Name: efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Ocular Genomics Institute in Massachusetts Eye and Ear.

De richtlijnen van de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek werden gevolgd.
OPMERKING: Deze methode is succesvol gebleken bij muizen met verschillende genetische achtergronden, waaronder C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ, en albino muizen, op verschillende leeftijden. Gebruik bij voorkeur muizen van 8 tot 12 weken oud om RPE-cellen te verkrijgen. RPE-cellen van oudere muizen verspreiden zich minder in cultuur en jon...

<ol>
	<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Konari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-retinal+barrier+in+vitro:+Formation+of+tight+junctions+as+revealed+by+occludin+and+ZO-1+correlates+with+the+barrier+function+of+chick+retinal+pigment+epithelial+cells.">Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells.</a> Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).</li><li>Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+protein+secretion+by+the+retinal+pigment+epithelium:+Roles+in+retinal+health+and+the+development+of+age-related+macular+degeneration.">Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).</li><li>Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+inflammatory+processes+in+drusen+formation+and+age+related+macular+degeneration.">Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+hypothesis+that+considers+drusen+as+biomarkers+of+immune-mediated+processes+at+the+RPE-Bruch's+membrane+interface+in+aging+and+age-related+macular+degeneration.">An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).</li><li>Lommatzsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+low+inflammatory+reactions+involved+in+exudative+age-related+macular+degeneration.">Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).</li><li>Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+creates+pro-angiogenic+environment+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+exposed+to+complement.">Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+local+complement+response+by+RPE+causes+early-stage+macular+degeneration.">A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).</li><li>Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+cause+RPE+cells+to+make+basal+deposits+and+activate+the+alternative+complement+pathway.">Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway.</a> Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+triggers+formation+of+sub-retinal+pigment+epithelium+deposits+via+the+ubiquitin+proteasome+pathway.">C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Farkas, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Pre-mRNA+processing+factors+3,+8,+and+31+cause+dysfunction+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).</li><li>Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Barrier+Properties+and+Inducible+VEGF+Expression+of+Several+Types+of+Retinal+Pigment+Epithelium+in+Medium-Term+Culture.">Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture.</a> Current Eye Research. 31, 739 (2006).</li><li>Sch&#252;tze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+findings+in+patients+with+albinism+using+wide-field+polarization-sensitive+optical+coherence+tomography.">Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography.</a> Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Garland, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetics+and+proteomic+analyses+demonstrate+a+critical+role+for+complement+in+a+model+of+DHRD/ML,+an+inherited+macular+degeneration.">Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R345W+mutation+in+EFEMP1+is+pathogenic+and+causes+AMD-like+deposits+in+mice.">The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice.</a> Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).</li><li>Greenwald, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+NMNAT1-Leber+Congenital+Amaurosis+(LCA9)+Recapitulate+Key+Features+of+the+Human+Disease.">Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).</li><li>Gupta, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ift172+conditional+knock-out+mice+exhibit+rapid+retinal+degeneration+and+protein+trafficking+defects.">Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects.</a> Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+promotes+morphogenesis+of+apical+microvilli+and+basal+infoldings+in+retinal+pigment+epithelium.">Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium.</a> Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).</li><li>Nandrot, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+synchronized+retinal+phagocytosis+and+age-related+blindness+in+mice+lacking+&#945;v&#946;5+integrin.">Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking &#945;v&#946;5 integrin.</a> Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology.">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Brydon, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Augmentation+Therapy+Restores+Critical+Functions+in+Mutant+PRPF31+/&#8722;+iPSC-Derived+RPE+Cells.">AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/&#8722; iPSC-Derived RPE Cells.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).</li><li>Bonilha, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+disease-related+structural+changes+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium.</a> Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).</li></ol>

Terwijl verscheidene methodes voor muis RPE celisolatie en cultuur vóór1, 13,20,22,26, 27waren ontwikkeld, gebruikte de methode van Fernandez-Godino eerst membraaninzetstukken die de efficiënte groei van de cellen RPE in cultuur voor week1,9toestaan . Een andere be...

Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om muis retinale pigmentepitheelcellen (RPE) efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De RPE is een monolaag in het oog tussen het neurale netvlies en het membraan van de Bruch. Deze enkele laag bestaat uit sterk gepolariseerde en gepigmenteerde epitheelcellen die worden verbonden door nauwe verbindingen, met een zeshoekige vorm die lijkt op een honingraat2. Ondanks deze schijnbare histologische eenvoud voert de RPE een breed scala aan functies uit die van cruciaal belang zijn voor het netvlies en de normale visuele cyclus2,3,4. De belangrijkste functies van de RPE monolaag omvatten lichtabsorptie, voeding en vernieuwing van fotoreceptoren, verwijdering van metabole eindproducten, controle van de ionenhomeostase in de subretinale ruimte en onderhoud van de bloed-retinale barrière2,3. De RPE speelt ook een belangrijke rol in de lokale modulatie van het immuunsysteem in het oog5,6,7,8,9,10,11. Degeneratie en/of disfunctie van de RPE zijn veel voorkomende kenmerken die worden gedeeld door veel oogaandoeningen zoals retinitis pigmentosa, Leber congenitale amaurosis, albinisme, diabetische retinopathie en maculadegeneratie12,13,14,15. Helaas is de beschikbaarheid van menselijke weefsels beperkt. Gezien hun zeer geconserveerde genetische homologie met mensen, vertegenwoordigen muismodellen een geschikt en nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van oogaandoeningen16,17,18,19. Bovendien biedt het gebruik van gekweekte primaire RPE-cellen voordelen zoals genetische manipulatie en medicijntests die de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor deze visiebedreigendeaandoeningenkunnen versnellen 9,11.
Bestaande methoden die beschikbaar zijn voor rpe-isolatie en -cultuur van muizen missen reproduceerbaar en vatten de RPE-functies in vivo niet met voldoende betrouwbaarheid samen. Cellen hebben de neiging om pigmentatie, zeshoekige vorm en transepitheliale elektrische weerstand (TER) binnen een paar dagen in cultuur13,20te verliezen . Aangezien het vaststellen van deze primaire RPE-celculturen van muizen een uitdagend proces is, is dit geoptimaliseerde protocol gemaakt op basis van andere protocollen om RPE-cellen te isoleren van ratten en menselijke ogen21,22, 23 om de muisogen te ontleden, de RPE te verzamelen en de RPE-cellen van de muis in vitro te culteren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled micro forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 45&#176; Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 1mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1 MG</td>
			<td>Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Supplement 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-914B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 12-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell supports 6.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors 8cm long, stainless steel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>6780-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells

Oogaandoeningen treffen miljoenen mensen wereldwijd, maar de beperkte beschikbaarheid van menselijke weefsels belemmert hun studie. Muismodellen zijn krachtige hulpmiddelen om de pathofysiologie van oogziekten te begrijpen vanwege hun overeenkomsten met de menselijke anatomie en fysiologie. Veranderingen in het retinale pigmentepitheel (RPE), waaronder veranderingen in morfologie en functie, zijn veel voorkomende kenmerken die door veel oogaandoeningen worden gedeeld. Succesvolle isolatie en cultuur van rpe-cellen van primaire muizen is echter zeer uitdagend. Dit artikel is een bijgewerkte audiovisuele versie van het protocol dat eerder in 2016 door Fernandez-Godino et al. werd gepubliceerd om primaire RPE-cellen van de muis efficiënt te isoleren en te cultiseren. Deze methode is zeer reproduceerbaar en resulteert in robuuste culturen van sterk gepolariseerde en gepigmenteerde RPE monolagen die enkele weken op Transwells kunnen worden gehandhaafd. Dit model opent nieuwe wegen voor de studie van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan oogziekten. Bovendien biedt het een platform om therapeutische benaderingen te testen die kunnen worden gebruikt om belangrijke oogziekten te behandelen met onvervulde medische behoeften, waaronder erfelijke netvliesaandoeningen en maculadegeneraties.

