Name: formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger ve Philip Zakas'a LNP gelişimine yönelik rehberlikleri ve katkıları için teşekkür ederiz.

Şekil 1 'de genel işlemin şeması verilmiştir.
1. Tamponların hazırlanması
NOT: Tamponların steril filtrelanması, nükleik asit ve LNP kalitesini etkileyebilecek partikülleri çıkarmak için burada şiddetle tavsiye edilir.
<ol><li>Fosfat Tamponlu Tuzlu (PBS)<ol>
<li>Nükleaz içermeyen suda 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl ve 2,7 mM KCl kullanarak 1x PBS hazırlayın ve pH'?...

<ol>
	<li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery.">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li><li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).</li><li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano+based+drug+delivery+systems:+recent+developments+and+future+prospects.">Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects.</a> J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).</li><li>Rai, R., Alwani, S., Badea, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles+in+gene+therapy:+New+avenues+of+design+and+optimization+for+delivery+applications.">Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications.</a> Polymers. 11 (4), 745 (2019).</li><li>Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+polymer+micelles+of+controlled+size,+stability,+and+functionality+for+siRNA+delivery.">Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery.</a> ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li><li>Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer+probing+of+assembly+and+disassembly+of+short+interfering+RNA/Poly(ethylene+glycol)-Poly-L-Lysine+polyion+complex+micelles.">F&#246;rster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles.</a> Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).</li><li>Puri, A., Loomis, K., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+nanoparticles+as+pharmaceutical+drug+carriers:+from+concepts+to+clinic.">Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic.</a> Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).</li><li>Cullis, P. R., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+systems+for+enabling+gene+therapies.">Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies.</a> Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).</li><li>Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+to+the+center+of+the+cell:+Current+Nanocarrier+design+strategies+targeting+biopharmaceuticals+to+the+cytoplasm+an+nucleus.">Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).</li><li>Zhao, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+gene+delivery.">Lipid nanoparticles for gene delivery.</a> Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+in+vivo+potency+of+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).</li><li>Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle+delivery+systems+for+siRNA-based+therapeutics.">Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics.</a> Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).</li><li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies:+From+concepts+to+clinical+utility.">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).</li><li>Shin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+development+and+a+potential+nanomaterial+path+forward.">COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward.</a> Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).</li><li>Thanh Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COVID-19+vaccine+development+landscape.">The COVID-19 vaccine development landscape.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).</li><li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery.">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).</li><li>Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+lipid+nanoparticles.">mRNA lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2019).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Suzuki, Y., Ishihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+activity+and+uptake+mechanism+of+siRNA-lipid+nanoparticles+with+an+asymmetric+ionizable+lipid.">Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid.</a> International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+environment+in+endocytic+compartments.">The acidic environment in endocytic compartments.</a> Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).</li><li>Maugeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+endosomal+escape+of+LNP-mRNA+and+loading+into+EVs+for+transport+to+other+cells.">Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li><li>Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA.">On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Nanoscale. (45), (2019).</li><li>Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+whereby+cationic+lipids+promote+intracellular+delivery+of+polynucleic+acids.">On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids.</a> Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).</li><li>Hafez, I. M., Culis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lipid+polymorphism+in+intracellular+delivery.">Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).</li><li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery.">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).</li><li>Mui, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+polyethylene+glycol+lipid+desorption+rates+on+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+siRNA+lipid+nanoparticles.">Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).</li><li>Zukancic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+poly(Ethylene+glycol)+and+lipid+structure+in+targeted+gene+delivery+to+lymph+nodes+by+lipid+nanoparticles.">The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).</li><li>NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: <a target="_blank" href="https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas">https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas</a> (2020)</li><li>Kastner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+manufacturing+of+size-tuned+liposomes+by+a+new+microfluidics+method+using+enhanced+statistical+tools+for+characterization.">High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).</li><li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing.">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA.">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticles+for+intramuscular+administration+of+mRNA+vaccines.">Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+mRNA+to+colon+inflammatory+lesions+by+lipid-nano-particles+containing+environmentally-sensitive+lipid-like+materials+with+oleic+acid+scaffolds.">The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds.</a> Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).</li><li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+lipid+nanoparticles.">Nucleic acid lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2018).</li></ol>

Tekrarlanabilirlik, hız ve düşük hacimli tarama, diğer mevcut yöntemlere (örneğin, lipid film hidrasyon ve etanol enjeksiyonu) kıyasla LNP'leri oluşturmak için mikroakışkan karıştırma kullanmanın önemli avantajlarıdır. Bu yöntemin tekrarlanabilirliğini, farklı LNP partileriyle gözlenen kapsülleme verimliliği veya partikül boyutu üzerinde hiçbir etkisi olmadan gösterdik. Bu, LNP'ler de dahil olmak üzere herhangi bir terapötik tedavinin klinik olarak kullanılabilir hale gelmesi için gerekl...

