Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Tack till Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger och Philip Zakas för deras vägledning och bidrag till LNP:s utveckling.

Ett schema över den övergripande processen finns i figur 1.
1. Utarbetande av buffertar
OBS: Steril filtrering av buffertarna föreslås här starkt för att ta bort eventuella partiklar som kan påverka nukleinsyran och LNP-kvaliteten.
<ol><li>Fosfatbuffrad saltlösning (PBS)<ol>
<li>Förbered 1x PBS med 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl och 2,7 mM KCl i nukleasfritt vatten och juster...

<ol>
	<li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery.">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li><li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).</li><li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano+based+drug+delivery+systems:+recent+developments+and+future+prospects.">Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects.</a> J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).</li><li>Rai, R., Alwani, S., Badea, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles+in+gene+therapy:+New+avenues+of+design+and+optimization+for+delivery+applications.">Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications.</a> Polymers. 11 (4), 745 (2019).</li><li>Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+polymer+micelles+of+controlled+size,+stability,+and+functionality+for+siRNA+delivery.">Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery.</a> ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li><li>Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer+probing+of+assembly+and+disassembly+of+short+interfering+RNA/Poly(ethylene+glycol)-Poly-L-Lysine+polyion+complex+micelles.">F&#246;rster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles.</a> Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).</li><li>Puri, A., Loomis, K., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+nanoparticles+as+pharmaceutical+drug+carriers:+from+concepts+to+clinic.">Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic.</a> Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).</li><li>Cullis, P. R., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+systems+for+enabling+gene+therapies.">Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies.</a> Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).</li><li>Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+to+the+center+of+the+cell:+Current+Nanocarrier+design+strategies+targeting+biopharmaceuticals+to+the+cytoplasm+an+nucleus.">Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).</li><li>Zhao, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+gene+delivery.">Lipid nanoparticles for gene delivery.</a> Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+in+vivo+potency+of+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).</li><li>Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+delivery+systems+for+siRNA-based+therapeutics.">Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics.</a> Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).</li><li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies:+From+concepts+to+clinical+utility.">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).</li><li>Shin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+development+and+a+potential+nanomaterial+path+forward.">COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward.</a> Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).</li><li>Thanh Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COVID-19+vaccine+development+landscape.">The COVID-19 vaccine development landscape.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).</li><li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery.">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).</li><li>Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+lipid+nanoparticles.">mRNA lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2019).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Suzuki, Y., Ishihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+activity+and+uptake+mechanism+of+siRNA-lipid+nanoparticles+with+an+asymmetric+ionizable+lipid.">Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid.</a> International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+environment+in+endocytic+compartments.">The acidic environment in endocytic compartments.</a> Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).</li><li>Maugeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+endosomal+escape+of+LNP-mRNA+and+loading+into+EVs+for+transport+to+other+cells.">Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li><li>Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Nanoscale. (45), (2019).</li><li>Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+whereby+cationic+lipids+promote+intracellular+delivery+of+polynucleic+acids.">On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids.</a> Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).</li><li>Hafez, I. M., Culis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lipid+polymorphism+in+intracellular+delivery.">Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).</li><li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery.">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).</li><li>Mui, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+polyethylene+glycol+lipid+desorption+rates+on+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+siRNA+lipid+nanoparticles.">Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).</li><li>Zukancic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+poly(Ethylene+glycol)+and+lipid+structure+in+targeted+gene+delivery+to+lymph+nodes+by+lipid+nanoparticles.">The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).</li><li>NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: <a target="_blank" href="https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas">https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas</a> (2020)</li><li>Kastner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+manufacturing+of+size-tuned+liposomes+by+a+new+microfluidics+method+using+enhanced+statistical+tools+for+characterization.">High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).</li><li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing.">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA.">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticles+for+intramuscular+administration+of+mRNA+vaccines.">Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+mRNA+to+colon+inflammatory+lesions+by+lipid-nano-particles+containing+environmentally-sensitive+lipid-like+materials+with+oleic+acid+scaffolds.">The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds.</a> Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).</li><li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+lipid+nanoparticles.">Nucleic acid lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2018).</li></ol>

Reproducerbarhet, hastighet och lågvolymscreening är betydande fördelar med att använda mikrofluidblandning för att bilda LNPs jämfört med andra befintliga metoder (t.ex. lipidfilmhydrering och etanolinjektion). Vi har visat reproducerbarheten av denna metod utan inverkan på inkapsling effektivitet eller partikel storlek observeras med olika LNP partier. Detta är ett viktigt kriterium för att alla terapeutiska, inklusive LNPs, ska bli kliniskt tillgängliga.
Tekniken som beskrivs hä...

