Name: efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل معهد الجينوم البصري في ماساتشوستس للعيون والأذن.

واتبعت المبادئ التوجيهية لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في بحوث العيون والرؤية.
ملاحظة: وقد ثبت نجاح هذه الطريقة مع الفئران من خلفيات وراثية مختلفة، بما في ذلك C57BL/6J، B10. D2-HCس H2د H2-T18ج/ oSnJ، والفئران المهق، في مختلف الأعمار. يفضل استخدام الفئران 8 إلى 12 أسبوعا للح?...

<ol>
	<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Konari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-retinal+barrier+in+vitro:+Formation+of+tight+junctions+as+revealed+by+occludin+and+ZO-1+correlates+with+the+barrier+function+of+chick+retinal+pigment+epithelial+cells.">Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells.</a> Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).</li><li>Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+protein+secretion+by+the+retinal+pigment+epithelium:+Roles+in+retinal+health+and+the+development+of+age-related+macular+degeneration.">Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).</li><li>Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+inflammatory+processes+in+drusen+formation+and+age+related+macular+degeneration.">Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+hypothesis+that+considers+drusen+as+biomarkers+of+immune-mediated+processes+at+the+RPE-Bruch's+membrane+interface+in+aging+and+age-related+macular+degeneration.">An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).</li><li>Lommatzsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+low+inflammatory+reactions+involved+in+exudative+age-related+macular+degeneration.">Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).</li><li>Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+creates+pro-angiogenic+environment+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+exposed+to+complement.">Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+local+complement+response+by+RPE+causes+early-stage+macular+degeneration.">A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).</li><li>Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+cause+RPE+cells+to+make+basal+deposits+and+activate+the+alternative+complement+pathway.">Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway.</a> Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+triggers+formation+of+sub-retinal+pigment+epithelium+deposits+via+the+ubiquitin+proteasome+pathway.">C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Farkas, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Pre-mRNA+processing+factors+3,+8,+and+31+cause+dysfunction+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).</li><li>Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Barrier+Properties+and+Inducible+VEGF+Expression+of+Several+Types+of+Retinal+Pigment+Epithelium+in+Medium-Term+Culture.">Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture.</a> Current Eye Research. 31, 739 (2006).</li><li>Sch&#252;tze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+findings+in+patients+with+albinism+using+wide-field+polarization-sensitive+optical+coherence+tomography.">Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography.</a> Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Garland, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetics+and+proteomic+analyses+demonstrate+a+critical+role+for+complement+in+a+model+of+DHRD/ML,+an+inherited+macular+degeneration.">Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R345W+mutation+in+EFEMP1+is+pathogenic+and+causes+AMD-like+deposits+in+mice.">The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice.</a> Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).</li><li>Greenwald, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+NMNAT1-Leber+Congenital+Amaurosis+(LCA9)+Recapitulate+Key+Features+of+the+Human+Disease.">Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).</li><li>Gupta, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ift172+conditional+knock-out+mice+exhibit+rapid+retinal+degeneration+and+protein+trafficking+defects.">Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects.</a> Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+promotes+morphogenesis+of+apical+microvilli+and+basal+infoldings+in+retinal+pigment+epithelium.">Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium.</a> Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).</li><li>Nandrot, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+synchronized+retinal+phagocytosis+and+age-related+blindness+in+mice+lacking+&#945;v&#946;5+integrin.">Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking &#945;v&#946;5 integrin.</a> Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology.">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Brydon, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Augmentation+Therapy+Restores+Critical+Functions+in+Mutant+PRPF31+/&#8722;+iPSC-Derived+RPE+Cells.">AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/&#8722; iPSC-Derived RPE Cells.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).</li><li>Bonilha, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+disease-related+structural+changes+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium.</a> Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).</li></ol>

في حين تم تطوير عدة طرق لعزل خلية RPE الماوس والثقافة قبل1،13،20،22،26،27، طريقة فرنانديز غودينو تستخدم لأول مرة إدراج الغشاء مما يسمح للنمو الفعال للخلايا RPE في الثقافةلأسابي?...