İlaç taşıyıcıları, düşük sitotoksiklik, artan biyoyararlanlık ve gelişmiş stabilite1,2,3dahil olmak üzere tipik elverişli özelliklere sahip bir terapötik korumak ve sunmak için kullanılır. Polimerik nanopartiküller, miseller ve lipid bazlı parçacıklar daha önce nükleik asit kapsülleme ve teslimi için araştırılmıştır4,5,6,7. Lipitler, yüksek stabilite ile biyouyumlu oldukları için lipozomlar ve lipid nanopartiküller de dahil olmak üzere farklı nanokarrier sistemlerinde kullanılmıştır8. LNP'ler gen iletimi için nükleik asitleri kolayca kapsülleyebilir9,10. Sistemik dolaşım11 sırasında nükleik asidi serum proteazları tarafından bozulmaya karşı korurlar ve LNP'lerin yüzey topografyası ve fiziksel özellikleri biyodistribution12'yietkilediği için belirli bölgelere teslimatı artırabilirler. LNP'ler ayrıca doku penetrasyonunu ve hücresel alımı iyileştirir9. Önceki çalışmalar, 2018 yılında Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) ve Avrupa İlaç Ajansı tarafından onaylanan kalıtsal transtiretein aracılı amiloidoz14 tedavisinin tedavi polinöropatisi için siRNA terapötik içeren ilk ticari olarak mevcut LNP de dahil olmak üzere, bir LNP13içinde siRNA kapsüllemenin başarısını göstermiştir. Daha yakın zamanda, LNP'ler daha büyük nükleik asit moieties, yani mRNA ve DNA9'unteslimi için çalışılmaktadır. 2018 itibariyle, klinik çalışmalardan geçen ~ 22 lipid bazlı nükleik asit iletim sistemi vardı14. Ek olarak, LNP'leri içeren mRNA şu anda önde gelen adaylardır ve COVID-19 aşısı15,16için istihdam edilmiştir. Bu viral olmayan gen tedavileri için potansiyel başarı, nükleik asidin yüksek kapsüllenmesine sahip küçük (~100 nm), kararlı ve düzgün parçacıklar oluşturmayı gerektirir.
LNP formülasyonunda ana bileşen olarak iyotlu bir lipit kullanımı karmaşıklık, kapsülleme ve teslimat efekti14için avantajlar göstermiştir. Iyâne edilebilir lipitler tipik olarak 7 < asit ayrışma sabiti (pKa) vardır; örneğin, DILINOLEYLMETHYL-4-dimetilaminobütirat (D-Lin-MC3-DMA), FDA onaylı LNP formülasyonunda kullanılan iyonlaşabilir lipit, 6.4417pKa'ya sahiptir. Düşük pH'da, iyotlanabilir lipid üzerindeki amin grupları protonlanır ve pozitif olarak şarj edilir, bu da mRNA ve DNA'da negatif yüklü fosfat grupları ile montaja izin verir. Amin oranı, "N", gruplar fosfat, "P", gruplar montajı optimize etmek için kullanılır. Yok oranı, formülasyona bağlı olarak değişen lipitlere ve kullanılan nükleik asitlere bağlıdır18. Oluşumdan sonra, pH terapötik uygulama için nötr veya fizyolojik bir pH'a ayarlanabilir. Bu pH değerlerinde, iyotlanabilir lipit de LNP'ye nötr yüzey yükü veren deprotonated edilir.
Iyotlu lipid ayrıca endosomal kaçış19,20. LNP'ler hücresel alım sırasında endositoz geçirir ve mRNA kargosunu hücre sitoplazması veya DNA kargosuna çekirdek21'eteslim etmek için endozomdan salınmalıdır. Endozom içinde tipik olarak hücre dışı ortamdan daha asidik bir ortam vardır, bu da iyotlanabilir lipidi pozitif yüklü hale getirir22,23. Pozitif yüklü iyonizlenebilir lipid, endosomal lipid zarındaki negatif yüklerle etkileşime girebilir, bu da endozomun LNP ve nükleik asidin salınmasına izin veren istikrarsızlaşmasına neden olabilir. Farklı iyotlanabilir lipitler şu anda hem LNP dağılımının hem de endosomal kaçış14'ün etkinliğini artırmak için incelenmektedir.