Läkemedelsbärare används för att skydda och leverera en terapeutisk med typiska gynnsamma egenskaper inklusive låg cytotoxicitet, ökad biotillgänglighet och förbättrad stabilitet1,2,3. Polymera nanopartiklar, micelles och lipidbaserade partiklar har tidigare undersökts för nukleinsyrainkapsling ochleverans 4,5,6,7. Lipider har använts i olika typer av nanokarriersystem, inklusive liposomer, och lipidnanopartiklar, eftersom de är biokompatierbara medhög stabilitet 8. LNPs kan lätt kapsla in nukleinsyror för genleverans9,10. De skyddar nukleinsyran från nedbrytning genom serumproteaser undersystemcirkulationen 11 och kan förbättra leveransen till specifika platser, eftersom LNPs yttopografi och fysiska egenskaper påverkar deras biodistribution12. LNPs förbättrar också vävnad penetration och cellulär upptag9. Tidigare studier har visat framgången för siRNA-inkapsling inom en LNP13, inklusive den första kommersiellt tillgängliga LNP som innehåller siRNA terapeutisk för behandling polyneuropati av ärftlig transthyretin-medierad amyloidos14-behandling som godkändes av United States Food and Drug Administration (FDA) och European Medicines Agency 2018. På senare tid studeras LNPs för leverans av större nukleinsyramoieties, nämligen mRNA och DNA9. Från och med 2018 fanns det ~ 22 lipidbaserade nukleinsyraleveranssystem som genomgår kliniska prövningar14. Dessutom är mRNA som innehåller LNPs för närvarande ledande kandidater och har varit anställda för ett COVID-19-vaccin15,16. Den potentiella framgången för dessa icke-virala genterapier kräver att man bildar små (~ 100 nm), stabila och enhetliga partiklar med hög inkapsling av nukleinsyran.
Användning av en joniserbar lipid som huvudkomponent i LNP-formuleringen har visat fördelar för hy, inkapsling och leveranseffektivitet14. Joniserbara lipider har vanligtvis en syra dissociation konstant (pKa) < 7; till exempel har dilinoleylmetyl-4-dimetyllaminobutyrat (D-Lin-MC3-DMA), den joniserbara lipid som används i den FDA-godkända LNP-formuleringen, en pKa på 6,4417. Vid lågt pH blir aminegrupperna på joniserbara lipid protonerade och positivt laddade, vilket möjliggör montering med negativt laddade fosfatgrupper på mRNA och DNA. Förhållandet mellan amin, "N", grupper till fosfat, "P", grupper används för att optimera enheten. N/P-förhållandet är beroende av de lipider och nukleinsyror som används, vilket varierar beroende på formuleringen18. Efter bildandet kan pH-h justeras till ett neutralt eller fysiologiskt pH för att möjliggöra terapeutisk administrering. Vid dessa pH-värden avprotoneras också den joniserbara lipiden som ger neutral ytladdning till LNP.
Den joniserbara lipiden hjälper också till i endosomal flykt19,20. LNPs genomgår endocytos under cellulärt upptag och måste släppas ut från endomen för att leverera mRNA-lasten till cellcytoplasman eller DNA-lasten till kärnan21. Inuti endosomen är vanligtvis en surare miljö än det extracellulära mediet, vilket gör den joniserbara lipiden positivt laddad22,23. Den positivt laddade joniserbara lipiden kan interagera med negativa laddningar på det endosomala lipidmembranet, vilket kan orsaka destabilisering av endosomen som möjliggör frisättning av LNP och nukleinsyra. Olika joniserbara lipider studeras för närvarande för att förbättra effektiviteten av både LNP-distribution, liksom endosomal escape14.
Andra typiska komponenter i en LNP inkluderar hjälpare lipider, såsom en fosfatidylkolin (PC) eller fosfoethanolamine (PE) lipid. 1,2-Dioleoyl-sn -glycero-3-fosfoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DSPC) och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) används ofta hjälpare lipider24,25. DOPE har visat sig bilda en inverterad sexkantig II (HII) fas och förbättra transfection av membran fusion26, medan DSPC har tänkts stabilisera LNPs med sin cylindriska geometri27. Kolesterol ingår också i formuleringen för att öka membranstelheten och därefter bidra till LNP: s stabilitet. Slutligen ingår lipidkonjugerad polyetylenglykol (PEG) i formuleringen för att ge den nödvändiga steriska barriären för att underlätta partikelns självmontering27. PEG förbättrar också lagringsstabiliteten hos LNP:er genom att förhindra aggregering. Dessutom används PEG ofta som en stealth-komponent och kan öka cirkulationstiden för LNPs. Detta attribut kan dock också innebära utmaningar för rekrytering av ache-adresser till hepatocyter genom en endogen målmekanism som drivs av apolipoprotein E (ApoE)28. Studier har således undersökt alamylkedjelängden för diffusion av PEG från LNP och funnit att korta längder (C8-14) avviker från LNP och är mer mottagliga för ApoE-rekrytering jämfört med längre ayllängder28. Vidare har graden av mättnad av lipidsvansen som PEG är konjugerad till visat sig påverka vävnadsfördelningen av LNPs29. Nyligen visade sig Tween 20, som är ett vanligt tensid i biologiska läkemedelsformuleringar och har en lång omättad lipidsvans, ha hög transfektion i dränerande lymfkörtlar jämfört med PEG-DSPE, som till stor del transfekterade muskeln vid injektionsstället29. Denna parameter kan optimeras för att uppnå önskad LNP-biodistribution.
Konventionella metoder för att bilda LNPs inkluderar tunnfilmshydreringsmetoden och etanolinjektionsmetoden27. Även om dessa är lättillgängliga tekniker, är de också arbetsintensiva, kan resultera i låg inkapslingseffektivitet och är utmanande att skala upp27. Framsteg inom blandningsteknik har resulterat i metoder som är mer mottagliga för att skala upp, samtidigt som mer enhetliga partiklar27. Dessa metoder inkluderar T-junction blandning, förskjutna fiskben blandning och mikrofluidic hydrodynamiskafokusering 27. Varje metod har en unik struktur, men alla möjliggör snabb blandning av en vattenfas som innehåller nukleinsyran med en organisk fas som innehåller lipidkomponenterna, vilket resulterar i hög inkapsling av nukleinsyran27. I detta protokoll används snabb och kontrollerad blandning genom en mikrofluidisk patron, som använder den förskjutna fiskbensblandningsdesignen. Det här protokollet beskriver förberedelse, sammansättning och karakterisering av nukleinsyra som innehåller LNPs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

