Name: efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Ocular Genomics Institute i Massachusetts Eye and Ear.

Retningslinjerne i ARVO's erklæring om brug af dyr i oftalmisk og visionsforskning blev fulgt.
BEMÆRK: Denne metode har vist sig at være vellykket med mus med forskellige genetiske baggrunde, herunder C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ, og albino mus, i forskellige aldre. Brug helst 8 til 12 uger gamle mus til at opnå RPE-celler. RPE-celler fra ældre mus formerer sig mindre i kultur, og yngre mus har færre og mindre celler, hvilket kræver, at man sam...

<ol>
	<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Konari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-retinal+barrier+in+vitro:+Formation+of+tight+junctions+as+revealed+by+occludin+and+ZO-1+correlates+with+the+barrier+function+of+chick+retinal+pigment+epithelial+cells.">Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells.</a> Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).</li><li>Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+protein+secretion+by+the+retinal+pigment+epithelium:+Roles+in+retinal+health+and+the+development+of+age-related+macular+degeneration.">Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).</li><li>Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+inflammatory+processes+in+drusen+formation+and+age+related+macular+degeneration.">Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+hypothesis+that+considers+drusen+as+biomarkers+of+immune-mediated+processes+at+the+RPE-Bruch's+membrane+interface+in+aging+and+age-related+macular+degeneration.">An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).</li><li>Lommatzsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+low+inflammatory+reactions+involved+in+exudative+age-related+macular+degeneration.">Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).</li><li>Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+creates+pro-angiogenic+environment+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+exposed+to+complement.">Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+local+complement+response+by+RPE+causes+early-stage+macular+degeneration.">A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).</li><li>Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+cause+RPE+cells+to+make+basal+deposits+and+activate+the+alternative+complement+pathway.">Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway.</a> Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+triggers+formation+of+sub-retinal+pigment+epithelium+deposits+via+the+ubiquitin+proteasome+pathway.">C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Farkas, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Pre-mRNA+processing+factors+3,+8,+and+31+cause+dysfunction+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).</li><li>Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Barrier+Properties+and+Inducible+VEGF+Expression+of+Several+Types+of+Retinal+Pigment+Epithelium+in+Medium-Term+Culture.">Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture.</a> Current Eye Research. 31, 739 (2006).</li><li>Sch&#252;tze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+findings+in+patients+with+albinism+using+wide-field+polarization-sensitive+optical+coherence+tomography.">Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography.</a> Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Garland, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetics+and+proteomic+analyses+demonstrate+a+critical+role+for+complement+in+a+model+of+DHRD/ML,+an+inherited+macular+degeneration.">Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R345W+mutation+in+EFEMP1+is+pathogenic+and+causes+AMD-like+deposits+in+mice.">The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice.</a> Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).</li><li>Greenwald, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+NMNAT1-Leber+Congenital+Amaurosis+(LCA9)+Recapitulate+Key+Features+of+the+Human+Disease.">Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).</li><li>Gupta, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ift172+conditional+knock-out+mice+exhibit+rapid+retinal+degeneration+and+protein+trafficking+defects.">Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects.</a> Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+promotes+morphogenesis+of+apical+microvilli+and+basal+infoldings+in+retinal+pigment+epithelium.">Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium.</a> Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).</li><li>Nandrot, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+synchronized+retinal+phagocytosis+and+age-related+blindness+in+mice+lacking+&#945;v&#946;5+integrin.">Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking &#945;v&#946;5 integrin.</a> Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology.">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Brydon, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Augmentation+Therapy+Restores+Critical+Functions+in+Mutant+PRPF31+/&#8722;+iPSC-Derived+RPE+Cells.">AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/&#8722; iPSC-Derived RPE Cells.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).</li><li>Bonilha, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+disease-related+structural+changes+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium.</a> Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).</li></ol>

Mens flere metoder til mus RPE celle isolation og kultur var blevet udviklet før1,13,20,22,26,27, Fernandez-Godino metode første gang brugt membran skær giver mulighed for effektiv vækst af RPE celler i kultur i uge1,9. En anden væsentlig ændring i deres protoko...