Bir LNP'nin diğer tipik bileşenleri arasında fosfatidikolin (PC) veya fosfotitananolamin (PE) lipid gibi yardımcı lipitler bulunur. 1,2-Dioleoyl-sn-glisero-3-fosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-fosphocholine (DSPC) ve 1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) yaygın olarak kullanılan yardımcı lipitler24,25. DOPE'un ters altıgen II (HII) fazı oluşturduğu ve membran füzyonu26ile transfeksiyonu artırdığı gösterilmiştir, DSPC'nin silindirik geometrisi27ile LNP'leri stabilize ettiği düşünülmektedir. Kolesterol ayrıca membran sertliğini artırmak için formülasyona dahil edilir ve daha sonra LNP'nin stabilitesine yardımcı olan. Son olarak, lipid konjuge polietilen glikol (PEG), parçacık kendi kendine montajına yardımcı olmak için gerekli sterik bariyeri sağlamak için formülasyona dahil edilir27. PEG ayrıca toplamayı önleyerek LNP'lerin depolama kararlılığını artırır. Ayrıca, PEG genellikle gizli bir bileşen olarak kullanılır ve LNP'ler için dolaşım süresini artırabilir. Bununla birlikte, bu özellik, apolipoprotein E (ApoE)28tarafından yönlendirilen endojen bir hedefleme mekanizması aracılığıyla LNP'lerin hepatositlere işe alınması için de zorluklar doğurabilir. Bu nedenle, çalışmalar PEG'in LNP'den yayılması için acyl zincir uzunluğunu araştırmıştır, kısa uzunlukların (C8-14) LNP'den ayrıştığını ve daha uzun acyl uzunluklarına kıyasla ApoE işe alımına daha uygun olduğunu tespitederek 28. Ayrıca, PEG'in eşlendiği lipid kuyruğunun doygunluk derecesinin LNP'lerin doku dağılımını etkilediği gösterilmiştir29. Son zamanlarda, biyolojik ilaç ürünü formülasyonlarında yaygın olarak kullanılan bir yüzey aktif madde olan ve uzun bir doymamış lipit kuyruğuna sahip olan Tween 20'nin, enjeksiyon bölgesinde kası büyük ölçüde transktasyon yapan PEG-DSPE'ye kıyasla lenf düğümlerinin boşaltılmasında yüksek transfeksiyona sahip olduğu gösterilmiştir29. Bu parametre istenen LNP biyodistribution elde etmek için optimize edilebilir.
LNP'leri oluşturmanın geleneksel yöntemleri ince film hidrasyon yöntemini ve etanol enjeksiyon yönteminiiçerir 27. Bunlar kolayca kullanılabilen teknikler olsa da, aynı zamanda emek yoğundur, düşük kapsülleme verimliliğine neden olabilir ve27'yiölçeklendirmek zordur. Karıştırma tekniklerindeki gelişmeler, daha düzgün parçacıklar geliştirirken, ölçek büyütmek için daha uygun yöntemlerle sonuçlanmıştır27. Bu yöntemler arasında T-junction karıştırma, sendelemiş balıksırtı karıştırma ve mikroakışkan hidrodinamik odaklama27bulunur. Her yöntemin benzersiz bir yapısı vardır, ancak hepsi nükleik asidi içeren sulu bir fazın lipid bileşenlerini içeren organik bir fazla hızlı bir şekilde karıştırılmasına izin verir ve bu da nükleik asidin yüksek kapsüllenmesine neden27. Bu protokolde, kademeli balıksırtı karıştırma tasarımını kullanan mikroakışkan bir kartuş aracılığıyla hızlı ve kontrollü karıştırma kullanılır. Bu protokol, LNP'ler içeren nükleik asidin hazırlanmasını, montajını ve karakterizasyonunu özetler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880151P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l Graduated Filter Tips&#160; (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;l Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3&#946;-ol (Cholesterol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96 well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-380-813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable folded capillary cells</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, Pure 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand Semi-Micro Cuvette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Benchtop</td>
			<td>Precision Nanyosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate, Dihydrate, granular</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform

Lipid bazlı ilaç taşıyıcıları, küçük boyutları, biyouyumlulukları ve yüksek kapsülleme verimlilikleri nedeniyle klinik ve ticari olarak mevcut doğum sistemleri için kullanılmıştır. Nükleik asitleri kapsüllemek için lipid nanopartiküllerinin (LNP) kullanılması, RNA veya DNA'yı bozulmaya karşı korurken hücresel alımı teşvik etmek için avantajlıdır. LNP'ler genellikle iyotlu lipid, yardımcı lipid, kolesterol ve polietilen glikol (PEG) konjuge lipid dahil olmak üzere birden fazla lipit bileşeni içerir. LNP'ler, düşük pH'da katyonik olan ve negatif yüklü RNA veya DNA ile komplekslenme sağlayan iyonizlenebilir lipid varlığı nedeniyle nükleik asitleri kolayca kapsülleyebilir. Burada LNP'ler, lipid bileşenlerinin organik bir fazda ve nükleik asit bileşeninin sulu bir fazda hızlı bir şekilde karıştırılması kullanılarak haberci RNA (mRNA) veya plazmid DNA'nın (pDNA) kapsüllenerek oluşturulur. Bu karıştırma, laminar akışı korurken nanopartikül kendi kendine montajına izin vererek hassas bir mikroakışkan karıştırma platformu kullanılarak gerçekleştirilir. Hidrodinamik boyut ve polidisperite dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanılarak ölçülür. LNP üzerindeki etkili yüzey yükü, zeta potansiyeli ölçülerek belirlenir. Kapsülleme verimliliği, tuzaklanmış nükleik asidi ölçmek için floresan bir boya kullanılarak karakterize edilir. Temsili sonuçlar, bu yöntemin tekrarlanabilirliğini ve farklı formülasyon ve işlem parametrelerinin geliştirilen LNP'ler üzerindeki etkisini göstermektedir.

