Name: efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מכון גנומיקה עינית במסצ'וסטס עין ואוזן.

ההנחיות של הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון בוצעו.
הערה: שיטה זו הוכחה כמוצלחת עם עכברים מרקעים גנטיים שונים, כולל C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/ oSnJ, ועכברים לבקנים, בגילאים שונים. עדיף להשתמש בעכברים בני 8 עד 12 שבועות כדי להשיג תאי RPE. תאי RPE מעכברים מבוגרים...

<ol>
	<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Konari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-retinal+barrier+in+vitro:+Formation+of+tight+junctions+as+revealed+by+occludin+and+ZO-1+correlates+with+the+barrier+function+of+chick+retinal+pigment+epithelial+cells.">Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells.</a> Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).</li><li>Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+protein+secretion+by+the+retinal+pigment+epithelium:+Roles+in+retinal+health+and+the+development+of+age-related+macular+degeneration.">Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).</li><li>Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+inflammatory+processes+in+drusen+formation+and+age+related+macular+degeneration.">Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+hypothesis+that+considers+drusen+as+biomarkers+of+immune-mediated+processes+at+the+RPE-Bruch's+membrane+interface+in+aging+and+age-related+macular+degeneration.">An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).</li><li>Lommatzsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+low+inflammatory+reactions+involved+in+exudative+age-related+macular+degeneration.">Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).</li><li>Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+creates+pro-angiogenic+environment+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+exposed+to+complement.">Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+local+complement+response+by+RPE+causes+early-stage+macular+degeneration.">A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).</li><li>Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+cause+RPE+cells+to+make+basal+deposits+and+activate+the+alternative+complement+pathway.">Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway.</a> Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+triggers+formation+of+sub-retinal+pigment+epithelium+deposits+via+the+ubiquitin+proteasome+pathway.">C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Farkas, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Pre-mRNA+processing+factors+3,+8,+and+31+cause+dysfunction+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).</li><li>Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Barrier+Properties+and+Inducible+VEGF+Expression+of+Several+Types+of+Retinal+Pigment+Epithelium+in+Medium-Term+Culture.">Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture.</a> Current Eye Research. 31, 739 (2006).</li><li>Sch&#252;tze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+findings+in+patients+with+albinism+using+wide-field+polarization-sensitive+optical+coherence+tomography.">Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography.</a> Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Garland, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetics+and+proteomic+analyses+demonstrate+a+critical+role+for+complement+in+a+model+of+DHRD/ML,+an+inherited+macular+degeneration.">Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R345W+mutation+in+EFEMP1+is+pathogenic+and+causes+AMD-like+deposits+in+mice.">The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice.</a> Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).</li><li>Greenwald, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+NMNAT1-Leber+Congenital+Amaurosis+(LCA9)+Recapitulate+Key+Features+of+the+Human+Disease.">Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).</li><li>Gupta, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ift172+conditional+knock-out+mice+exhibit+rapid+retinal+degeneration+and+protein+trafficking+defects.">Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects.</a> Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+promotes+morphogenesis+of+apical+microvilli+and+basal+infoldings+in+retinal+pigment+epithelium.">Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium.</a> Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).</li><li>Nandrot, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+synchronized+retinal+phagocytosis+and+age-related+blindness+in+mice+lacking+&#945;v&#946;5+integrin.">Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking &#945;v&#946;5 integrin.</a> Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology.">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Brydon, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Augmentation+Therapy+Restores+Critical+Functions+in+Mutant+PRPF31+/&#8722;+iPSC-Derived+RPE+Cells.">AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/&#8722; iPSC-Derived RPE Cells.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).</li><li>Bonilha, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+disease-related+structural+changes+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium.</a> Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).</li></ol>

בעוד מספר שיטות עבור העכבר RPE בידוד ותרבות התאים פותחו לפני1,13,20,22,26,27, השיטה של פרננדז-גודינו השתמשה לראשונה מוסיף ממברנה המאפשר צמיחה יעילה של תאי RPE בתרבות במשך שבועות1</su...