يصف هذا البروتوكول، الذي تم الإبلاغ عنه في الأصل من قبل Fernandez-Godino وآخرون في عام 20161،طريقة لعزل وزراعة خلايا ظهارة صبغة الشبكية (RPE) بكفاءة، والتي تشكل طبقة أحادية RPE وظيفية ومستقطبة في غضون أسبوع واحد على لوحات Transwell. وRPE هو طبقة واحدة تقع في العين بين شبكية العين العصبية وغشاء بروش. تتكون هذه الطبقة الواحدة من خلايا ظهارية مستقطبة ومصطبغة للغاية انضمت إليها تقاطعات ضيقة ، مما يعرض شكلا سداسيا يشبه قرص العسل2. على الرغم من هذه البساطة النسيجية الواضحة ، فإن RPE تؤدي مجموعة واسعة من الوظائف الحرجة للشبكية والدورة البصرية العادية2و3و4. وتشمل الوظائف الرئيسية لطبقة واحدة RPE امتصاص الضوء, تغذية وتجديد مستقبلات ضوئية, إزالة المنتجات النهائية الأيضية, السيطرة على التوازن الأيونية في الفضاء تحت الشبكية والحفاظ على حاجز الدم الشبكية2,3. كما أن ل RPE دورا هاما في التشكيل المحلي للجهاز المناعي فيالعين5و6و7و8و9و10و11. الضمور و / أو خلل في RPE هي السمات المشتركة بين العديد من اضطرابات العين مثل التهاب الشبكية الصباغي، الليبر الحمى الخلقية، المهق، اعتلال الشبكية السكري، والضمور البقعي12،13،14،15. لسوء الحظ، توافر الأنسجة البشرية محدودة. ونظرا للحفاظ على درجة عالية من التماثل الوراثي مع البشر، نماذج الماوس تمثل أداة مناسبة ومفيدة لدراسة اضطرابات العين16،17،18،19. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الخلايا RPE الأولية المستزرعة يوفر مزايا مثل التلاعب الجيني واختبار المخدرات التي يمكن أن تسرع تطوير علاجات جديدةلهذهالاضطرابات التي تهدد الرؤية 9،11.
تفتقر الأساليب الموجودة المتوفرة لعزل RPE الماوس والثقافة بشكل مستنسخ ولا تلخص ميزات RPE في الجسم الحي مع موثوقية كافية. الخلايا تميل إلى فقدان التصبغ، شكل سداسي والمقاومة الكهربائية عبر الإبط (TER) في غضون أيام قليلة في الثقافة13،20. منذ إنشاء هذه الثقافات الخلية RPE الأولية من الفئران هو عملية صعبة، وقد تم إنشاء هذا البروتوكول الأمثل على أساس بروتوكولات أخرى لعزل خلايا RPE من الفئران وعيون الإنسان21،22،23 لتشريح عيون الماوس، وجمع RPE والثقافة خلايا RPE الماوس في المختبر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled micro forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 45&#176; Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 1mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1 MG</td>
			<td>Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Supplement 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-914B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 12-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell supports 6.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors 8cm long, stainless steel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>6780-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells

تؤثر اضطرابات العين على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم، ولكن محدودية توافر الأنسجة البشرية تعيق دراستهم. نماذج الماوس هي أدوات قوية لفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض العين بسبب أوجه التشابه بينها وبين التشريح البشري وعلم وظائف الأعضاء. التعديلات في ظهارة صبغ الشبكية (RPE)، بما في ذلك التغيرات في مورفولوجيا ووظيفة، هي السمات المشتركة بين العديد من اضطرابات العين. ومع ذلك، العزلة الناجحة والثقافة من خلايا RPE الماوس الأساسي صعبة للغاية. هذه الورقة هي نسخة سمعية بصرية محدثة من البروتوكول الذي سبق نشره من قبل فرنانديز غودينو وآخرون في عام 2016 لعزل خلايا RPE الأولية للفأر وثقافتها بكفاءة. هذه الطريقة قابلة للاستنساخ للغاية وتؤدي إلى ثقافات قوية من الطبقات الأحادية RPE المستقطبة والمصطبغة للغاية التي يمكن الحفاظ عليها لعدة أسابيع على Transwells. يفتح هذا النموذج آفاقا جديدة لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء أمراض العين. وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر منصة لاختبار النهج العلاجية التي يمكن استخدامها لعلاج أمراض العيون الهامة مع الاحتياجات الطبية غير الملباة، بما في ذلك اضطرابات الشبكية الموروثة والضمور البقعي.