Tekniğin tekrarlanabilirliğini göstermek için ayrı günlerde aynı lipit formülasyonuna ve 6 N/P oranına sahip birden fazla LNP grubu geliştirilmiştir. Toplu iş 1 ve 2, benzer polidispersiteye sahip boyut dağılımlarının çakışmasına neden oldu (Şekil 2A) İki farklı parti arasındaki boyut veya kapsülleme verimliliğinde önemli bir fark gözlenmedi (Şekil 2B). Kapsülleme verimliliği her parti için yükse...

Watch this Scientific Journal Video about Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform at JoVE.com

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid nanopartikülleri mRNA ve DNA kapsülleme için mikroakışkan karıştırma platformu yaklaşımı kullanılarak geliştirilmiştir.

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Bu protokol, yüksek tekrarlanabilirlik ve hız ve düşük hacimli nükleik asit kapsüllenmiş lipid nanopartikülleri üretmek için kullanılabilir. Formülasyon parametreleri, klinik uygulamaya göre istenen biyo dağılımı elde etmek için ayarlanabilir. Mikroakışkan kartuşun standart balıksırtı tasarımı, karıştırma sırasında hızlı, hassas ve kontrollü bir laminar akış sağlar.Yöntem ölçekleme için uygun ve düzgün, yüksek kapsüllenmiş parçacıklar üretir. Viral yöntemlere dayanan ticari olarak onaylanmış gen terapisi ürünlerinin çoğunda, bu prosedür gen iletimi hakkında fikir verebilir, çünkü viral olmayan yaklaşımı, tekrar dosingin gerekli olduğu uygulamalara izin verir. Aralıklı girdaplı bir cam şişeye her sıvı stok çözeltisinin uygun miktarını ekleyerek başlayın.tabloda belirtildiği gibi, ardından 533 mikrolitrelik son hacme 200 prova etanol eklenmesi. Daha sonra uygun miktarda mRNA stoğu ekleyin ve istenen konsantrasyonda 1,5 mililitrelik son bir hacim elde etmek için sitrat tamponu ile seyreltin. Mikroakışkan kanalları astarlamak için, önce astar parametresini tabloda belirtildiği gibi enstrüman yazılımına girin.Ardından, cihazın kapağını açın ve dönen bloğa bir mikroakışkan kartuş yerleştirin. Şırınga ucunda kabarcık veya hava boşluğu olmamasına dikkat ederek en az 500 mikrolitre etanol'ü 1 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve şırıngayı kartuşun sağ girişine yerleştirin. Hava kabarcığı veya boşluk olmamasına dikkat ederek 1,5 mililitre sitrat tamponu ile beş mililitrelik bir şırınna yükleyin ve şırınnayı kartuşun sol girişine yerleştirin.Atık konteyneri olarak hizmet vermek için klips tutuculara iki adet 15 mililitrelik konik tüp yerleştirin ve çözümleri karıştırmak için Git"i tıklayın. Cihaz, alt mavi ışığın kapanmasıyla belirtildiği gibi astarlamayı durdurduğunda, geç açın ve konik tüpleri ve şırıngları uygun şekilde atın. Lipid nanopartikül oluşumu için, tabloda belirtildiği gibi uygun formülasyon parametrelerini ayarlayın ve daha önce hazırlanmış bir lipit karışımı ile 1 mililitrelik bir şırınna yükleyin.Şırınd ucundaki hava boşluklarını veya kabarcıkları çıkarın ve şırınnayı kartuşun sağ tarafına yerleştirin. Daha önce hazırlanmış nükleik asit çözeltisini 3 mililitrelik bir şırınna yükleyin, şırıngam ucunda kabarcık veya hava boşluğu olmamasına dikkat edin ve şırınnayı kartuşun sol girişine yerleştirin. Örnek adıyla etiketlenmiş 15 mililitre RNAase içermeyen konik bir tüpü sol tüp klipsine yerleştirin ve sağ tüp klipsine 15 mililitrelik bir atık konik yerleştirin.Cihaz kapağını kapatın ve Go'yu tıklayın.Lipid ve mRNA çözeltileri mikroakışkan kartuştan akacak ve lipid nanopartikül çözeltisi konik tüplerde toplanacak. Formülasyon işleminin sonunda konik tüpü tutun, ardından lipid nanopartiküllerini 5 mililitre PBS ve biyolojik bir güvenlik kabini ile seyreltin. Tampon değişimi yapmak için, önce 100 kilodalton gözenek boyutunda ultracentrifuge filtresini 2 mililitre PBS, santrifüj ile önceden yıkayın ve ardından PBS'yi alt bölmeden boşaltın.Seyreltilmiş lipid nanopartiküllerini üç santrifüj yıkama için önceden yıkanmış ultracentrifuge filtresinin üst bölmesine ekleyin, akıştan atın ve ilk iki yıkamadan sonra ultracentrifuge filtresine 5 mililitre PBS ekleyin. Son yıkamadan sonra, nanopartikül çözeltisini nükleaz içermeyen bir şişeye aktarmadan önce nanopartikül kaybını en aza indirmek için lipid nanopartikül çözeltisini ultracentrifuge filtresinin duvarlarına birkaç kez karşılayın. Ardından, nanopartikül