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות עכבר רשתית פיגמנט תאים (RPE), אשר יוצרים מונולאייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על צלחות Transwell. RPE הוא מונולייר הממוקם בעין בין הרשתית העצבית לקרום של ברוך. שכבה אחת זו מורכבת מתאי אפיתל מקוטבים ופיגמנטיים מאוד אליהם מצטרפים צמתים הדוקים, המציגים צורה משושה הדומה חלת דבש2. למרות הפשטות ההיסטולוגית לכאורה, RPE מבצע מגוון רחב של פונקציות קריטיות הרשתית ואת מחזור הראייה הרגיל2,3,4. הפונקציות העיקריות של המונולאייר RPE כוללות ספיגת אור, הזנה וחידוש של פוטורצפטורים, הסרת מוצרי קצה מטבוליים, שליטה על הומאוסטזיס יון בחלל subretinal ותחזוקה של מחסום רשתית הדם2,3. RPE יש גם תפקיד חשוב אפנון מקומי של המערכת החיסונית בעין5,6,7,8,9,10,11. ניוון ו/או תפקוד לקוי של RPE הם תכונות נפוצות המשותפות להפרעות עיניים רבות כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, לאבר אמורוזיס מולד, לבקנות, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי12,13,14,15. למרבה הצער, הזמינות של רקמות אנושיות מוגבלת. בהתחשב בהומולוגיה הגנטית השמורה ביותר שלהם עם בני אדם, מודלים של עכברים מייצגים כלי מתאים ושימושי לחקר הפרעות עיניים16,17,18,19. יתר על כן, השימוש בתאי RPE ראשוניים תרבותיים מספק יתרונות כגון מניפולציה גנטית ובדיקות סמים שיכולים להאיץ את הפיתוח של טיפולים חדשים עבור הפרעות אלה מאיים ראייה9,11.
שיטות קיימות הזמינות עבור בידוד RPE העכבר ותרבות חסרים לשכפל ולא לשחזר את תכונות RPE ב vivo עם אמינות מספיק. תאים נוטים לאבד פיגמנטציה, צורה משושה והתנגדות חשמלית transepithelial (TER) בתוך כמה ימים בתרבות13,20. מאז הקמת אלה תרביות תא RPE העיקרי מעכברים הוא תהליך מאתגר, פרוטוקול זה אופטימיזציה נוצרה בהתבסס על פרוטוקולים אחרים כדי לבודד תאי RPE מחולשה ועיניים אנושיות21,22,23 כדי לנתח את עיני העכבר, לאסוף את RPE ותרבות תאי RPE העכבר במבחנה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled micro forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 45&#176; Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 1mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1 MG</td>
			<td>Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Supplement 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-914B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 12-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell supports 6.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors 8cm long, stainless steel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>6780-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells

הפרעות עיניים משפיעות על מיליוני אנשים ברחבי העולם, אבל הזמינות המוגבלת של רקמות אנושיות מעכבת את המחקר שלהם. מודלים עכבר הם כלים רבי עוצמה כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות עיניים בגלל הדמיון שלהם עם אנטומיה אנושית ופיזיולוגיה. שינויים באפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), כולל שינויים במורפולוגיה ובתפקוד, הם תכונות נפוצות המשותפות להפרעות עיניים רבות. עם זאת, בידוד ותרבות מוצלחים של תאי RPE של העכבר הראשי הוא מאתגר מאוד. מאמר זה הוא גרסה אורקולית מעודכנת של הפרוטוקול שפורסם בעבר על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 2016 כדי לבודד ביעילות ותרבות תאי RPE העכבר הראשי. שיטה זו היא מאוד לשחזור ותוצאות תרבויות חזקות של מונוליירים RPE מקוטב מאוד פיגמנטים שניתן לשמור במשך מספר שבועות על Transwells. מודל זה פותח אפיקים חדשים לחקר המנגנונים המולקולריים והתאית שבבסיס מחלות עיניים. יתר על כן, הוא מספק פלטפורמה לבדיקת גישות טיפוליות שניתן להשתמש בהן לטיפול במחלות עיניים חשובות עם צרכים רפואיים בלתי פוסקים, כולל הפרעות רשתית תורשתיות וניוונות מקולריים.

