Name: efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

이 작품은 매사추세츠 눈과 귀에 있는 안구 유전체학 연구소에 의해 지원되었습니다.

안과 및 시력 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 성명서의 지침이 뒤따랐습니다.
참고 : 이 방법은 C57BL / 6J, B10을 포함하여 다른 유전 배경의 마우스로 성공을 입증되었습니다. D2-Hco H2d H2-T18 c/oSnJ 및 알비노 마우스는 다양한 연령대에서. 바람직하게는 RPE 세포를 얻기 위해 8 에서 12 주 된 마우스를 사용합니다. 오래된 마우스에서 RPE 세포는 배양에서 더 ?...

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	<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Konari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-retinal+barrier+in+vitro:+Formation+of+tight+junctions+as+revealed+by+occludin+and+ZO-1+correlates+with+the+barrier+function+of+chick+retinal+pigment+epithelial+cells.">Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells.</a> Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).</li><li>Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+protein+secretion+by+the+retinal+pigment+epithelium:+Roles+in+retinal+health+and+the+development+of+age-related+macular+degeneration.">Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).</li><li>Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+inflammatory+processes+in+drusen+formation+and+age+related+macular+degeneration.">Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+hypothesis+that+considers+drusen+as+biomarkers+of+immune-mediated+processes+at+the+RPE-Bruch's+membrane+interface+in+aging+and+age-related+macular+degeneration.">An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).</li><li>Lommatzsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+low+inflammatory+reactions+involved+in+exudative+age-related+macular+degeneration.">Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).</li><li>Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+creates+pro-angiogenic+environment+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+exposed+to+complement.">Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+local+complement+response+by+RPE+causes+early-stage+macular+degeneration.">A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).</li><li>Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+cause+RPE+cells+to+make+basal+deposits+and+activate+the+alternative+complement+pathway.">Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway.</a> Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+triggers+formation+of+sub-retinal+pigment+epithelium+deposits+via+the+ubiquitin+proteasome+pathway.">C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Farkas, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Pre-mRNA+processing+factors+3,+8,+and+31+cause+dysfunction+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).</li><li>Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Barrier+Properties+and+Inducible+VEGF+Expression+of+Several+Types+of+Retinal+Pigment+Epithelium+in+Medium-Term+Culture.">Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture.</a> Current Eye Research. 31, 739 (2006).</li><li>Sch&#252;tze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+findings+in+patients+with+albinism+using+wide-field+polarization-sensitive+optical+coherence+tomography.">Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography.</a> Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Garland, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetics+and+proteomic+analyses+demonstrate+a+critical+role+for+complement+in+a+model+of+DHRD/ML,+an+inherited+macular+degeneration.">Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R345W+mutation+in+EFEMP1+is+pathogenic+and+causes+AMD-like+deposits+in+mice.">The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice.</a> Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).</li><li>Greenwald, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+NMNAT1-Leber+Congenital+Amaurosis+(LCA9)+Recapitulate+Key+Features+of+the+Human+Disease.">Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).</li><li>Gupta, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ift172+conditional+knock-out+mice+exhibit+rapid+retinal+degeneration+and+protein+trafficking+defects.">Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects.</a> Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+promotes+morphogenesis+of+apical+microvilli+and+basal+infoldings+in+retinal+pigment+epithelium.">Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium.</a> Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).</li><li>Nandrot, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+synchronized+retinal+phagocytosis+and+age-related+blindness+in+mice+lacking+&#945;v&#946;5+integrin.">Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking &#945;v&#946;5 integrin.</a> Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology.">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Brydon, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Augmentation+Therapy+Restores+Critical+Functions+in+Mutant+PRPF31+/&#8722;+iPSC-Derived+RPE+Cells.">AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/&#8722; iPSC-Derived RPE Cells.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).</li><li>Bonilha, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+disease-related+structural+changes+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium.</a> Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).</li></ol>

마우스 RPE 세포 격리 및 배양에 대한 몇 가지 방법이1,13,20,22,26,27이전에 개발되었지만, 페르난데스-고디노의 방법은 주1,9주동안 배양에서 RPE 세포의 효율적인 성장을 허용하는 멤브레인서트를 처음 사용...