Denne protokol, som oprindeligt blev rapporteret af Fernandez-Godino et al. i 20161, beskriver en metode til effektivt at isolere og kultur mus nethinde pigment epitel (RPE) celler, som danner en funktionel og polariseret RPE monolayer inden for en uge på Transwell plader. RPE er en monolayer placeret i øjet mellem den neurale nethinden og Bruch's membran. Dette ene lag består af stærkt polariserede og pigmenterede epitelceller forbundet med stramme vejkryds, der udviser en sekskantet form, der ligner en honeycomb2. På trods af denne tilsyneladende histologiske enkelhed udfører RPE en lang række funktioner, der er kritiske for nethinden og den normale visuelle cyklus2,3,4. RPE monolayers hovedfunktioner omfatter lysabsorption, næring og fornyelse af fotoreceptorer, fjernelse af metaboliske slutprodukter, kontrol af ionhomøostase i det subretinale rum og vedligeholdelse af blod-nethindebarrieren2,3. RPE har også en vigtig rolle i lokal graduering af immunsystemet i øjet5,6 ,7,8,9,10,11. Degeneration og / eller dysfunktion af RPE er fælles træk deles af mange okulære lidelser såsom retinitis pigmentosa, Leber medfødt amaurosis, albinisme, diabetisk retinopati, og makuladegeneration12,13,14,15. Desværre er tilgængeligheden af humane væv begrænset. I betragtning af deres stærkt bevarede genetiske homologi med mennesker repræsenterer musemodeller et passende og nyttigt værktøj til at studere øjensygdomme16,17,18,19. Desuden giver brugen af dyrkede primære RPE-celler fordele som genmanipulation og lægemiddeltest, der kan fremskynde udviklingen af nye terapier til disse synstruende lidelser9,11.
Eksisterende metoder til rådighed for mus RPE isolation og kultur mangler reproducerbart og ikke opsummere RPE funktioner in vivo med tilstrækkelig pålidelighed. Celler har tendens til at miste pigmentering, sekskantet form og transepithelial elektrisk modstand (TER) inden for et par dage i kultur13,20. Siden etableringen af disse primære RPE-cellekulturer fra mus er en udfordrende proces, er denne optimerede protokol blevet oprettet baseret på andre protokoller til at isolere RPE-celler fra rotte og menneskelige øjne21,22,23 for at dissekere musens øjne, indsamle RPE og kultur musen RPE celler in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled micro forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 45&#176; Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 1mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1 MG</td>
			<td>Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Supplement 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-914B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 12-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell supports 6.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors 8cm long, stainless steel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>6780-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells

Øjenlidelser påvirker millioner af mennesker verden over, men den begrænsede tilgængelighed af humane væv hindrer deres undersøgelse. Musemodeller er kraftfulde værktøjer til at forstå patofysiologien af øjensygdomme på grund af deres ligheder med menneskets anatomi og fysiologi. Ændringer i nethindepigmentepitelet (RPE), herunder ændringer i morfologi og funktion, er fælles træk, der deles af mange okulære lidelser. Men en vellykket isolation og kultur af primære mus RPE celler er meget udfordrende. Dette papir er en opdateret audiovisuel version af protokollen, der tidligere blev offentliggjort af Fernandez-Godino et al. i 2016 for effektivt at isolere og kultur primære mus RPE-celler. Denne metode er meget reproducerbar og resulterer i robuste kulturer af stærkt polariserede og pigmenterede RPE monolayers, der kan opretholdes i flere uger på Transwells. Denne model åbner nye veje for studiet af de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for øjensygdomme. Desuden giver det en platform til at teste terapeutiske tilgange, der kan bruges til behandling af vigtige øjensygdomme med uopfyldte medicinske behov, herunder arvelige nethindeforstyrrelser og makuladegenerationer.