פרוטוקול זה שימש לבידוד ותרבות תאי RPE מעכברים מהונדסיםגנטית 1. לא נצפו הבדלים בין זני עכבר או מין. התוצאות עזרו להבין כמה היבטים חשובים של המנגנון שבבסיס מחלות עיניים כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל, שהוא הגורם השכיח ביותר לאובדן ראייה בקרב קשישים9. תאי RPE מבודדים בעק?...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות העכבר RPE תאים, אשר יוצרים מונולייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על לוחות Transwell. ההליך לוקח בערך 3 שעות.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

פרוטוקול זה מאפשר בידוד ותרבות יעילים של תאי RPE של העכבר. תרבויות RPE עכבר ראשוני בריא הם מודלים בעלי ערך כדי להבין את המנגנונים של מחלות עיניים הבסיסית. תרבויות RPE קונפלונטיות ובת קיימא להשיג בתוך שלושה ימים ניתן לגדל במשך שבועות.פרוטוקול זה שימש בהצלחה להבנת המנגנונים שבבסיס ניוון מקולרי הקשור לגיל צעיר, שהוא הגורם המוביל לעיוורון בקרב קשישים במדינות מפותחות. חשוב לדמיין את שלבי הניתוח. הפרטים הם קריטיים להצלחת הפרוטוקול, למשל, כיצד להתמודד עם גלגלי העיניים כך הסקלרה לא אגרוף, איפה בדיוק חתכים צריך להתבצע, וכיצד להטמיע את כוסות העין ב trypsin, כך שהם יישארו פתוחים.התחל בהכנת כל הריאגנטים הדרושים לפרוטוקול. לאחר מכן, התחל לנקות את גלגל העין על-ידי הסרה קפדנית של כל רקמת החיבור, הדם והשרירים, באמצעות מלקחיים ומספריים זוויתיים של Dumont, מבלי לבצע חתכים בסקלרה. מעבירים את גלגל העין למנה טרייה המכילה שלושה מיליליטר של חיץ HBSS נטול HEPES באופן קבוע כדי לשמור על העין רעננה ונקייה ולהימנע מזיהום כלשהו.השתמש בעצב הראייה כמו ידית להחזיק את גלגל העין ולעשות חור במרכז הקרנית עם להב חד פחמן פלדה מספר 11. לעשות שלושה חתכים בקרנית דרך החור עם Dumont מספר חמש מספריים, להבטיח כי יש מספיק מקום כדי להסיר את העדשה. החזיקו את עצב הראייה והפעילו לחץ קל על האורה סראטה עם בסיס המספריים הזוויתיים, עד שהעדשה יוצאת לחלוטין.שמור על אפיתל הקשתית שלם כדי למנוע את ניתוק הרשתית העצבית ו- RPE במהלך הדגירה. הנח את העין במאגר HBSS נטול HEPES. דגירה את העיניים ללא עדשות בתמיסת hyaluronidase ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות ב 5% פחמן דו חמצני aerated חממה לנתק את הרשתית העצבית מן RPE.מניחים כל עין בבאר חדשה עם 1.5 מיליליטר של חיץ HBSS HEPES קר לכל באר ולהדגיר אותו על קרח במשך 30 דקות. לאחר הכביסה, מניחים כל עין לתוך צלחת תרבות 35 מילימטר עם חיץ HBSS HEPES טרי. חותכים את הקרנית דרך החתכים המקוריים עם מספריים ונאס שמונה סנטימטרים עד אורה serrata הוא הגיע, ולאחר מכן לחתוך מתחת אורה סראטה כדי להסיר את אפיתל הקשתית וקרנית.החזק את אורה serrata עם פינצטה מעוגלת באמצעות מלקחיים מיקרו זוויתי, למשוך את הרשתית העצבית, לוודא כי שכבת RPE לא נחתך. לאחר מכן, לחתוך את ההחזקה הפנימית לעצב הראייה. חותכים את עצב הראייה ומעבירים כל עין לצלחת שונה של 12 באר המכילה 1.5 מיליליטר של טריפסין-EDTA טרי לבאר.ודא כי כוסות העין להישאר פתוח שקוע לחלוטין טריפסין. דגירה כוסות העין ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות באינקובטור 5% פחמן דו חמצני. לאסוף כל עין יחד עם כל יריעות RPE מנותק במהלך הדגירה טריפסין ולהעביר אותם לתוך צלחת 12 גם המכיל 1.5 מיליליטר של פתרון FBS לכל באר.