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층을 형성하는 마우스 망막 색소 상피(RPE) 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. RPE는 신경 망막과 브루치의 막 사이의 눈에 있는 단층입니다. 이 단층은 단단한 접합에 의해 결합된 높게 편광및 색소상피 세포로 이루어져, 벌집2를닮은 육각형 모양을 전시합니다. 이러한 명백한 조직학적 단순성에도 불구하고, RPE는 망막과 통상의 시각 주기2,3,4에중요한 다양한 기능을 수행한다. RPE 단층의 주요 기능은 광수용체의 빛 흡수, 영양 및 재생, 대사 최종 제품의 제거, 혈액 망막 장벽 2,3의피하 공간 내이온 항상성 제어 및 유지보수를포함한다. RPE는 또한 눈5,6, 7,8,9,10,11에서면역 계통의 국소 변조에 중요한 역할을 한다. RPE의 변성 및/또는 기능 장애는 망막색소증, 레버 선천성 아마로증, 백색증, 당뇨병 성 망막증 및 황반 변성12,13,14,15와같은 많은 안구 질환에 의해 공유되는 일반적인 특징이다. 불행히도, 인간 조직의 가용성은 제한적입니다. 인간과 그들의 높게 보존된 유전 상동성을 감안할 때, 마우스 모형은 안구 무질서 를 공부하기 위한 적합하고 유용한 공구를 나타냅니다16,17,18,19. 더욱이, 배양된 1차 RPE 세포의 사용은 이러한 시력 위협장애에대한 새로운 치료법의 개발을 가속화할 수 있는 유전자 조작 및 약물 검사와 같은 이점을 제공한다9,11.
마우스 RPE 격리 및 문화권에 사용할 수 있는 기존 방법은 재현적으로 부족하며 충분한 신뢰성으로 생체 내에서 RPE 기능을 재현하지 않습니다. 세포는 배양13,20에서며칠 이내에 색소 침착, 육각형 모양 및 환피성 전기 저항(TER)을 잃는 경향이 있다. 마우스로부터 이러한 1차 RPE 세포 배양을 확립하는 것은 어려운 과정이기 때문에, 이 최적화된 프로토콜은 쥐와인간의 눈으로부터 RPE 세포를 분리하기 위한 다른 프로토콜에 기초하여만들어졌으며,22,23은 마우스 눈을 해부하고, RPE를 수집하고, 시험관내에서 마우스 RPE 세포를 배양한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled micro forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 45&#176; Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 1mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1 MG</td>
			<td>Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Supplement 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-914B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 12-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell supports 6.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors 8cm long, stainless steel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>6780-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells

눈 장애는 전 세계 사람들의 수백만에 영향을 미치지만, 인간 조직의 제한된 가용성은 그들의 연구 연구를 방해합니다. 마우스 모델은 인간 해부학 및 생리학과의 유사성 때문에 안구 질환의 병리생리학을 이해하는 강력한 도구입니다. 변색 및 기능의 변화를 포함하여 망막 색소 상피 (RPE)의 변경은 많은 안구 질환에 의해 공유되는 일반적인 특징입니다. 그러나, 1 차 마우스 RPE 세포의 성공적인 격리 및 배양은 매우 도전적이다. 이 논문은 이전에 페르난데스-고디노 외에 의해 이전에 출판 된 프로토콜의 업데이트 된 시청각 버전입니다. 이 방법은 매우 재현 가능하며 트랜스웰에서 몇 주 동안 유지할 수 있는 매우 편광및 색소화된 RPE 단층의 견고한 배양을 초래합니다. 이 모형은 눈 질병의 근본적인 분자 및 세포 기계장치의 연구 결과에 대한 새로운 도로를 엽니다. 더욱이, 상속된 망막 장애 및 황반 변성 등 충족되지 않은 의학적 필요를 가진 중요한 안과 질환을 치료하는 데 사용할 수 있는 치료 적 접근법을 테스트하는 플랫폼을 제공합니다.