Dit protocol is gebruikt om RPE-cellen te isoleren en te gekweekt van genetisch gemodificeerde muizen1. Er zijn geen verschillen waargenomen tussen muizenstammen of geslacht. De resultaten hebben bijgedragen aan het begrijpen van enkele belangrijke aspecten van het mechanisme dat ten grondslag ligt aan oogziekten, zoals leeftijdsgebonden maculadegeneratie, de meest voorkomende oorzaak van gezichtsverlies bij ouderen9. RPE-cellen die volgens dit protocol werden geïsoleerd, ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om RPE-cellen van muizen efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De procedure duurt ongeveer 3 uur.

Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Dit protocol maakt de efficiënte isolatie en cultuur van rpe-cellen van muizen mogelijk. Gezonde primaire muis RPE-culturen zijn waardevolle modellen om de mechanismen van onderliggende oogziekten te begrijpen. Samenvloeibare en levensvatbare RPE-culturen verkrijgen binnen drie dagen en kunnen weken worden gekweekt.Dit protocol is met succes gebruikt om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan maculadegeneratie op jonge leeftijd, wat de belangrijkste oorzaak is van blindheid bij ouderen in ontwikkelde landen. Het is belangrijk om de ontledingsstappen te visualiseren. Details zijn van cruciaal belang voor het succes van het protocol, bijvoorbeeld hoe om te gaan met de oogbollen, zodat de sclera niet wordt geponst, waar precies sneden moeten worden uitgevoerd en hoe de oogbekers in trypsine kunnen worden ingesloten zodat ze open blijven.Begin met het voorbereiden van alle benodigde reagentia voor het protocol. Begin vervolgens met het reinigen van de oogbol door zorgvuldig alle bindweefsel, bloed en spieren te verwijderen, met behulp van Dumont nummer vijf tang en schuine schaar, zonder snijwonden in de sclera te maken. Breng de oogbol regelmatig over in een verse schaal met drie milliliter HEPES-vrije HBSS-buffer om het oog fris en schoon te houden en besmetting te voorkomen.Gebruik de oogzenuw als handvat om de oogbol vast te houden en maak een gat in het midden van het hoornvlies met een scherp koolstofstaal nummer 11 mes. Maak drie incisies in het hoornvlies door het gat met Dumont nummer vijf schaar, zodat er voldoende ruimte is om de lens te verwijderen. Houd de oogzenuw vast en oefen lichte druk uit op de ora serrata met de basis van de schuine schaar, totdat de lens er volledig uitkomt.Houd het irisepitheel intact om te voorkomen dat het neurale netvlies en RPE tijdens de incubatie losraken. Plaats het oog in hepes-vrije HBSS buffer. Incubeer de ogen zonder lenzen in hyaluronidase-oplossing bij 37 graden Celsius gedurende 45 minuten in een incubator met 5% koolstofdioxide om het neurale netvlies van de RPE los te maken.Plaats elk oog in een nieuwe put met 1,5 milliliter koude HBSS HEPES buffer per put en incubeer het gedurende 30 minuten op ijs. Plaats na het wassen elk oog in een 35 millimeter kweekschaal met verse HBSS HEPES-buffer. Snijd het hoornvlies door de oorspronkelijke incisies met een Vannas-schaar van acht centimeter totdat de ora serrata is bereikt en snijd vervolgens onder de ora serrata om het irisepitheel en het hoornvlies te verwijderen.Houd de ora serrata vast met gebogen pincet en gebruik een schuine micro-tang, trek het neurale netvlies weg en zorg ervoor dat de RPE-laag niet wordt doorgesneden. Snijd vervolgens de interne gehechtheid aan de oogzenuw door. Snijd de oogzenuw door en breng elke oogkop over naar een andere 12 putplaat met 1,5 milliliter verse trypsine-EDTA per put.Zorg ervoor dat de oogbekers geopend en volledig ondergedompeld blijven in de trypsine. Incubeer de oogbekers gedurende 45 minuten op 37 graden Celsius in een incubator van 5%kooldioxide. Verzamel elke oogbeker samen met alle RPE-vellen die tijdens de trypsine-incubatie zijn losgemaakt en breng ze over in een 12-putplaat met 1,5 milliliter FBS-oplossing per put.Als RPE-vellen in de trypsineoplossing blijven zitten, gebruik dan een micropipet om ze