Lipidbaserade läkemedelsbärare har använts för kliniskt och kommersiellt tillgängliga leveranssystem på grund av deras lilla storlek, biokompatibilitet och höga inkapslingseffektivitet. Användning av lipidnanopartiklar (LNPs) för att kapsla in nukleinsyror är fördelaktigt för att skydda RNA eller DNA från nedbrytning, samtidigt som cellulärt upptag främjas. LNPs innehåller ofta flera lipidkomponenter inklusive en joniserbar lipid, hjälpare lipid, kolesterol och polyetylenglykol (PEG) konjugerad lipid. LNPs kan lätt kapsla in nukleinsyror på grund av den joniserbara lipidförekomsten, som vid lågt pH-upphetsningsmedel och möjliggör hy med negativt laddat RNA eller DNA. Här bildas LNPs genom att kapsla in budbärar-RNA (mRNA) eller plasmid-DNA (pDNA) med snabb blandning av lipidkomponenterna i en organisk fas och nukleinsyrakomponenten i en vattenfas. Denna blandning utförs med hjälp av en exakt mikrofluidisk blandningsplattform, vilket möjliggör självmontering av nanopartiklar samtidigt som laminärt flöde bibehålls. Den hydrodynamiska storleken och polydispersiteten mäts med hjälp av dynamisk ljusspridning (DLS). Den effektiva ytladdningen på LNP bestäms genom att mäta zetapotentialen. Inkapslingseffektiviteten kännetecknas av ett fluorescerande färgämne för att kvantifiera inspädd nukleinsyra. Representativa resultat visar reproducerbarheten av denna metod och det inflytande som olika formulerings- och processparametrar har på de utvecklade LNP: erna.

Flera partier av LNPs med samma lipid formulering och N/P förhållandet 6 utvecklades på separata dagar för att visa reproducerbarhet av tekniken. Parti 1 och 2 resulterade i överlappande storleksfördelningar med liknande polydispersitet(figur 2A)Ingen signifikant skillnad observerades i storleks- eller inkapslingseffektiviteten mellan de två olika partier(figur 2B). Inkapslingseffektiviteten var hög för varje sats (>98,5...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipidnanopartiklar utvecklas med hjälp av en mikrofluidisk blandningsplattform för mRNA- och DNA-inkapsling.