이 프로토콜은 유전자 변형 마우스1로부터RPE 세포를 분리하고 배양하는 데 사용되었습니다. 마우스 균주 또는 성별 사이에 는 차이가 관찰되지 않았습니다. 결과는 노인9중 시력 상실의 가장 일반적인 원인인 노화 관련 황반 변성과 같은 기전기의 몇 가지 중요한 측면을 이해하는 데 도움이 되었습니다. 이 프로토콜에 따라 분리된 RPE 세포는 파종 후 24시간 멤?...

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Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

이 프로토콜을 사용하면 마우스 RPE 셀의 효율적인 격리 및 배양이 가능합니다. 건강한 1차 마우스 RPE 배양은 근본적인 눈 질환의 메커니즘을 이해하는 귀중한 모델입니다. Confluent 및 실행 가능한 RPE 문화는 3 일 이내에 얻을 수 있으며 몇 주 동안 재배 할 수 있습니다.이 프로토콜은 선진국의 노인 들 중 실명의 주요 원인인 초기 연령 관련 황반 변성의 근본적인 기계장치를 이해하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 해부 단계를 시각화하는 것이 중요합니다. 세부 사항은 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다, 예를 들어, sclera가 펀치되지 않도록 안구를 처리하는 방법, 정확히 절단을 수행해야하는 곳, 그리고 그들이 열려 있도록 트립신에 눈 컵을 포함하는 방법.프로토콜에 필요한 모든 시약을 준비하는 것으로 시작합니다. 그런 다음, 모든 결합 조직, 혈액 및 근육을 조심스럽게 제거하여 안구를 청소하기 시작하여, 두몬트 넘버 5 포셉과 각진 가위를 사용하여 clera에 상처를 주지 않고. 눈알을 헤페스가 없는 HBSS 버퍼 3밀리리터가 포함된 신선한 접시에 옮겨 눈을 신선하고 깨끗하게 유지하고 오염을 방지합니다.시신경을 손잡이로 사용하여 안구를 잡고 날카로운 탄소 강철 번호 11 블레이드로 각막 중앙에 구멍을 뚫습니다. 두몬트 넘버 5 가위로 구멍을 뚫고 각막에 3개의 절개를 만들어 렌즈를 제거할 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인합니다. 시신경을 잡고 각진 가위의 기저와 함께 오라 세라타에 약간의 압력을 가하여 렌즈가 완전히 나올 때까지 가위를 발라주세요.홍채 상피를 그대로 유지하여 잠복 중에 신경 망막과 RPE의 분리를 방지하십시오. HEPES가 없는 HBSS 버퍼에 눈을 놓습니다. 5%의 이산화탄소 식기 배양기에서 45분 동안 히알루로니다제 용액의 렌즈없이 눈을 배양하여 RPE에서 신경 망막을 분리합니다.각 눈을 1.5 밀리리터의 차가운 HBSS HEPES 버퍼로 새 우물에 놓고 30 분 동안 얼음에 배양하십시오. 세척 후, 신선한 HBSS HEPES 버퍼와 35 밀리미터 문화 요리에 각 눈을 배치합니다. 오라 세라타가 도달 할 때까지 8 센티미터 반나스 가위로 원래 절개를 통해 각막을 잘라, 다음 홍채 상피와 각막을 제거하기 위해 오라 세라타 아래로 잘라.곡선 핀셋으로 오라 세라타를 잡고 각진 마이크로 포셉을 사용하여 신경 망막을 꺼내 RPE 층이 절단되지 않았는지 확인합니다. 그런 다음 시신경에 대한 내부 부착물을 잘라냅니다. 시신경을 자르고 각 아이컵을 1.5 밀리리터의 신선한 트립신-EDTA를 포함한 다른 12개의 웰 플레이트로 전달합니다.아이컵이 열리고 트립신에 완전히 잠긴 상태로 유지되도록 하십시오. 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 37도의 안구컵을 섭씨 37도에서 45분간 배양합니다. 