süspansiyonu uygun deneysel konsantrasyona ve hacme getirmek için PBS ekleyin.Lipid nanopartiküllerinin kapsülleme verimliliğini değerlendirmek için, önce pbs'de çalışan nükleik asit çözeltisinin iki kat seri seyreltmelerini hazırlaarak mililitre başına 500 nanogramdan başlayıp en az beş seyreltme yaparak standart bir eğri oluşturun. Daha sonra, standart eğrinin orta noktası etrafında yatan uygun bir teorik konsantrasyon elde etmek için PBS'deki nanopartikül örnek seyreltmelerini hazırlayın. Daha sonra uygun miktarda RNA reaktifi, Triton X100 ve PBS'yi karıştırarak lipid nanopartikül içinde ve dışında RNA varlığını tespit etmek için ribo yeşil RNA reaktifini hazırlayın.Daha sonra, sıvı nanopartikül dışında RNA varlığını tespit etmek için, yalnızca uygun miktarda RNA reaktifini ve PBS'yi karıştırın. Nükleik asit standardının ve lipid nanopartikül çözeltilerinin siyah floresan özellikli 96 kuyu plakasına çoğaltılması, daha sonra standart ve numune kopyalarına Triton X100 ile ve triton X100 olmadan eşit miktarda RNA niceleme reaktifi ekleyin. Numunelerin kapsamlı bir şekilde karıştırılmasını sağlamak için plaka okuyucusunda plaka okuyucusunda beş dakika boyunca hafiften korunan plakayı sallayın, ardından 480 nanometrelik bir heyecan dalga boyunda ve 520 nanometre emisyon dalga boyunda bir mikro plaka okuyucusunda floresan ölçün.Lipid nanopartiküllerinin hidrodinamik boyutunu ve poli dağılımını ölçmek için, önce nanopartikül çözeltisini PBS'de 40 kez seyreltin ve çözeltiyi yarı mikro bir cuvette ekleyin. Cuvette'i Zetasizer'a yükleyin ve nanopartikülleri malzeme, dağıtıcı, sıcaklık ve hücre tipine göre ölçecek cihazı ayarlamak için standart bir çalışma prosedürü seçin. Ardından lipid nanopartiküllerinin hidrodinamik boyutunu ve poli dağılımını ölçmek için Başlat"ı tıklayın.Lipid nanopartiküllerinin Zeta potansiyelini ölçmek için, nanopartikül çözeltisini çekirdeksiz suda 40 kez seyreltin ve çözeltiyi dolgu hattına bir cuvette yükleyin. Cuvette'i bir Zeta potansiyel analizörüne yükleyin, elektrotların cihazla temas etmesine dikkat edin ve cihazı lipid nanopartiküllerinin spesifik makyajına göre Zeta potansiyelini ölçecek şekilde ayarlayın. Ardından Zeta lipid nanopartikül potansiyelini ölçmek için Başlat"ı tıklayın.Bu analizde tekniğin tekrarlanabilirliğini göstermek için ayrı günlerde aynı lipit formülasyonu ve amin-fosfat oranına sahip birden fazla lipid nanopartikül grubu geliştirilmiştir. Gözlemlendiği gibi, bir ve iki parti, benzer bir poli dağılımına sahip üst üste binen boyut dağılımları sergiledi ve partiler arasındaki boyut veya kapsülleme verimliliğinde önemli bir fark gözlenmedi. Tipik olarak, formülasyon parametrelerindeki değişiklikler bazı küçük ama istatistiksel olarak anlamlı farklılıklara neden olabilir.Örneğin, amin fosfat oranına düşürülmesi, kapsülleme verimliliğinde% 4'lük bir azalmaya ve nanopartiküllerin hidrodinamik çapında eşlik eden bir artışa neden olur. Farklı iyotlu lipitlerle formüle edilmiş ancak fosfat oranına aynı amin ile formüle edilen lipid nanopartikülleri, kapsülleme verimliliğinde önemli bir değişiklik ve parçacık çapında küçük farklılıklar sergiler. Plazmid DNA'nın kapsüllenmesi, mRA kapsülleyen lipid nanopartiküllerine kıyasla daha büyük parçacıklarla sonuçlanır, ancak her iki nanopartikül türü de benzer bir kapsülleme verimliliği gösterir.Bununla birlikte, akış hızı proses parametreslerindeki değişiklikler lipid nanopartikül gelişimini etkilemez. Lipid nanopartikülleri harika uygulamalara sahiptir, mükemmel örnek yakın zamanda onaylanan COVID-19 aşılarıdır. Bu teknik harika bir takım seti görevi görür ve alt ektremite formülasyon taramasına izin vererek gelecekteki uygulamaların önünü lar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

İnsan Pankreas Kanseri Hücrelerinde Epidermal Büyüme Faktörü kullanarak Gen Teslimat ve Transfeksiyon Jelatin Tabanlı Engineered Nanovectors Reseptör-hedefli

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Mikro Schlieren Tekniği ile bir mikroakışkan Aygıt karıştırma homojen Analizi

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Katı Lipit nanopartiküller (SLNs) Hücre içi Hedefleme için başvurular

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...