Denne protokol er blevet brugt til at isolere og dyrke RPE-celler fra genetisk modificerede mus1. Der er ikke observeret forskelle mellem musestammer eller køn. Resultaterne har bidraget til at forstå nogle vigtige aspekter af den mekanisme, der ligger til grund for øjensygdomme som aldersrelateret makuladegeneration, som er den mest almindelige årsag til synstab blandt de ældre9. RPE-celler isoleret efter denne protokol var helt fastgjort til membranindsatsen 24 timer...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Denne protokol, som oprindeligt blev rapporteret af Fernandez-Godino et al. i 20161, beskriver en metode til effektivt at isolere og kultur mus RPE celler, som danner en funktionel og polariseret RPE monolayer inden for en uge på Transwell plader. Proceduren tager cirka 3 timer.

Effektiv dissektion og kultur af primære mus Retinal Pigment Epitel celler

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Denne protokol giver mulighed for effektiv isolering og kultur af mus RPE celler. Sunde primære mus RPE kulturer er værdifulde modeller til at forstå mekanismerne i underliggende øjensygdomme. Sammenflydende og levedygtige RPE kulturer opnå inden for tre dage og kan dyrkes i ugevis.Denne protokol er med succes blevet brugt til at forstå de mekanismer, der ligger til grund for tidlig aldersrelateret makuladegeneration, som er den hyppigste årsag til blindhed blandt de ældre i de udviklede lande. Det er vigtigt at visualisere dissektionstrinnene. Detaljer er afgørende for succesen af protokollen, for eksempel, hvordan man håndterer øjne, så sclera ikke er slået, hvor præcis nedskæringer skal udføres, og hvordan man kan integrere øjet kopper i trypsin, så de forbliver åbne.Begynd med at forberede alle de nødvendige reagenser til protokollen. Derefter skal du begynde at rense øjeæblet ved omhyggeligt at fjerne alt bindevæv, blod og muskler ved hjælp af Dumont nummer fem pincet og vinklet saks uden at foretage nedskæringer i scleraen. Overfør øjeæblet til en frisk skål, der indeholder tre milliliter HEPES-fri HBSS buffer regelmæssigt for at holde øjet frisk og rent og undgå forurening.Brug synsnerven som et håndtag til at holde øjeæblet og lave et hul i midten af hornhinden med en skarp kulstofstål nummer 11 klinge. Lav tre snit i hornhinden gennem hullet med Dumont nummer fem saks, sikre, at der er tilstrækkelig plads til at fjerne linsen. Hold synsnerven og anvende let tryk på ora serrata med bunden af vinklet saks, indtil linsen kommer ud helt.Hold irisepitelet intakt for at forhindre løsrivelse af neural nethinden og RPE under inkubation. Placer øjet i HEPES-fri HBSS buffer. Inkuber øjnene uden linser i hyaluronidaseopløsning ved 37 grader Celsius i 45 minutter i en 5%kuldioxidluftet inkubator for at løsne den neurale nethinden fra RPE.Placer hvert øje i en ny brønd med 1,5 milliliter kold HBSS HEPES buffer per brønd og inkuber det på is i 30 minutter. Efter vask, placere hvert øje i en 35 millimeter kultur parabol med friske HBSS HEPES buffer. Skær hornhinden gennem de oprindelige snit med otte centimeter Vannas saks, indtil ora serrata er nået, derefter skæres under ora serrata at fjerne iris epitel og hornhinden.Hold ora serrata med buede pincet og ved hjælp af vinklede mikro pincet, trække væk neurale nethinden, og sørg for, at RPE lag ikke er skåret. Skær derefter den interne fastgørelse til synsnerven. Skær synsnerven og overfør hver øjenkop til en anden 12 brøndplade, der indeholder 1,5 milliliter frisk trypsin-EDTA pr. brønd.Sørg for, at øjenkopperne forbliver åbne og helt nedsænket i trypsin. Inkuber øjenkopperne ved 37 grader Celsius i 45 minutter i en 5%kuldioxidinkubator. Saml hver øjenkop sammen med eventuelle RPE ark løsrevet under trypsin inkubation og overføre dem til en 12 godt plade, der indeholder 1,5 milliliter FBS opløsning per brønd.Hvis RPE-ark forbliver i