트립신 인큐베이션 중에 분리 된 RPE 시트와 함께 각 아이 컵을 수집하고 잘 당 FBS 솔루션의 1.5 밀리리터를 포함하는 12 웰 플레이트로 전송합니다.RPE 시트가 트립신 솔루션에 남아 있는 경우 마이크로 파이프를 사용하여 FBS 솔루션으로 우물로 전송합니다. 각 안구는 시신경에 의해 각 안자를 잡고 RPE 시트의 완전한 분리가 이루어질 때까지 HBSS HEPES 버퍼에서 20%의 FBS1.5 밀리리터를 함유한 12개의 웰 플레이트로 아래로 흔들어 줍니다. 배양을 오염시킬 수 있는 조각이나 코로이드를 피하고, 마이크로피펫으로 RPE 시트와 RPE 클러스터를 수집하고 15밀리리터 튜브에 넣습니다.한 튜브에 같은 마우스에서 두 눈을 당깁니다. 그런 다음 RPE 혼합물을 실온에서 2분 동안 340 x g에서 원심분리하고 상체를 폐기합니다. RPE 펠릿을 0.25%의 트립신-EDTA 의 1밀리리터 혼합물로 부드럽게 재중단하고 RPE 시트를 단일 세포로 분해하기 위해 섭씨 37도의 수조에서 1분 동안 배양합니다.그런 다음 거품 형성을 피하면서 10번 위아래로 부드럽게 피펫을 피합니다. 갓 준비된 RPE 배지 9밀리리터를 추가하여 실온에서 2분 동안 트립신과 원심분리기를 340xg에서 희석하고 비활성화합니다. 수퍼내티를 흡인하고 5%의 FBS를 가진 RPE 배지의 150 마이크로리터에서 셀 펠릿을 조심스럽게 재보힙합니다.다음으로, 이전에 준비된 라미닌 코팅 멤브레인 인서트의 하단 챔버에서 PBS를 제거하고 700 마이크로리터의 RPE 배지를 추가한다. 멤브레인 인서트의 상부 챔버에서 라미닌을 제거하고 RPE 셀 서스펜션 드롭 와이즈를 분할하고 챔버의 중앙에 균일하게 분배한다. 멤브레인 인서트를 5%의 이산화탄소 인큐베이터에 37°C이상 24시간 동안 배치합니다.그런 다음 현미경 의 밑에 멤브레인 삽입을 확인하여 대부분의 RPE 세포가 삽입에 부착되고 합류가 적어도 50 %인지 확인72 시간 동안 미디어를 변경하지 마십시오. 이 프로토콜을 사용하여 분리된 RPE 세포는 전형적인 RPE 크기, 형태학 및 색소 침착을 보였다. 두 개의 핵이 단단한 접합과 함께 압정 마이크로빌리 및 기저 인폴딩의 존재와 함께 고극성 RPE 단층이 1 주일 후에 관찰되었습니다.RPE 단층의 편광은 TER 값에 의해 확인되었으며, 평균 200 ohms 센티미터 제곱보다 높은 것으로 시간이 지남에 따라 안정적으로 유지되었습니다. FITC 표지소 POS에서 수행된 식세포분해소에서, POS의 침몰 및 소화가 관찰되어 RPE 세포의 기능적인 컨실릭 단층의 형성을 나타낸다. 실행 가능한 문화권은 경험으로 달성되는 짧은 해부 시간이 필요합니다.일부 RPE 세포는 신경 망막에 부착된 상태를 유지할 수 있지만 여러 RPE 시트가 부착된 상태로 유지되면 프로토콜이 성공하지 못할 것입니다. 신선한 히알루로니다스는 이 문제를 방지하기 위해 매번 사용되어야 합니다. 이러한 기능적인 1차 마우스 RPE 세포 배양은 많은 안구 질환에서 RPE의 병리학을 연구하는 귀중한 도구입니다.예를 들어, 이 프로토콜은 황반 변성의 마우스 모델에서 RPE의 병리학을 연구할 수 있게 했다.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

기본 인간 난관 상피 세포의 전의 VIVO 문화

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

조직학적 분석을 위해 인간의 눈에서 망막 색소 상피/맥락막 플랫마운트의 효율적이고 일관된 생성

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...