Formulera och karakterisera Lipid Nanopartiklar för genleverans med hjälp av en mikrofluidisk blandningsplattform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Detta protokoll kan användas för att producera nukleinsyra inkapslade lipidnanopartiklar med hög reproducerbarhet och hastighet och låga volymer. Formuleringsparametrarna kan justeras för att uppnå en önskad biofördelning baserad på den kliniska tillämpningen. Mikrofluidpatronens standardsillbensdesign möjliggör ett snabbt, exakt och kontrollerat laminärt flöde under blandningen.Metoden är mottaglig för att skala upp och genererar enhetliga, mycket inkapslade partiklar. Med de flesta kommersiellt godkända genterapiprodukter som förlitar sig på virusmetoder kan detta förfarande ge insikt i genleverans, eftersom dess icke-virala tillvägagångssätt tillåter applikationer för vilka upprepad dosering är nödvändig. Börja med att tillsätta lämplig mängd av varje vätskelagerlösning till en glasflaska med intermittent virvel.Enligt tabellen, följt av tillsats av 200 korrektur etanol till en slutlig volym på 533 mikroliter. Tillsätt sedan lämplig mängd mRNA-lager och späd med citratbuffert för att uppnå en slutlig volym på 1,5 milliliter vid önskad koncentration. För att prime de mikrofluidiska kanalerna, ange först primingparametern i instrumentprogramvaran som beskrivs i tabellen.Öppna sedan instrumentlocket och placera en mikrofluidpatron i det roterande blocket. Ladda minst 500 mikroliter etanol i en 1 milliliter spruta, var försiktig så att det inte finns några bubblor eller luftspalter vid sprutspetsen och för in sprutan i patronens högra inlopp. Ladda en fem milliliter spruta med 1,5 milliliter citratbuffert, se till att det inte finns några luftbubblor eller luckor och sätt in sprutan i patronens vänstra inlopp.Placera två 15 milliliter koniska rör i klämhållarna för att fungera som avfallsbehållare och klicka på Gå"för att blanda lösningarna. När instrumentet slutar priming som indikeras av det nedre blå ljuset stängs av, öppna den sena och korrekt kasserade koniska rören och sprutorna. För lipidnanopartiklar, ställ in lämpliga formuleringsparametrar som anges i tabellen och ladda en 1 milliliter spruta med en tidigare beredd lipidblandning.Ta bort eventuella luftspalter eller bubblor i sprutspetsen och för in sprutan i patronens högra sida. Ladda den tidigare beredda nukleinsyralösningen i en 3 milliliter spruta, ta hand om att det inte finns några bubblor eller luftspalter i sprutspetsen och sätt in sprutan i patronens vänstra inlopp. Placera ett RNAase-fritt koniskt rör på 15 milliliter märkt med provnamnet i den vänstra rörklämman och placera en 15 milliliter avfallskonisk i höger rörklämma.Stäng instrumentlocket och klicka på Go.Lipid- och mRNA-lösningarna flödar genom mikrofluidpatronen och lipidnanopartiklarlösningen samlas i de koniska rören. Behåll det koniska röret i slutet av formuleringsprocessen och späd sedan lipidnanopartiklarna med 5 milliliter PBS och ett biologiskt säkerhetsskåp. För att utföra ett buffertutbyte, förtvätta först ett ultracentrifugefilter i 100 kilodaltonsporstorlek med 2 milliliter PBS, centrifug och töm sedan PBS från det nedre facket.Tillsätt de utspädda lipidnanopartiklarna i det övre facket i det förtvättade ultracentrifugfiltret för tre centrifugetvättar, kassera genomflödet och tillsätt 5 milliliter PBS till ultracentrifugfiltret efter de två första tvättarna. Efter den senaste tvätten, pipett lipid nanopartikellösningen mot väggarna i ultracentrifuge filtret några gånger för att minimera nanopartiklar förlusten innan du överför nanopartiklarlösningen till en nukleasfri flaska. Tillsätt sedan PBS för att vid behov få nanopartikelupphängningen till lämplig experimentell koncentration och volym.För att bedöma inkapslingseffektiviteten hos lipidnanopartiklarna bereder du först tvåfaldiga seriella utspädningar av arbetsnukleinsyralösningen i PBS för att generera en standardkurva, från 500 nanogram per milliliter och med minst fem utspädningar. Förbered sedan nanopartikelprovutspädningarna i PBS för att uppnå en lämplig teoretisk koncentration som ligger runt mittpunkten i standardkurvan. Förbered sedan ribogrönt RNA-reagens