trypsinopløsningen, skal du bruge en mikropipette til at overføre dem til brønden med FBS-opløsning. Hold hver øjenkop ved synsnerven og ryst den med forsiden nedad i 12 brøndpladen, der indeholder 1,5 milliliter 20% FBS i HBSS HEPES buffer, indtil fuldstændig løsrivelse af RPE-arkene er opnået. Saml alle RPE-ark og RPE-klynger med en mikropipette, og undgå hvide stykker sclera eller choroid, som kan forurene kulturerne, og læg dem i et 15 milliliter rør.Træk to øjne fra samme mus i et rør. Derefter centrifuger RPE-blandingen ved 340 x g i to minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Genbrug forsigtigt RPE pellet i en en milliliter blanding af 0,25%trypsin-EDTA og inkubere det i et minut i et vandbad ved 37 grader Celsius for at opdele RPE ark i enkelte celler.Derefter pipetter forsigtigt op og ned 10 gange og undgår bobledannelse. Tilsæt ni milliliter frisklavet RPE-medium for at fortynde og inaktiver trypsinen og centrifuger blandingen ved 340 x g i to minutter ved stuetemperatur. Aspirere supernatant og omhyggeligt genbruge celle pellet i 150 mikroliter af RPE medium med 5% FBS.Fjern derefter PBS fra det nederste kammer i det tidligere forberedte lamininbelagte membranindsats, og tilsæt 700 mikroliter RPE-medium til det. Fjern laminin fra det øverste kammer i membranindsatsen og fordel RPE-celleophænget drop-wise og ensartet til midten af kammeret. Sæt membranindsatsen uforstyrret i en 5%kuldioxidinkubator ved 37 grader Celsius i mindst 24 timer.Kontroller derefter membranindsatsen under mikroskopet for at sikre, at de fleste RPE-celler er fastgjort til indsatsen, og at sammenløbet er mindst 50%Skift ikke mediet i løbet af de første 72 timer. RPE-celler isoleret ved hjælp af denne protokol viste den typiske RPE-størrelse, morfologi og pigmentering. En stærkt polariseret RPE monolayer med to kerner følgeskab af stramme vejkryds, sammen med tilstedeværelsen af apikale mikrovilli og basale infoldings, blev observeret efter en uge.Polarisering af RPE monolayer blev bekræftet af TER værdier, med den gennemsnitlige højere end 200 ohms centimeter kvadreret, som forblev stabil over tid. I phagocytoseanalyser udført på FITC mærket kvæg POS blev opslugning og fordøjelse af POS observeret, hvilket indikerer dannelse af et funktionelt sammenflydende monolayer af RPE-celler. Levedygtige kulturer kræver kort dissektionstid, hvilket opnås med erfaring.Nogle RPE-celler kan forblive knyttet til den neurale nethinde, men hvis flere RPE-ark forbliver vedhæftet, vil protokollen ikke lykkes. Frisk hyaluronidase skal bruges hver gang for at forhindre dette problem. Disse funktionelle primære mus RPE cellekulturer er et værdifuldt redskab til at studere patobiologi af RPE i mange øjensygdomme.For eksempel gjorde denne protokol det muligt at studere RPE's patobiologi i en musemodel af makuladegeneration.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA Expression Profiler af menneskelige iPS celler, retinale pigmentepitel arvet fra iPS og Føtal retinale pigmentepitel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal Transplantation af humane embryonale stamceller afledt retinal Pigment epitel celler ind i en stor-eyed Model af geografisk atrofi

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primære cellekulturer fra mus retinale Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Isolation, kultur og genteknologi af pattedyr primære pigment epitelceller til ikke-viral genterapi

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primær kultur af porcine retinale pigmentepitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolering af primære muse retinale pigmenterede epitelceller

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Effektiv og konsistent generering af retinal pigmentepitel / choroid flatmounts fra menneskelige øjne til histologisk analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...