وقد استخدم هذا البروتوكول لعزل وزراعة خلايا RPE من الفئران المعدلة وراثيا1. ولم تلاحظ أي اختلافات بين سلالات الفئران أو نوع الجنس. وقد ساعدت النتائج على فهم بعض الجوانب الهامة للآلية الكامنة وراء أمراض العين مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، وهو السبب الأكثر شيوعا لفقدان البص...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

يصف هذا البروتوكول ، الذي تم الإبلاغ عنه في الأصل من قبل Fernandez-Godino وآخرون في عام 20161، طريقة لعزل خلايا RPE الماوس والثقافة بكفاءة ، والتي تشكل طبقة أحادية RPE وظيفية ومستقطبة في غضون أسبوع واحد على لوحات Transwell. يستغرق الإجراء حوالي 3 ساعات.

تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

يسمح هذا البروتوكول لعزل فعالة وثقافة خلايا RPE الماوس. ثقافات RPE الماوس الأولية صحية هي نماذج قيمة لفهم آليات أمراض العين الكامنة. الثقافات RPE التقاء وقابلة للحياة الحصول على في غضون ثلاثة أيام، ويمكن زراعتها لأسابيع.وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لفهم الآليات الكامنة وراء الضمور البقعي المرتبط بالعمر المبكر، وهو السبب الرئيسي للعمى بين كبار السن في البلدان المتقدمة النمو. من المهم تصور خطوات التشريح. التفاصيل حاسمة لنجاح البروتوكول ، على سبيل المثال ، كيفية التعامل مع مقل العيون بحيث لا يتم لكم الصلبة ، حيث يجب إجراء تخفيضات بالضبط ، وكيفية تضمين أكواب العين في التريبسين بحيث تبقى مفتوحة.ابدأ بإعداد جميع الكواشف اللازمة للبروتوكول. ثم، ابدأ في تنظيف مقلة العين عن طريق إزالة جميع الأنسجة الضامة والدم والعضلات بعناية، وذلك باستخدام ملقط Dumont رقم خمسة ومقص الزاوية، دون إجراء أي تخفيضات في الصلبة. نقل مقلة العين إلى طبق جديد يحتوي على ثلاثة ملليلترات من العازلة HBSS خالية من HEPES بانتظام للحفاظ على العين جديدة ونظيفة وتجنب أي تلوث.استخدم العصب البصري كمقبض لعقد مقلة العين وجعل ثقب في وسط القرنية مع الصلب الكربوني الحاد رقم 11 شفرة. إجراء ثلاثة شقوق في القرنية من خلال ثقب مع مقص رقم خمسة دومون، وضمان أن هناك مساحة كافية لإزالة العدسة. عقد العصب البصري وتطبيق ضغط طفيف على سيراتا أورا مع قاعدة مقص الزاوية، حتى العدسة يخرج تماما.الحفاظ على ظهارة القزحية سليمة لمنع انفصال الشبكية العصبية وRPE أثناء الحضانة. ضع العين في العازلة HBSS خالية من HEPES. احتضان العينين دون عدسات في محلول الهيالورونيوم في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في حاضنة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون Aerated لفصل شبكية العين العصبية من RPE.ضع كل عين في بئر جديد مع 1.5 ملليلتر من العازلة HBSS HEPES الباردة لكل بئر واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد الغسيل، ضع كل عين في طبق ثقافة 35 ملليمتر مع مخزن HBSS HEPES المؤقت الطازج. قطع القرنية من خلال الشقوق الأصلية مع مقص فاناس ثمانية سنتيمتر حتى يتم التوصل إلى أورا سيراتا، ثم قطع تحت سيراتا أورا لإزالة ظهارة القزحية والقرنية.عقد سيراتا أورا مع ملاقط منحنية واستخدام ملقط صغير الزاوية، وسحب بعيدا شبكية العين العصبية، والتأكد من أن لا يتم قطع طبقة RPE. ثم، قطع التعلق الداخلي إلى العصب البصري. قطع العصب البصري ونقل كل كوب العين إلى لوحة بئر مختلفة 12 تحتوي على 1.5 ملليلتر من التريبسين-EDTA الطازجة لكل بئر.تأكد من أن أكواب العين لا تزال مفتوحة ومغمورة بالكامل في التريبسين. احتضان أكواب العين في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪. جمع كل كوب العين جنبا إلى جنب مع أي ورقة RPE فصل خلال حضانة التربسين ونقلها إلى لوحة بئر 12 تحتوي على 1.5 ملليلتر من محلول FBS لكل بئر.