för att upptäcka förekomst av RNA både inuti och utanför lipidnanopartiklarna genom att blanda lämpliga mängder RNA-reagens, Triton X100 och PBS.Sedan, för att upptäcka närvaron av RNA utanför den flytande nanopartikeln, blanda endast lämpliga mängder RNA-reagenser och PBS. Belastningen replikerar av nukleinsyrastandarden och lipidnanopartiklarlösningarna till en svart fluorescensduglig 96 brunnsplatta och tillsätt sedan en lika stor volym RNA-kvantifieringsreagens med och utan Triton X100 till standard- och provreplikerna. Skaka plattan i plåtläsaren i fem minuter vid rumstemperatur skyddad från ljus för att få en grundlig blandning av proverna och mät sedan fluorescensen på en mikroplåtläsare vid en excitationsvåglängd på 480 nanometer och en emissionsvåglängd på 520 nanometer.För att mäta lipidnanopartiklarnas hydrodynamiska storlek och polydispersion späd först nanopartiklarlösningen 40 gånger i PBS och tillsätt lösningen till en halvmikro cuvette. Ladda cuvette på Zetasizer och välj ett standardförfarande för att ställa in instrumentet för att mäta nanopartiklarna enligt deras material, dispergeringsmedel, temperatur och celltyp. Klicka sedan på Start" för att mäta lipidnanopartiklarnas hydrodynamiska storlek och polyspridning.För att mäta Zeta-potentialen hos lipidnanopartiklar, späd nanopartiklarnas lösning 40 gånger i nukleasfritt vatten och ladda lösningen i en cuvette till fyllningslinjen. Ladda cuvette i en Zeta potentiell analysator, var försiktig så att elektroderna kommer i kontakt med instrumentet och ställ in instrumentet för att mäta Zeta-potentialen enligt lipidnanopartiklarnas specifika makeup. Klicka sedan på Start"för att mäta Zeta lipid nanopartikelpotential.I denna analys utvecklades flera partier lipid nanopartiklar med samma lipid formulering och aminer till fosfat förhållandet på separata dagar för att visa reproducerbarheten av tekniken. Som observerats uppvisade partier ett och två överlappande storleksfördelningar med liknande polyspridning, utan några signifikanta skillnader i storlek eller inkapslingseffektivitet mellan satserna. Vanligtvis inducerar förändringar i formuleringsparametrarna några små men statistiskt signifikanta skillnader.Till exempel resulterar en minskning av inkapslingseffektiviteten med en minskning av amin-fosfatförhållandet med 4 %, med en samtidig ökning av nanopartiklarnas hydrodynamiska diameter. Lipidnanopartiklar formulerade med olika joniserbara lipider men samma förhållandet mellan amning och fosfat uppvisar en betydande förändring av inkapslingseffektiviteten samt små skillnader i partikeldiametern. Inkapsling av plasmid-DNA resulterar i större partiklar jämfört med mRA-inkapsling av lipidnanopartiklar, även om båda typerna av nanopartiklar uppvisar en liknande inkapslingseffektivitet.Förändringar i flödeshastighetsprocessens parameter påverkar dock inte lipidnanopartiklarnas utveckling. Lipidnanopartiklar har bra tillämpningar, det perfekta exemplet är de nyligen godkända COVID-19-vaccinerna. Denna teknik fungerar som en bra verktygsuppsättning och banar väg för framtida applikationer genom att tillåta screening av nedre extremiteter.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Delivery och Transfektion i mänskliga celler bukspottkörtelcancer med Epidermal Growth Factor Receptor-riktade Gelatin-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell Klämma som en robust, mikroflödes Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddubbelskiktet Blås Generation Använda Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analysera Blandning homogen i en mikroflödessystem enhet med Micro Schlieren Teknik

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipid Nanopartiklar (SLNs) för Intracellulär Targeting Tillämpningar

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikroflödessystem plattform för hög genomströmning Single-cell isolering och kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikroflödes Plattform med Multiplex elektronisk detektering för rumslig Spårning av partiklar

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En mikroflödessystem plattform för längsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...