Name: efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Ocular Genomics Institute ved Massachusetts Eye and Ear.

Retningslinjene i ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning ble fulgt.
MERK: Denne metoden har vist seg å være vellykket med mus med forskjellig genetisk bakgrunn, inkludert C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ, og albinomus, i ulike aldre. Bruk helst 8 til 12 uker gamle mus for å få RPE-celler. RPE-celler fra eldre mus sprer seg mindre i kultur, og yngre mus har færre og mindre celler, noe som krever at samlende øyne fra forskje...

<ol>
	<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Konari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-retinal+barrier+in+vitro:+Formation+of+tight+junctions+as+revealed+by+occludin+and+ZO-1+correlates+with+the+barrier+function+of+chick+retinal+pigment+epithelial+cells.">Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells.</a> Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).</li><li>Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+protein+secretion+by+the+retinal+pigment+epithelium:+Roles+in+retinal+health+and+the+development+of+age-related+macular+degeneration.">Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).</li><li>Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+inflammatory+processes+in+drusen+formation+and+age+related+macular+degeneration.">Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+hypothesis+that+considers+drusen+as+biomarkers+of+immune-mediated+processes+at+the+RPE-Bruch's+membrane+interface+in+aging+and+age-related+macular+degeneration.">An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).</li><li>Lommatzsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+low+inflammatory+reactions+involved+in+exudative+age-related+macular+degeneration.">Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).</li><li>Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+creates+pro-angiogenic+environment+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+exposed+to+complement.">Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+local+complement+response+by+RPE+causes+early-stage+macular+degeneration.">A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).</li><li>Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+cause+RPE+cells+to+make+basal+deposits+and+activate+the+alternative+complement+pathway.">Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway.</a> Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+triggers+formation+of+sub-retinal+pigment+epithelium+deposits+via+the+ubiquitin+proteasome+pathway.">C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Farkas, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Pre-mRNA+processing+factors+3,+8,+and+31+cause+dysfunction+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).</li><li>Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Barrier+Properties+and+Inducible+VEGF+Expression+of+Several+Types+of+Retinal+Pigment+Epithelium+in+Medium-Term+Culture.">Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture.</a> Current Eye Research. 31, 739 (2006).</li><li>Sch&#252;tze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+findings+in+patients+with+albinism+using+wide-field+polarization-sensitive+optical+coherence+tomography.">Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography.</a> Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Garland, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetics+and+proteomic+analyses+demonstrate+a+critical+role+for+complement+in+a+model+of+DHRD/ML,+an+inherited+macular+degeneration.">Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R345W+mutation+in+EFEMP1+is+pathogenic+and+causes+AMD-like+deposits+in+mice.">The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice.</a> Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).</li><li>Greenwald, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+NMNAT1-Leber+Congenital+Amaurosis+(LCA9)+Recapitulate+Key+Features+of+the+Human+Disease.">Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).</li><li>Gupta, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ift172+conditional+knock-out+mice+exhibit+rapid+retinal+degeneration+and+protein+trafficking+defects.">Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects.</a> Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+promotes+morphogenesis+of+apical+microvilli+and+basal+infoldings+in+retinal+pigment+epithelium.">Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium.</a> Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).</li><li>Nandrot, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+synchronized+retinal+phagocytosis+and+age-related+blindness+in+mice+lacking+&#945;v&#946;5+integrin.">Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking &#945;v&#946;5 integrin.</a> Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology.">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Brydon, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Augmentation+Therapy+Restores+Critical+Functions+in+Mutant+PRPF31+/&#8722;+iPSC-Derived+RPE+Cells.">AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/&#8722; iPSC-Derived RPE Cells.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).</li><li>Bonilha, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+disease-related+structural+changes+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium.</a> Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).</li></ol>

Mens flere metoder for mus RPE celleisolasjon og kultur hadde blitt utviklet før1,13,20,22,26,27, Fernandez-Godino metode først brukt membran innsatser slik at effektiv vekst av RPE celler i kultur i uke1,9. En annen stor endring i deres protokoll1...