إذا كانت أوراق RPE تبقى في الحل تريبسين، استخدم micropipette لنقلها إلى البئر مع حل FBS. عقد كل كوب العين من العصب البصري ويهز وجهه إلى أسفل في لوحة بئر 12 تحتوي على 1.5 ملليلتر من 20٪ FBS في HBSS HEPES العازلة حتى يتم تحقيق مفرزة كاملة من أوراق RPE. جمع أي أوراق RPE ومجموعات RPE مع micropipette، وتجنب أي قطع بيضاء من الصلبة أو المشيمية، والتي يمكن أن تلوث الثقافات، ووضعها في أنبوب 15 ملليلتر.سحب عينين من نفس الماوس في أنبوب واحد. ثم، طرد مركزي خليط RPE في 340 × ز لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant. إعادة إنفاق بلطف بيليه RPE في خليط ملليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين-EDTA واحتضانه لمدة دقيقة واحدة في حمام مائي في 37 درجة مئوية لتصنيف أوراق RPE إلى خلايا واحدة.ثم ماصة بلطف صعودا وهبوطا 10 مرات، وتجنب تشكيل فقاعة. إضافة تسعة ملليلتر من المتوسط RPE أعدت حديثا لتخفيف وتعطيل التريبسين والطرد المركزي الخليط في 340 × ز لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. يستنشق supernatant وإعادة إنفاق بعناية بيليه الخلية في 150 ميكرولتر من المتوسط RPE مع 5٪ FBS.بعد ذلك ، قم بإزالة PBS من الغرفة السفلية لإدراج الغشاء المغلف بالطبقة المعد مسبقا وإضافة 700 ميكرولتر من RPE المتوسطة إليه. إزالة صفح من الغرفة العليا من إدراج الغشاء وتوزيع تعليق الخلية RPE قطرة الحكمة وموحدة إلى وسط الغرفة. ضع الغشاء دون إزعاج في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.ثم تحقق من إدراج الغشاء تحت المجهر للتأكد من أن معظم خلايا RPE متصلة بإدراج والالتقاء هو على الأقل 50٪ لا تغيير وسائل الإعلام خلال الساعات ال 72 الأولى. أظهرت خلايا RPE المعزولة باستخدام هذا البروتوكول حجم RPE النموذجي ، ومورفولوجيا ، وتصبغ. ولوحظ بعد أسبوع واحد وجود طبقة أحادية من نوع RPE شديدة الاستقطاب مع نواتين انضمت إليهما تقاطعات ضيقة، إلى جانب وجود شقوق صغيرة ومجلدات القاعدية.وقد تأكدت الاستقطابات في الطبقة الأحادية من RPE من خلال قيم TER، حيث كان المتوسط أعلى من 200 أوم سنتيمتر مربع، والتي ظلت مستقرة مع مرور الوقت. في مقايسات البلعوم التي أجريت على FITC المسمى نقاط البيع البقرية ، لوحظ ابتلاع وهضم نقاط البيع ، مما يشير إلى تشكيل طبقة أحادية التقاء وظيفية من خلايا RPE. تتطلب الثقافات القابلة للحياة وقتا قصيرا للتشريح ، وهو ما يتحقق بالخبرة.قد تبقى بعض خلايا RPE متصلة شبكية العين العصبية، ولكن إذا ظلت عدة أوراق RPE متصلة، فلن ينجح البروتوكول. يجب استخدام الهيالورونيديز الطازج في كل مرة لمنع هذه المشكلة. هذه الثقافات خلية RPE الماوس الأولي وظيفية هي أداة قيمة لدراسة علم الأحياء المرضية من RPE في العديد من أمراض العيون.على سبيل المثال، جعل هذا البروتوكول من الممكن دراسة علم الأحياء المرضية للRPE في نموذج الماوس من الضمور البقعي.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

الثقافة السابقين فيفو من خلايا الإنسان الأولية قناة فالوب طلائي

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

سوبريتينال زرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى نموذج كبير العينين من ضمور الجغرافية

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

العزلة والثقافة والهندسة الوراثية للخلايا الظهارية الصباغية الأولية للثدييات للعلاج الجيني غير الفيروسي

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

الثقافة الأولية للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الخنازير

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

توليد فعال ومتسق لظهارة صبغية شبكية العين / المشيمية من العين البشرية للتحليل النسيجي

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...