предварительно приготовленный раствор нуклеиновой кислоты в шприц 3 миллилитра, позаботясь о том, чтобы в наконечнике шприца не было пузырьков или воздушных зазоров, и вставьте шприц в левое отверстие картриджа. Поместите 15-миллилитровую коническую трубку без РНКАазы, помеченную именем образца, в левый зажим трубки и поместите 15-миллилитровый конический отработанный конический в правый зажим трубки.Закройте крышку прибора и нажмите Go.Растворы липидов и мРНК будут протекать через микрофлюидный картридж, а раствор липидных наночастиц будет собран в конические трубки. Сохраните коническую трубку в конце процесса рецептуры, затем разбавьте липидные наночастицы 5 миллилитрами PBS и шкафом биологической безопасности. Чтобы выполнить буферный обмен, сначала предварительно промыть ультрацентрифужный фильтр размером 100 килодалтонов с 2 миллилитрами PBS, центрифугой, а затем опорожнить PBS из нижнего отсека.Добавьте разбавленные липидные наночастицы в верхний отсек предварительно промытого ультрацентрифужного фильтра для трех промывок центрифуги, отбрасывая проточную часть и добавляя 5 миллилитров PBS в ультрацентрифужный фильтр после первых двух промывок. После последней промывки пипеткой раствор липидных наночастиц против стенок ультрацентрифуги фильтруют несколько раз, чтобы свести к минимуму потери наночастиц перед переносом раствора наночастиц во флакон без нуклеазы. Затем добавляют PBS, чтобы довести суспензию наночастиц до соответствующей экспериментальной концентрации и объема по мере необходимости.Для оценки эффективности инкапсуляции липидных наночастиц сначала готовят двукратные последовательные разведения рабочего раствора нуклеиновых кислот в PBS для получения стандартной кривой, начиная с 500 нанограмм на миллилитр и делая не менее пяти разведений. Затем подготовьте разбавление образца наночастиц в PBS для достижения соответствующей теоретической концентрации, которая лежит вокруг средней точки стандартной кривой. Затем готовят рибозеленый РНК-реагент для обнаружения присутствия РНК как внутри, так и снаружи липидной наночастицы путем смешивания соответствующих количеств РНК-реагента, Triton X100 и PBS.Затем, чтобы обнаружить присутствие РНК вне жидкой наночастицы, смешайте соответствующие количества РНК-реагентов и только PBS. Load реплицирует стандартные растворы нуклеиновых кислот и липидных наночастиц в черную флуоресцентную пластину с 96 скважинами, затем добавляет равный объем реагента количественной оценки РНК с Тритоном X100 и без него к стандарту и образцу реплицируется. Встряхните пластину в считывателе пластин в течение пяти минут при комнатной температуре, защищенной от света, чтобы получить тщательное перемешивание образцов, затем измерьте флуоресценцию на считывателе микропластин при длине волны возбуждения 480 нанометров и длине волны излучения 520 нанометров.Чтобы измерить гидродинамический размер и полидисперсность липидных наночастиц, сначала разбавляют раствор наночастиц 40 раз в PBS и добавляют раствор в полумикрокювету. Загрузите кювету на Zetasizer и выберите стандартную рабочую процедуру, чтобы настроить прибор для измерения наночастиц в соответствии с их материалом, диспергатором, температурой и типом ячейки. Затем нажмите кнопку «Пуск», чтобы измерить гидродинамический размер и полидисперсность липидных наночастиц.Чтобы измерить дзета-потенциал липидных наночастиц, разбавляют раствор наночастиц 40 раз в воде без нуклеаз и загружают раствор в кювету к линии заполнения. Загрузите кювету в анализатор потенциала Зета, позаботившись о том, чтобы электроды контактировали с инструментом, и установите инструмент для измерения Дзета-потенциала в соответствии с конкретным составом липидных наночастиц. Затем нажмите кнопку «Пуск», чтобы измерить потенциал наночастиц липидов Zeta.В этом анализе в отдельные дни были разработаны несколько партий липидных наночастиц с одинаковым липидным составом и соотношением амина к фосфату, чтобы продемонстрировать воспроизводимость метода. Как было отмечено, одна и две партии демонстрировали перекрывающиеся распределения размеров с аналогичной полидисперсностью, при этом не наблюдалось существенных различий в размере или эффективности инкапсуляции между партиями. Как правило, изменения в параметрах рецептуры вызывают некоторые небольшие, но статистически значимые различия.Например, уменьшение соотношения аминов и фосфатов приводит к снижению эффективности инкапсуляции на 4% с сопутствующим увеличением гидродинамического диаметра наночастиц. Липидные наночастицы, составленные с различными ионизируемыми липидами, но одинаковым соотношением аминов к фосфатам, демонстрируют значительное изменение эффективности инкапсуляции, а также небольшие различия в диаметре частиц. Инкапсуляция плазмидной ДНК приводит к более крупным частицам по сравнению с mRA, инкапсулирующим липидные наночастицы, хотя оба типа наночастиц демонстрируют одинаковую эффективность инкапсуляции.Однако изменения параметра скорости потока не влияют на развитие липидных наночастиц. Липидные наночастицы имеют большое применение, прекрасным примером являются недавно одобренные вакцины против COVID-19. Этот метод служит отличным набором инструментов и прокладывает путь для будущих применений, позволяя проводить скрининг состава нижних конечностей.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Доставка генов и Трансфекция в человеческий рак поджелудочной железы клетки, используя эпидермального фактора роста рецепторов ориентированных Желатин основе Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Оценка Полимерные доставки генов наночастиц наночастиц Анализ отслеживания и высокой пропускной проточной цитометрии

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Сотовый Сжатие как Robust, микрофлюидных внутриклеточного Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Липидов Bilayer везикул поколения Использование микрофлюидных струйное

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Анализируя смешивания неоднородности в микрожидкостных устройств по Микромасштабные шлирен техники

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Твердые липидов Наночастицы (SLNS) для внутриклеточного Ориентация Приложения

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Микрожидком Платформа с высокой пропускной способностью изоляции одноклеточные и культуры

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Микрожидкостных Платформа с уплотненными электронным детектором для пространственного слежения частиц

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Microfluidic платформа для продольной Imaging в Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...