Denne protokollen, som opprinnelig ble rapportert av Fernandez-Godino et al. i 20161, beskriver en metode for effektivt å isolere og kultur mus retinal pigment epitel (RPE) celler, som danner en funksjonell og polarisert RPE monolayer innen en uke på Transwell plater. RPE er en monolayer som ligger i øyet mellom nevral netthinnen og Bruchs membran. Dette enkeltlaget består av svært polariserte og pigmenterte epitelceller forbundet med tette veikryss, og viser en sekskantet form som ligner en honningkake2. Til tross for denne tilsynelatende histologiske enkelheten, utfører RPE et bredt spekter av funksjoner som er kritiske for netthinnen og den normale visuelle syklusen2,3,4. Hovedfunksjonene til RPE monolayer inkluderer lysabsorpsjon, næring og fornyelse av fotoreseptorer, fjerning av metabolske sluttprodukter, kontroll av ion homeostase i subretinal plass og vedlikehold av blod-retinal barriere2,3. RPE har også en viktig rolle i lokal modulering av immunsystemet i øyet5,6,7,8,9,10,11. Degenerasjon og/eller dysfunksjon av RPE er vanlige trekk som deles av mange okulære lidelser som retinitis pigmentosa, Leber medfødt amaurose, albinisme, diabetisk retinopati og makuladegenerasjon12,13,14,15. Dessverre er tilgjengeligheten av menneskelig vev begrenset. Gitt deres høyt bevarte genetiske homologi med mennesker, representerer musemodeller et passende og nyttig verktøy for å studere okulære lidelser16,17,18,19. Videre gir bruk av kultiverte primære RPE-celler fordeler som genetisk manipulasjon og legemiddeltesting som kan akselerere utviklingen av nye terapier for disse synstruende lidelsene9,11.
Eksisterende metoder tilgjengelig for mus RPE isolasjon og kultur mangler reprodusert og ikke rekapitulere RPE funksjoner in vivo med nok pålitelighet. Celler har en tendens til å miste pigmentering, sekskantet form og transepithelial elektrisk motstand (TER) innen få dager i kultur13,20. Siden etableringen av disse primære RPE-cellekulturene fra mus er en utfordrende prosess, er denne optimaliserte protokollen opprettet basert på andre protokoller for å isolere RPE-celler fra rotte og menneskelige øyne21,22,23 for å dissekere museøyne, samle RPE og kultur musen RPE celler in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled micro forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 45&#176; Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 1mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1 MG</td>
			<td>Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Supplement 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-914B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 12-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell supports 6.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors 8cm long, stainless steel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>6780-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells

Øyesykdommer påvirker millioner av mennesker over hele verden, men den begrensede tilgjengeligheten av humant vev hindrer studien deres. Musemodeller er kraftige verktøy for å forstå patofysiologien til okulære sykdommer på grunn av deres likheter med menneskelig anatomi og fysiologi. Endringer i retinal pigment epitel (RPE), inkludert endringer i morfologi og funksjon, er vanlige funksjoner som deles av mange okulære lidelser. Imidlertid er vellykket isolasjon og kultur av primære mus RPE-celler svært utfordrende. Denne artikkelen er en oppdatert audiovisuell versjon av protokollen som tidligere ble publisert av Fernandez-Godino et al. i 2016 for effektivt å isolere og dyrke primære mus RPE-celler. Denne metoden er svært reproduserbar og resulterer i robuste kulturer av svært polariserte og pigmenterte RPE monolayers som kan opprettholdes i flere uker på Transwells. Denne modellen åpner nye veier for studiet av molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn for øyesykdommer. Videre gir det en plattform for å teste terapeutiske tilnærminger som kan brukes til å behandle viktige øyesykdommer med udekkede medisinske behov, inkludert arvelige netthinneforstyrrelser og makuladegenerasjoner.