met FBS-oplossing naar de put over te brengen. Houd elke oogkop bij de oogzenuw en schud deze met de voorkant naar beneden in de 12 putplaat met 1,5 milliliter 20% FBS in HBSS HEPES-buffer totdat volledige ontkoppeling van de RPE-vellen is bereikt. Verzamel rpe-vellen en RPE-clusters met een micropipet, vermijd witte stukjes sclera of choroïde, die de culturen kunnen besmetten, en plaats ze in een buis van 15 milliliter.Trek twee ogen van dezelfde muis in één buis. Centrifugeer vervolgens het RPE-mengsel gedurende twee minuten op 340 x g bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de RPE-pellet voorzichtig in een mengsel van 0,25% trypsine-EDTA en incubeer het gedurende één minuut in een waterbad bij 37 graden Celsius om de RPE-vellen op te splitsen in afzonderlijke cellen.Pipetteer vervolgens voorzichtig 10 keer op en neer, vermijd bubbelvorming. Voeg negen milliliter vers bereid RPE-medium toe om de trypsine te verdunnen en te inactiveren en centrifugeer het mengsel gedurende twee minuten op kamertemperatuur op 340 x g. Aspireer het supernatant en resuspend de celkorrel zorgvuldig in 150 microliters RPE-medium met 5%FBS.Verwijder vervolgens PBS uit de onderste kamer van het eerder voorbereide laminine gecoate membraaninzetstuk en voeg er 700 microliter RPE-medium aan toe. Verwijder de lag uit de bovenste kamer van het membraaninzetstuk en verdeel de RPE-celsuspensie druppelgewijs en gelijkmatig naar het midden van de kamer. Plaats de membraaninzet gedurende ten minste 24 uur ongestoord in een incubator van 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius.Controleer vervolgens de membraaninzet onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de meeste RPE-cellen aan de insert zijn bevestigd en dat de samenvloeiing ten minste 50% is Verander de media de eerste 72 uur niet. RPE-cellen die met dit protocol werden geïsoleerd, vertoonden de typische RPE-grootte, morfologie en pigmentatie. Een sterk gepolariseerde RPE-monolaag met twee kernen verbonden door nauwe verbindingen, samen met de aanwezigheid van apicale microvilli en basale inplooien, werd na een week waargenomen.Polarisatie van de RPE monolayer werd bevestigd door TER-waarden, met het gemiddelde hoger dan 200 ohm centimeter in het kwadraat, dat in de loop van de tijd stabiel bleef. Bij fagocytosetesten uitgevoerd op FITC-gelabelde boviene POS werd overspoeling en vertering van POS waargenomen, wat wijst op de vorming van een functionele samenvloeiingsmonolaag van RPE-cellen. Levensvatbare culturen vereisen korte ontledingstijd, wat wordt bereikt met ervaring.Sommige RPE-cellen kunnen aan het neurale netvlies blijven zitten, maar als er meerdere RPE-vellen aan vast blijven zitten, zal het protocol niet slagen. Verse hyaluronidase moet elke keer worden gebruikt om dit probleem te voorkomen. Deze functionele primaire muis RPE celculturen zijn een waardevol hulpmiddel om de pathobiologie van de RPE bij veel oogziekten te bestuderen.Dit protocol maakte het bijvoorbeeld mogelijk om de pathobiologie van de RPE te bestuderen in een muismodel van maculadegeneratie.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolatie en Cultuur van de Muis Primaire Pancreatic Acinaire Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA expressie profielen van de Mens iPS cellen, retinale pigment epitheel Derived From iPS en Foetale retinale pigment epitheel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primaire celculturen van de muis retinale Pigment epitheel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Isolatie, kweek en genetische manipulatie van primaire pigmentepitheelcellen van zoogdieren voor niet-virale gentherapie

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primaire cultuur van porcine retinale pigmentepitheelcellen

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Efficiënte en consistente generatie van retinale pigmentepitheel / choroïde flatmounts uit menselijke ogen voor histologische analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...