Name: efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dall'Ocular Genomics Institute del Massachusetts Eye and Ear.

Sono state seguite le linee guida della dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e della visione.
NOTA: Questo metodo si è dimostrato efficace con topi di diversa origine genetica, tra cui C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ, e topi albini, a varie età. Preferibilmente utilizzare topi da 8 a 12 settimane per ottenere cellule RPE. Le cellule RPE dei topi più anziani proliferano meno in coltura e i topi più giovani hanno sempre pi...

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	<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Konari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-retinal+barrier+in+vitro:+Formation+of+tight+junctions+as+revealed+by+occludin+and+ZO-1+correlates+with+the+barrier+function+of+chick+retinal+pigment+epithelial+cells.">Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells.</a> Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).</li><li>Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+protein+secretion+by+the+retinal+pigment+epithelium:+Roles+in+retinal+health+and+the+development+of+age-related+macular+degeneration.">Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).</li><li>Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+inflammatory+processes+in+drusen+formation+and+age+related+macular+degeneration.">Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+hypothesis+that+considers+drusen+as+biomarkers+of+immune-mediated+processes+at+the+RPE-Bruch's+membrane+interface+in+aging+and+age-related+macular+degeneration.">An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).</li><li>Lommatzsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+low+inflammatory+reactions+involved+in+exudative+age-related+macular+degeneration.">Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).</li><li>Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+creates+pro-angiogenic+environment+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+exposed+to+complement.">Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+local+complement+response+by+RPE+causes+early-stage+macular+degeneration.">A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).</li><li>Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+cause+RPE+cells+to+make+basal+deposits+and+activate+the+alternative+complement+pathway.">Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway.</a> Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+triggers+formation+of+sub-retinal+pigment+epithelium+deposits+via+the+ubiquitin+proteasome+pathway.">C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Farkas, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Pre-mRNA+processing+factors+3,+8,+and+31+cause+dysfunction+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).</li><li>Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Barrier+Properties+and+Inducible+VEGF+Expression+of+Several+Types+of+Retinal+Pigment+Epithelium+in+Medium-Term+Culture.">Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture.</a> Current Eye Research. 31, 739 (2006).</li><li>Sch&#252;tze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+findings+in+patients+with+albinism+using+wide-field+polarization-sensitive+optical+coherence+tomography.">Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography.</a> Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Garland, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetics+and+proteomic+analyses+demonstrate+a+critical+role+for+complement+in+a+model+of+DHRD/ML,+an+inherited+macular+degeneration.">Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R345W+mutation+in+EFEMP1+is+pathogenic+and+causes+AMD-like+deposits+in+mice.">The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice.</a> Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).</li><li>Greenwald, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+NMNAT1-Leber+Congenital+Amaurosis+(LCA9)+Recapitulate+Key+Features+of+the+Human+Disease.">Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).</li><li>Gupta, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ift172+conditional+knock-out+mice+exhibit+rapid+retinal+degeneration+and+protein+trafficking+defects.">Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects.</a> Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+promotes+morphogenesis+of+apical+microvilli+and+basal+infoldings+in+retinal+pigment+epithelium.">Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium.</a> Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).</li><li>Nandrot, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+synchronized+retinal+phagocytosis+and+age-related+blindness+in+mice+lacking+&#945;v&#946;5+integrin.">Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking &#945;v&#946;5 integrin.</a> Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology.">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Brydon, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Augmentation+Therapy+Restores+Critical+Functions+in+Mutant+PRPF31+/&#8722;+iPSC-Derived+RPE+Cells.">AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/&#8722; iPSC-Derived RPE Cells.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).</li><li>Bonilha, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+disease-related+structural+changes+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium.</a> Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).</li></ol>

Mentre diversi metodi per l'isolamento e la coltura delle cellule RPE del topoerano stati sviluppati prima di 1,13,20,22, 26,27, il metodo di Fernandez-Godino ha utilizzato per la prima volta inserti a membrana che consentono la crescita efficiente delle cellule RPE incoltura per le settimane 1,9<...