Denne protokollen har blitt brukt til å isolere og dyrke RPE-celler fra genetisk modifiserte mus1. Det er ikke observert forskjeller mellom musestammer eller kjønn. Resultatene har bidratt til å forstå noen viktige aspekter av mekanismen som ligger til grunn for okulære sykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon, som er den vanligste årsaken til synstap blant eldre9. RPE-celler isolert etter denne protokollen var helt festet til membraninnsatsen 24 timer etter s?...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Denne protokollen, som opprinnelig ble rapportert av Fernandez-Godino et al. i 20161, beskriver en metode for effektivt å isolere og kulturmus RPE-celler, som danner en funksjonell og polarisert RPE monolayer innen en uke på Transwell-plater. Prosedyren tar ca. 3 timer.

Effektiv disseksjon og kultur av primære mus retinal pigment epitelceller

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Denne protokollen muliggjør effektiv isolasjon og kultur av mus RPE celler. Sunn primærmus RPE-kulturer er verdifulle modeller for å forstå mekanismene for underliggende øyesykdommer. Samtidige og levedyktige RPE-kulturer oppnås innen tre dager og kan dyrkes i flere uker.Denne protokollen har blitt brukt til å forstå mekanismene som ligger til grunn for tidlig aldersrelatert makuladegenerasjon, som er den ledende årsaken til blindhet blant eldre i utviklede land. Det er viktig å visualisere disseksjonstrinnene. Detaljer er avgjørende for suksessen til protokollen, for eksempel hvordan du håndterer øyebollene slik at sclera ikke blir slått, hvor nøyaktig kutt skal utføres, og hvordan du legger inn øyekoppene i trypsin slik at de holder seg åpne.Begynn med å forberede alle nødvendige reagenser for protokollen. Begynn deretter å rengjøre øyebollet ved å forsiktig fjerne alt bindevev, blod og muskler, ved hjelp av Dumont nummer fem tang og vinklet saks, uten å gjøre noen kutt i sclera. Overfør øyebollet til en fersk tallerken som inneholder tre milliliter HEPES-fri HBSS-buffer regelmessig for å holde øyet friskt og rent og unngå forurensning.Bruk synsnerven som håndtak for å holde øyebollet og lage et hull i midten av hornhinnen med et skarpt karbonstål nummer 11 blad. Lag tre snitt i hornhinnen gjennom hullet med Dumont nummer fem saks, og sørg for at det er tilstrekkelig plass til å fjerne linsen. Hold synsnerven og legg et lite trykk på ora serrataen med bunnen av den vinklede saksen, til linsen kommer helt ut.Hold iris epitelet intakt for å forhindre løsrivelse av nevral netthinnen og RPE under inkubasjon. Plasser øyet i HEPES-fri HBSS-buffer. Inkuber øynene uten linser i hyaluronidaseoppløsning ved 37 grader Celsius i 45 minutter i en 5% karbondioksid luftet inkubator for å løsne nevral netthinnen fra RPE.Plasser hvert øye i en ny brønn med 1,5 milliliter kald HBSS HEPES-buffer per brønn og inkuber den på is i 30 minutter. Etter vask, plasser hvert øye i en 35 millimeter kulturrett med fersk HBSS HEPES-buffer. Klipp hornhinnen gjennom de opprinnelige snittene med åtte centimeter Vannas saks til ora serrata er nådd, og kutt deretter under ora serrata for å fjerne iris epitel og hornhinne.Hold ora serrata med buede pinsett og bruk vinklede mikro tang, trekk bort nevral netthinnen, og sørg for at RPE-laget ikke er kuttet. Klipp deretter det indre vedlegget til synsnerven. Klipp synsnerven og overfør hver øyekopp til en annen 12 brønnplate som inneholder 1,5 milliliter ferske trypsin-EDTA per brønn.Pass på at øyekoppene forblir åpne og helt nedsenket i trypsin. Inkuber øyekoppene ved 37 grader Celsius i 45 minutter i en 5% karbondioksidinkubator. Samle hver øyekopp sammen med eventuelle RPE-ark som er løsnet under trypsininkubasjonen og overfør dem til en 12 brønnplate som inneholder 1,5 milliliter FBS-løsning per brønn.Hvis RPE-arkene forblir i trypsinløsningen, bruk en mikropipette for å overføre dem til brønnen