Name: efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Genômica Ocular em Massachusetts Eye and Ear.

Foram seguidas as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão.
NOTA: Este método tem sido comprovado com sucesso com camundongos de diferentes origens genéticas, incluindo C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ, e ratos albinos, em várias idades. Use preferencialmente camundongos de 8 a 12 semanas para obter células RPE. As células RPE de camundongos mais velhos proliferam menos na cultura e os camundongos mai...

<ol>
	<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Konari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-retinal+barrier+in+vitro:+Formation+of+tight+junctions+as+revealed+by+occludin+and+ZO-1+correlates+with+the+barrier+function+of+chick+retinal+pigment+epithelial+cells.">Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells.</a> Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).</li><li>Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+protein+secretion+by+the+retinal+pigment+epithelium:+Roles+in+retinal+health+and+the+development+of+age-related+macular+degeneration.">Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).</li><li>Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+inflammatory+processes+in+drusen+formation+and+age+related+macular+degeneration.">Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+hypothesis+that+considers+drusen+as+biomarkers+of+immune-mediated+processes+at+the+RPE-Bruch's+membrane+interface+in+aging+and+age-related+macular+degeneration.">An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).</li><li>Lommatzsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+low+inflammatory+reactions+involved+in+exudative+age-related+macular+degeneration.">Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).</li><li>Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+creates+pro-angiogenic+environment+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+exposed+to+complement.">Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+local+complement+response+by+RPE+causes+early-stage+macular+degeneration.">A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).</li><li>Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+cause+RPE+cells+to+make+basal+deposits+and+activate+the+alternative+complement+pathway.">Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway.</a> Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+triggers+formation+of+sub-retinal+pigment+epithelium+deposits+via+the+ubiquitin+proteasome+pathway.">C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Farkas, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Pre-mRNA+processing+factors+3,+8,+and+31+cause+dysfunction+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).</li><li>Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Barrier+Properties+and+Inducible+VEGF+Expression+of+Several+Types+of+Retinal+Pigment+Epithelium+in+Medium-Term+Culture.">Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture.</a> Current Eye Research. 31, 739 (2006).</li><li>Sch&#252;tze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+findings+in+patients+with+albinism+using+wide-field+polarization-sensitive+optical+coherence+tomography.">Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography.</a> Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Garland, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetics+and+proteomic+analyses+demonstrate+a+critical+role+for+complement+in+a+model+of+DHRD/ML,+an+inherited+macular+degeneration.">Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R345W+mutation+in+EFEMP1+is+pathogenic+and+causes+AMD-like+deposits+in+mice.">The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice.</a> Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).</li><li>Greenwald, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+NMNAT1-Leber+Congenital+Amaurosis+(LCA9)+Recapitulate+Key+Features+of+the+Human+Disease.">Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).</li><li>Gupta, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ift172+conditional+knock-out+mice+exhibit+rapid+retinal+degeneration+and+protein+trafficking+defects.">Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects.</a> Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+promotes+morphogenesis+of+apical+microvilli+and+basal+infoldings+in+retinal+pigment+epithelium.">Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium.</a> Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).</li><li>Nandrot, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+synchronized+retinal+phagocytosis+and+age-related+blindness+in+mice+lacking+&#945;v&#946;5+integrin.">Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking &#945;v&#946;5 integrin.</a> Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology.">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Brydon, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Augmentation+Therapy+Restores+Critical+Functions+in+Mutant+PRPF31+/&#8722;+iPSC-Derived+RPE+Cells.">AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/&#8722; iPSC-Derived RPE Cells.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).</li><li>Bonilha, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+disease-related+structural+changes+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium.</a> Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).</li></ol>

Enquanto vários métodos para o isolamento e cultura das células RPE do camundongo haviam sido desenvolvidos antesde 1,13,20,22,26,27, o método de Fernandez-Godino usou pela primeira vez inserções de membrana permitindo o crescimento eficiente das células RPE na cultura durante as semanas1,<...

Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 20161,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células de pigmento de retina de camundongos (RPE), que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas transwell. O RPE é uma monocamada localizada no olho entre a retina neural e a membrana do Bruch. Esta camada única consiste em células epiteliais altamente polarizadas e pigmentadas unidas por junções apertadas, exibindo uma forma hexagonal que se assemelha a um favo de mel2. Apesar dessa aparente simplicidade histológica, o RPE executa uma grande variedade de funções críticas à retina e ao ciclo visual normal2,3,4. As principais funções da monocamada RPE incluem absorção de luz, nutrição e renovação de fotorreceptores, remoção de produtos finais metabólicos, controle da homeostase de íon no espaço subretral e manutenção da barreira hemintária2,3. O RPE também tem um papel importante na modulação local do sistema imunológico no olho5,6,7,8,9,10,11. Degeneração e/ou disfunção do RPE são características comuns compartilhadas por muitas doenças oculares como retinite pigmentosa, amaurose congênita leber, albinismo, retinopatia diabética e degeneração macular12,13,14,15. Infelizmente, a disponibilidade de tecidos humanos é limitada. Dada a sua homologia genética altamente conservada com humanos, os modelos de camundongos representam uma ferramenta adequada e útil para o estudo de distúrbios oculares16,17,18,19. Além disso, o uso de células RPE primárias cultivadas proporciona vantagens como manipulação genética e testes de drogas que podem acelerar o desenvolvimento de novas terapias para esses transtornos que ameaçam a visão9,11.
Os métodos existentes disponíveis para isolamento e cultura de RPE do mouse carecem de reprodutivelmente e não recapitulam os recursos RPE in vivo com confiabilidade suficiente. As células tendem a perder pigmentação, forma hexagonal e resistência elétrica transeptelial (TER) dentro de poucos dias na cultura13,20. Uma vez que estabelecer essas culturas primárias de células RPE a partir de camundongos é um processo desafiador, este protocolo otimizado foi criado com base em outros protocolos para isolar células RPE de ratos e olhos humanos21,22,23 para dissecar os olhos do rato, coletar o RPE e cultivar as células RPE do mouse in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled micro forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 45&#176; Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 1mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1 MG</td>
			<td>Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Supplement 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-914B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 12-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell supports 6.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors 8cm long, stainless steel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>6780-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells

Os distúrbios oculares afetam milhões de pessoas em todo o mundo, mas a disponibilidade limitada de tecidos humanos dificulta seu estudo. Modelos de camundongos são ferramentas poderosas para entender a fisiopatologia de doenças oculares devido às suas semelhanças com a anatomia humana e a fisiologia. Alterações no epitélio pigmento da retina (RPE), incluindo alterações na morfologia e função, são características comuns compartilhadas por muitas doenças oculares. No entanto, o isolamento bem sucedido e a cultura das células RPE do mouse primário é muito desafiador. Este artigo é uma versão audiovisual atualizada do protocolo publicado anteriormente por Fernandez-Godino et al. em 2016 para isolar e cultivar eficientemente células RPE do mouse primário. Este método é altamente reproduzível e resulta em culturas robustas de monocamadas RPE altamente polarizadas e pigmentadas que podem ser mantidas por várias semanas na Transwells. Este modelo abre novos caminhos para o estudo dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes às doenças oculares. Além disso, fornece uma plataforma para testar abordagens terapêuticas que podem ser usadas para tratar doenças oculares importantes com necessidades médicas não atendidas, incluindo distúrbios hereditários da retina e degenerações maculares.