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. L'RPE è un monostrato situato nell'occhio tra la retina neurale e la membrana di Bruch. Questo singolo strato è costituito da cellule epiteliali altamente polarizzate e pigmentate unite da giunzioni strette, che presentano una forma esagonale che ricorda un nido d'ape2. Nonostante questa apparente semplicità istologica, l'RPE svolge un'ampia varietà di funzioni critiche per la retina e il normale ciclovisivo 2,3,4. Le funzioni principali del monostrato RPE includono l'assorbimento della luce, il nutrimento e il rinnovamento dei fotorecettori, la rimozione dei prodotti finali metabolici, il controllo dell'omeostasi ionica nello spazio subretinale e il mantenimento della barriera emato-retinica2,3. L'RPE ha anche un ruolo importante nella modulazione locale del sistema immunitario nell'occhio5,6,7,8,9,10,11. Degenerazione e/o disfunzione dell'RPE sono caratteristiche comuni condivise da molti disturbi oculari come retinite pigmentosa, amaurosi congenita di Leber, albinismo, retinopatia diabetica e degenerazione maculare12,13,14,15. Sfortunatamente, la disponibilità di tessuti umani è limitata. Data la loro omologia genetica altamente conservata con l'uomo, i modelli di topo rappresentano uno strumento adatto e utile per studiare i disturbioculari 16,17,18,19. Inoltre, l'uso di cellule RPE primarie coltivate offre vantaggi come la manipolazione genetica e il test farmacologico che possono accelerare lo sviluppo di nuove terapie per questi disturbi potenzialmenteletali per la vista 9,11.
I metodi esistenti disponibili per l'isolamento e la coltura dell'RPE del mouse mancano in modo riproducibile e non ricapitolano le funzionalità RPE in vivo con sufficiente affidabilità. Le cellule tendono a perdere pigmentazione, forma esagonale e resistenza elettrica transepiteliale (TER) entro pochi giorni incoltura 13,20. Poiché stabilire queste colture primarie di cellule RPE dai topi è un processo impegnativo, questo protocollo ottimizzato è stato creato sulla base di altri protocolli per isolare le cellule RPE dal ratto e dagli occhiumani 21,22,23 per sezionare gli occhi del mouse, raccogliere l'RPE e coltura le cellule RPE del topo in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled micro forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 45&#176; Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 1mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1 MG</td>
			<td>Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Supplement 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-914B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 12-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell supports 6.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors 8cm long, stainless steel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>6780-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells

I disturbi oculari colpiscono milioni di persone in tutto il mondo, ma la limitata disponibilità di tessuti umani ostacola il loro studio. I modelli di topo sono strumenti potenti per comprendere la fisiopatologia delle malattie oculari a causa delle loro somiglianze con l'anatomia e la fisiologia umana. Le alterazioni dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), inclusi i cambiamenti nella morfologia e nella funzione, sono caratteristiche comuni condivise da molti disturbi oculari. Tuttavia, l'isolamento e la coltura di successo delle cellule RPE del topo primario sono molto impegnativi. Questo documento è una versione audiovisiva aggiornata del protocollo precedentemente pubblicato da Fernandez-Godino et al. Questo metodo è altamente riproducibile e si traduce in solide colture di monostrati RPE altamente polarizzati e pigmentati che possono essere mantenuti per diverse settimane su Transwells. Questo modello apre nuove strade per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari alla base delle malattie oculari. Inoltre, fornisce una piattaforma per testare approcci terapeutici che possono essere utilizzati per trattare importanti malattie oculari con esigenze mediche non soddisfatte, compresi disturbi ereditari della retina e degenerazioni maculari.

Questo protocollo è stato utilizzato per isolare e coltura cellule RPE da topi geneticamente modificati1. Non sono state osservate differenze tra ceppi di topi o sesso. I risultati hanno contribuito a comprendere alcuni aspetti importanti del meccanismo alla base delle malattie oculari come la degenerazione maculare legata all'età, che è la causa più comune di perdita della vista tra gli anziani9. Le cellule RPE isolate a seguito di questo protocollo sono state completa...

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Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. La procedura dura circa 3 ore.

Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Questo protocollo consente l'isolamento e la coltura efficienti delle celle RPE del mouse. Le colture RPE primarie sane sono modelli preziosi per comprendere i meccanismi delle malattie oculari sottostanti. Le colture RPE confluenti e vitali ottengono entro tre giorni e possono essere coltivate per settimane.Questo protocollo è stato utilizzato con successo per comprendere i meccanismi alla base della degenerazione maculare legata alla prima età, che è la principale causa di cecità tra gli anziani nei paesi sviluppati. È importante visualizzare i passaggi di dissezione. I dettagli sono fondamentali per il successo del protocollo, ad esempio, come gestire i bulbi oculari in modo che lo sclera non venga perforato, dove dovrebbero essere eseguiti esattamente i tagli e come incorporare le coppe degli occhi nella tripparina in modo che rimangano aperte.Inizia con la preparazione di tutti i reagenti necessari per il protocollo. Quindi, inizia a pulire il bulbo oculare rimuovendo attentamente tutto il tessuto connettivo, il sangue e i muscoli, usando le forcelle dumont numero cinque e le forbici angolate, senza fare alcun taglio nella sclera. Trasferire regolarmente il bulbo oculare su un piatto fresco contenente tre millilitri di tampone HBSS privo di HEPES per mantenere l'occhio fresco e pulito ed evitare qualsiasi contaminazione.Utilizzare il nervo ottico come maniglia per tenere il bulbo oculare e fare un buco al centro della cornea con una lama in acciaio al carbonio acuto numero 11. Fai tre incisioni nella cornea attraverso il foro con le forbici Dumont numero cinque, assicurando che ci sia spazio sufficiente per rimuovere l'obiettivo. Tenere il nervo ottico e applicare una leggera pressione all'ora serrata con la base delle forbici angolate, fino a quando l'obiettivo esce completamente.Mantenere intatto l'epitelio dell'iride per prevenire il distacco della retina neurale e dell'RPE durante l'incubazione. Posizionare l'occhio nel buffer HBSS privo di HEPES. Incubare gli occhi senza lenti in soluzione di ialuronidasi a 37 gradi Celsius per 45 minuti in un incubatore aerato di anidride carbonica al 5% per staccare la retina neurale dall'RPE.Mettere ogni occhio in un nuovo pozzo con 1,5 millilitri di tampone HBSS HEPES freddo per pozzo e incubarlo sul ghiaccio per 30 minuti. Dopo il lavaggio, mettere ogni occhio in un piatto di coltura di 35 millimetri con tampone HEPES HBSS fresco. Tagliare la cornea attraverso le incisioni originali con forbici Vannas di otto centimetri fino a raggiungere l'ora serrata, quindi tagliare sotto l'ora serrata per rimuovere l'epitelio dell'iride e la cornea.Tenere l'ora serrata con pinzette curve e utilizzando micro pinze angolate, allontanare la retina neurale, assicurandosi che lo strato RPE non sia tagliato. Quindi, tagliare l'attacco interno al nervo ottico. Tagliare il nervo ottico e trasferire ogni tazza per gli occhi su una diversa piastra di 12 pozzi contenente 1,5 millilitri di tripside-EDTA fresco per pozzo.Assicurarsi che le coppe per gli occhi rimangano aperte e completamente immerse nella tripina. Incubare le coppe oculari a 37 gradi Celsius per 45 minuti in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Raccogliere ogni tazza per gli occhi insieme a eventuali fogli RPE staccati durante l'incubazione della tripparina e trasferirli in una piastra di 12 pozzi contenenti 1,5 millilitri di soluzione FBS per pozzo.Se i fogli RPE rimangono nella soluzione di tripina, utilizzare una micropipetta per trasferirli al pozzo con la soluzione FBS. Tenere ogni tazza per gli occhi dal nervo ottico e scuoterla a faccia in giù nella piastra del pozzo 12 contenente 1,5 millilitri di 20%FBS nel buffer HBSS HEPES fino a raggiungere il completo distacco dei fogli RPE. Raccogliere eventuali fogli RPE e cluster RPE con una micropipetta, evitando pezzi bianchi di sclera o coroide, che potrebbero contaminare le colture, e metterli in un tubo da 15 millilitri.Tirare due occhi dallo stesso mouse in un tubo. Quindi, centrifugare la miscela RPE a 340 x g per due minuti a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Rimossare delicatamente il pellet di RPE in una miscela millilitro dello 0,25% di tripsiderina-EDTA e incubarlo per un minuto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per disaggregare i fogli RPE in singole cellule.Quindi pipettare delicatamente su e giù 10 volte, evitando la formazione di bolle. Aggiungere nove millilitri di mezzo RPE appena preparato per diluire e inattivare la tripparina e centrifugare la miscela a 340 x g per due minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e rimescolare con cura il pellet cellulare in 150 microlitri di mezzo RPE con 5%FBS.Successivamente, rimuovere pbs dalla camera inferiore dell'inserto a membrana rivestito in laminina precedentemente preparato e aggiungere 700 microlitri di mezzo RPE ad esso. Rimuovere la laminina dalla camera superiore dell'inserto della membrana e distribuire la sospensione cellulare RPE in modo drop-wise e uniformemente al centro della camera. Posizionare l'inserto della membrana indisturbato in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per almeno 24 ore.Quindi controllare l'inserto della membrana al microscopio per assicurarsi che la maggior parte delle cellule RPE siano attaccate all'inserto e che la confluenza sia almeno del 50%Non cambiare il supporto durante le prime 72 ore. Le cellule RPE isolate utilizzando questo protocollo mostravano le dimensioni, la morfologia e la pigmentazione tipiche dell'RPE. Dopo una settimana è stato osservato un monostrato RPE altamente polarizzato con due nuclei uniti da giunzioni strette, insieme alla presenza di microvilli apicali e informazioni basali.La polarizzazione del monostrato RPE è stata confermata dai valori TER, con una media superiore a 200 ohm centimetro al quadrato, che è rimasta stabile nel tempo. Nei test di fagocitosi eseguiti su POS bovino etichettato FITC, è stato osservato l'inghiottimento e la digestione del POS, indicando la formazione di un monostrato confluente funzionale di cellule RPE. Le culture vitali richiedono un breve tempo di dissezione, che si ottiene con l'esperienza.Alcune cellule RPE possono rimanere attaccate alla retina neurale, ma se rimangono allegati più fogli RPE, il protocollo non avrà esito positivo. L'ialuronidasi fresca deve essere utilizzata ogni volta per prevenire questo problema. Queste colture funzionali di cellule RPE del topo primario sono uno strumento prezioso per studiare la patobiologia dell'RPE in molte malattie degli occhi.Ad esempio, questo protocollo ha permesso di studiare la patobiologia dell'RPE in un modello di topo di degenerazione maculare.

Research

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