med FBS-løsning. Hold hver øyekopp ved synsnerven og rist den med forsiden ned i 12 brønnplaten som inneholder 1,5 milliliter 20% FBS i HBSS HEPES-bufferen til fullstendig løsrivelse av RPE-arkene er oppnådd. Samle eventuelle RPE-ark og RPE-klynger med en mikropipette, unngå hvite biter av sclera eller choroid, som kan forurense kulturene, og plassere dem i et 15 milliliterrør.Trekk to øyne fra samme mus i ett rør. Sentrifuger deretter RPE-blandingen ved 340 x g i to minutter ved romtemperatur og kast supernatanten. Resuspend RPE-pelletsen forsiktig i en milliliterblanding på 0,25% trypsin-EDTA og inkuber den i ett minutt i et vannbad ved 37 grader Celsius for å demontere RPE-arkene i enkeltceller.Rør deretter forsiktig opp og ned 10 ganger, unngå bobledannelse. Tilsett ni milliliter nylaget RPE-medium for å fortynne og inaktivere trypsin og sentrifuger blandingen ved 340 x g i to minutter ved romtemperatur. Aspirer den supernatante og forsiktig resuspend cellepellet i 150 mikroliter RPE medium med 5% FBS.Deretter fjerner du PBS fra bunnkammeret til den tidligere forberedte lamininbelagte membraninnsatsen og tilsett 700 mikroliter RPE-medium til den. Fjern lamininet fra det øvre kammeret på membraninnsatsen og fordel RPE-celleopphenget dråpevis og jevnt til midten av kammeret. Plasser membraninnsatsen uforstyrret i en 5% karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius i minst 24 timer.Kontroller deretter membraninnsatsen under mikroskopet for å sikre at de fleste RPE-celler er festet til innsatsen og samløpet er minst 50%Ikke endre mediet i løpet av de første 72 timene. RPE-celler isolert ved hjelp av denne protokollen viste den typiske RPE-størrelsen, morfologien og pigmenteringen. En svært polarisert RPE monolayer med to kjerner forbundet med tette veikryss, sammen med tilstedeværelsen av apikale mikrovilli og basale infoldings, ble observert etter en uke.Polarisering av RPE monolayer ble bekreftet av TER-verdier, med gjennomsnittet høyere enn 200 ohm centimeter kvadrert, som forble stabilt over tid. I fagocytoseanalyser utført på FITC merket bovine POS, ble det observert engulfment og fordøyelse av POS, noe som indikerer dannelse av en funksjonell sammenfallende monolayer av RPE-celler. Levedyktige kulturer krever kort disseksjonstid, som oppnås med erfaring.Noen RPE-celler kan forbli festet til nevral netthinnen, men hvis flere RPE-ark forblir festet, vil protokollen ikke lykkes. Frisk hyaluronidase må brukes hver gang for å forhindre dette problemet. Disse funksjonelle primære musen RPE cellekulturer er et verdifullt verktøy for å studere patologien til RPE i mange øyesykdommer.For eksempel gjorde denne protokollen det mulig å studere RPE-patobiologien i en musemodell av makuladegenerasjon.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolasjon og kultur av mus Primær acinøse Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MikroRNA uttrykk profiler av menneskelige iPS celler, retinal pigment epitelet avledet fra iPS, og Fetal Netthinne Pigment Epitel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal transplantasjon av menneskelige embryonale stamcelleforskningen avledet retinal Pigment epitelceller i store øyne modell av geografiske Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primært cellekulturer fra musen netthinnens Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Isolasjon, kultur og genteknologi av pattedyr primærpigment epitelceller for ikke-viral genterapi

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primær kultur av svin retinal pigment epitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolering av primære retinale retinale pigmenterte epitelceller

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Effektiv og konsistent generering av retinal pigmentepitel / choroid flatmounts fra Human Eyes for histologisk analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...