Este protocolo tem sido usado para isolar e cultivar células RPE de camundongos geneticamente modificados1. Não foram observadas diferenças entre cepas de camundongos ou sexo. Os resultados têm ajudado a compreender alguns aspectos importantes do mecanismo subjacente às doenças oculares subjacentes, como a degeneração macular relacionada à idade, que é a causa mais comum de perda de visão entre os idosos9. As células RPE isoladas após este protocolo foram compl...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 20161,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células RPE do mouse, que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas Transwell. O procedimento leva aproximadamente 3 horas.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Este protocolo permite o isolamento eficiente e a cultura das células RPE do mouse. Culturas de RPE de camundongos primários saudáveis são modelos valiosos para entender os mecanismos das doenças oculares subjacentes. Culturas de RPE confluentes e viáveis obtêm dentro de três dias e podem ser cultivadas por semanas.Este protocolo tem sido usado com sucesso para compreender os mecanismos subjacentes à degeneração macular relacionada à idade precoce, que é a principal causa de cegueira entre os idosos nos países desenvolvidos. É importante visualizar as etapas de dissecção. Os detalhes são fundamentais para o sucesso do protocolo, por exemplo, como lidar com os globos oculares para que a esclera não seja perfurada, onde exatamente os cortes devem ser realizados, e como incorporar os copos oculares na trippsina para que fiquem abertos.Comece com a preparação de todos os reagentes necessários para o protocolo. Em seguida, comece a limpar o globo ocular removendo cuidadosamente todo o tecido conjuntivo, sangue e músculos, usando Dumont número cinco fórceps e tesouras angulares, sem fazer nenhum corte na esclera. Transfira o globo ocular para um prato fresco contendo três mililitros de tampão HBSS sem HEPES regularmente para manter os olhos frescos e limpos e evitar qualquer contaminação.Use o nervo óptico como alça para segurar o globo ocular e fazer um buraco no centro da córnea com uma lâmina de aço carbono afiada número 11. Faça três incisões na córnea através do orifício com dumont número cinco tesoura, garantindo que haja espaço suficiente para remover a lente. Segure o nervo óptico e aplique uma leve pressão na ora serrata com a base da tesoura angular, até que a lente saia completamente.Mantenha o epitélio de íris intacto para evitar o descolamento da retina neural e do RPE durante a incubação. Coloque o olho no buffer HBSS sem HEPES. Incubar os olhos sem lentes na solução de hialuronidase a 37 graus Celsius por 45 minutos em uma incubadora aerada de dióxido de carbono de 5% para desprender a retina neural do RPE.Coloque cada olho em um novo poço com 1,5 mililitros de tampão HBSS HEPES frio por poço e incuba-o no gelo por 30 minutos. Após a lavagem, coloque cada olho em um prato de cultura de 35 milímetros com tampão HBSS HEPES fresco. Corte a córnea através das incisões originais com uma tesoura Vannas de oito centímetros até que a ora serrata seja atingida, depois corte abaixo da serrata de ora para remover o epitélio de íris e córnea.Segure a serrata de ora com pinças curvas e usando micro fórceps angulares, puxe a retina neural, certificando-se de que a camada RPE não seja cortada. Em seguida, corte o apego interno ao nervo óptico. Corte o nervo óptico e transfira cada copo ocular para uma placa diferente de 12 poços contendo 1,5 mililitros de trippsina-EDTA fresca por poço.Certifique-se de que os copos oculares permaneçam abertos e completamente submersos na trippsina. Incubar os copos oculares a 37 graus Celsius por 45 minutos em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Colete cada copo de olho junto com quaisquer folhas de RPE destacadas durante a incubação de trippsina e transfira-as para uma placa de 12 poços contendo 1,5 mililitros de solução FBS por poço.Se as folhas RPE permanecerem na solução trypsin, use uma micropipette para transferi-las para o poço com a solução FBS. Segure cada copo ocular pelo nervo óptico e agite-o de frente para baixo na placa de 12 poços contendo 1,5 mililitros de 20% FBS no tampão HBSS HEPES até que o descolamento completo das folhas RPE seja alcançado. Colete quaisquer folhas de RPE e clusters RPE com uma micropipette, evitando quaisquer pedaços brancos de esclera ou coroide, que possam contaminar as culturas, e coloque-as em um tubo de 15 mililitros.Puxe dois olhos do mesmo rato em um tubo. Em seguida, centrifufique a mistura de RPE a 340 x g por dois minutos em temperatura ambiente e descarte o supernaspe. Resuspenque suavemente a pelota RPE em uma mistura de um mililitro de 0,25% trypsin-EDTA e incuba-a por um minuto em um banho de água a 37 graus Celsius para desagregar as folhas RPE em células únicas.Em seguida, delicadamente pipeta para cima e para baixo 10 vezes, evitando a formação de bolhas. Adicione nove mililitros de meio RPE recém-preparado para diluir e inativar a trippsina e centrifugar a mistura a 340 x g por dois minutos à temperatura ambiente. Aspire o supernascer e resuspenja cuidadosamente a pelota celular em 150 microliters de meio RPE com 5%FBS.Em seguida, remova o PBS da câmara inferior da inserção de membrana revestida de laminina previamente preparada e adicione 700 microliters de meio RPE a ele. Remova a laminina da câmara superior da inserção da membrana e distribua a suspensão da célula RPE em termos de gota e uniformemente para o centro da câmara. Coloque a inserção da membrana intacta em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por pelo menos 24 horas.Em seguida, verifique a inserção da membrana sob o microscópio para certificar-se de que a maioria das células RPE estão ligadas à inserção e a confluência é de pelo menos 50% Não mude a mídia durante as primeiras 72 horas. As células RPE isoladas usando este protocolo mostraram o tamanho típico de RPE, morfologia e pigmentação. Uma monocamada RPE altamente polarizada com dois núcleos unidos por junções apertadas, juntamente com a presença de microvilli apical e dobras basais, foi observada após uma semana.A polarização da monocamada RPE foi confirmada pelos valores ter, com a média superior a 200 centímetros quadrados, que se manteve estável ao longo do tempo. Em ensaios de fagocitose realizados no FITC rotulados pos bovinos, observou-se engolfação e digestão de PDV, indicando formação de uma monocamada confluente funcional de células RPE. Culturas viáveis requerem pouco tempo de dissecção, o que é alcançado com experiência.Algumas células RPE podem permanecer ligadas à retina neural, mas se várias folhas RPE permanecerem anexadas, o protocolo não terá sucesso. A hialuronidase fresca deve ser usada sempre para evitar este problema. Essas culturas funcionais de células RPE do rato primário são uma ferramenta valiosa para estudar a patobiologia do RPE em muitas doenças oculares.Por exemplo, este protocolo possibilitou estudar a pathobiologia do RPE em um modelo de camundongo de degeneração macular.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo de Cultura Primária células epiteliais trompa de Falópio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Biologia

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Perfis de expressão de microRNA iPS Human Cells, Retinal Pigment Epithelium Derivado de Ips, e Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Culturas de células primárias do Mouse epithelium Retinal do Pigment

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Cultura Primária de Células Epiteliais do Pigmento da Retina Suína

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Geração eficiente e consistente de epitélio/coroide de pigmento da retina a partir de olhos humanos para análise histológica

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...