אם גליונות RPE נשארים בתמיסת הנסיון, השתמש במיקרופיפט כדי להעביר אותם לבאר עם פתרון FBS. החזק כל עין על ידי עצב הראייה ולנער אותו עם הפנים כלפי מטה לתוך צלחת 12 גם המכיל 1.5 מיליליטר של 20%FBS במאגר HBSS HEPES עד ניתוק מלא של גיליונות RPE מושגת. לאסוף את כל יריעות RPE ואשכולות RPE עם micropipette, הימנעות כל חתיכות לבנות של סקלרה או choroid, אשר יכול לזהם את התרבויות, ומניחים אותם בצינור 15 מיליליטר.משוך שתי עיניים מאותו עכבר בצינור אחד. לאחר מכן, צנטריפוגה תערובת RPE ב 340 x g במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. בעדינות resuspend גלולת RPE בתערובת מיליליטר אחד של 0.25%trypsin-EDTA ו הדגירה אותו במשך דקה אחת באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לפזר את יריעות RPE לתאים בודדים.ואז בעדינות פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים, הימנעות היווצרות בועה. מוסיפים תשעה מיליליטר של מדיום RPE שהוכן טרי כדי לדלל ולהשבית את טריפסין וצנטריפוגה התערובת ב 340 x g במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לשאוף את supernatant בזהירות resuspend גלולת התא ב 150 מיקרוליטרים של מדיום RPE עם 5%FBS.לאחר מכן, להסיר PBS מהתא התחתון של תוספת קרום מצופה למין שהוכן בעבר ולהוסיף 700 מיקרוליטרים של RPE בינוני אליו. הסר את הלאמינין מהתא העליון של תוסף הממברנה ולהפיץ את ההשעיה תא RPE טיפה חכם אחיד למרכז התא. מניחים את הממברנה להחדיר באין מפריע באינקובטור 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות.לאחר מכן בדוק את תוסף הממברנה מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שרוב תאי ה- RPE מחוברים לתוסף ושהכנס הוא לפחות 50%אל תשנה את המדיה במהלך 72 השעות הראשונות. תאי RPE מבודדים באמצעות פרוטוקול זה הראו את הגודל הטיפוסי של RPE, מורפולוגיה ופיגמנטציה. מונולייר RPE מקוטב מאוד עם שני גרעינים הצטרפו צמתים הדוקים, יחד עם נוכחות של microvilli apical ו infoldings הבסיס, נצפתה לאחר שבוע.קיטוב של מונולייר RPE אושר על ידי ערכי TER, עם ממוצע גבוה מ 200 אוהם סנטימטר בריבוע, אשר נשאר יציב לאורך זמן. ב מבחני phagocytosis שבוצעו על FITC שכותרתו בקר קופה, בליעה ועיכול של קופה נצפתה, המציין היווצרות של monolayer confluent פונקציונלי של תאי RPE. תרבויות בנות קיימא דורשות זמן ניתוח קצר, אשר מושגת עם ניסיון.תאי RPE מסוימים עשויים להישאר מחוברים לרשתית העצבית, אך אם מספר גיליונות RPE יישארו מחוברים, הפרוטוקול לא יצליח. hyaluronidase טרי יש להשתמש בכל פעם כדי למנוע בעיה זו. אלה תרביות תא RPE עכבר ראשי פונקציונלי הם כלי רב ערך כדי ללמוד את הפתוביולוגיה של RPE במחלות עיניים רבות.לדוגמה, פרוטוקול זה אפשר ללמוד את הפתוביולוגיה של RPE במודל עכבר של ניוון מקולרי.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

בידוד, תרבות והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנט ראשוני של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

ייצור יעיל ועקבי של אפיתל פיגמנט רשתית/כורואיד שטוח מעיני אדם לניתוח היסטולוגי

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...