Name: efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана Институтом глазной геномики в Массачусетсе глаз и ушей.

Были соблюдены руководящие принципы Заявления ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был доказан успешно с мышами различного генетического происхождения, включая C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c...

<ol>
	<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Konari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-retinal+barrier+in+vitro:+Formation+of+tight+junctions+as+revealed+by+occludin+and+ZO-1+correlates+with+the+barrier+function+of+chick+retinal+pigment+epithelial+cells.">Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells.</a> Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).</li><li>Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+protein+secretion+by+the+retinal+pigment+epithelium:+Roles+in+retinal+health+and+the+development+of+age-related+macular+degeneration.">Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).</li><li>Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+inflammatory+processes+in+drusen+formation+and+age+related+macular+degeneration.">Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+hypothesis+that+considers+drusen+as+biomarkers+of+immune-mediated+processes+at+the+RPE-Bruch's+membrane+interface+in+aging+and+age-related+macular+degeneration.">An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).</li><li>Lommatzsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+low+inflammatory+reactions+involved+in+exudative+age-related+macular+degeneration.">Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).</li><li>Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+creates+pro-angiogenic+environment+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+exposed+to+complement.">Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+local+complement+response+by+RPE+causes+early-stage+macular+degeneration.">A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).</li><li>Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+cause+RPE+cells+to+make+basal+deposits+and+activate+the+alternative+complement+pathway.">Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway.</a> Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+triggers+formation+of+sub-retinal+pigment+epithelium+deposits+via+the+ubiquitin+proteasome+pathway.">C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Farkas, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Pre-mRNA+processing+factors+3,+8,+and+31+cause+dysfunction+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).</li><li>Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Barrier+Properties+and+Inducible+VEGF+Expression+of+Several+Types+of+Retinal+Pigment+Epithelium+in+Medium-Term+Culture.">Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture.</a> Current Eye Research. 31, 739 (2006).</li><li>Sch&#252;tze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+findings+in+patients+with+albinism+using+wide-field+polarization-sensitive+optical+coherence+tomography.">Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography.</a> Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Garland, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetics+and+proteomic+analyses+demonstrate+a+critical+role+for+complement+in+a+model+of+DHRD/ML,+an+inherited+macular+degeneration.">Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R345W+mutation+in+EFEMP1+is+pathogenic+and+causes+AMD-like+deposits+in+mice.">The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice.</a> Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).</li><li>Greenwald, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+NMNAT1-Leber+Congenital+Amaurosis+(LCA9)+Recapitulate+Key+Features+of+the+Human+Disease.">Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).</li><li>Gupta, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ift172+conditional+knock-out+mice+exhibit+rapid+retinal+degeneration+and+protein+trafficking+defects.">Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects.</a> Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+promotes+morphogenesis+of+apical+microvilli+and+basal+infoldings+in+retinal+pigment+epithelium.">Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium.</a> Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).</li><li>Nandrot, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+synchronized+retinal+phagocytosis+and+age-related+blindness+in+mice+lacking+&#945;v&#946;5+integrin.">Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking &#945;v&#946;5 integrin.</a> Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology.">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Brydon, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Augmentation+Therapy+Restores+Critical+Functions+in+Mutant+PRPF31+/&#8722;+iPSC-Derived+RPE+Cells.">AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/&#8722; iPSC-Derived RPE Cells.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).</li><li>Bonilha, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+disease-related+structural+changes+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium.</a> Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).</li></ol>

Хотя несколько методов для мыши RPE изоляции клетоки культуры были разработаны до 1,13,20,22,26,27, Фернандес-Годино метод впервые используется мембрана вставки позволяет эффективного ?...

Этот протокол, который был первоначально сообщил Фернандес-Годино и др. в 2016году 1, описывает метод эффективно изолировать и культуры мыши сетчатки пигмент эпителия (RPE) клетки, которые образуют функциональный и поляризованный RPE монослой в течение одной недели на пластинах Transwell. RPE является монослой, расположенный в глазу между нервной сетчаткой и мембраной Бруха. Этот один слой состоит из сильно поляризованных и пигментированных эпителиальных клеток, к ним присоединяются плотные соединения, проявляли шестиугольную форму, напоминающуюсоты 2. Несмотря на эту кажущуюся гистологическую простоту, RPE выполняет широкий спектр функций, критически важных для сетчатки и нормальногозрительного цикла 2,3,4. Основными функциями монослой RPE являются поглощение света, питание и обновление фоторецепторов, удаление метаболических конечных продуктов, контроль ионного гомеостаза в подретинном пространстве и поддержание гемеконефалическогобарьера 2,3. RPE также играет важную роль в локальной модуляции иммуннойсистемы в глаза 5,6,7,8,9,10,11. Дегенерация и / или дисфункции RPE являются общими чертами разделяют многие глазные расстройства, такие как пигментный ретинит, Лебер врожденный амауроз, альбинизм, диабетическая ретинопатия, имакулярной дегенерации 12,13,14,15. К сожалению, доступность тканей человека ограничена. Учитывая их высоко сохранившейся генетической гомологии с людьми, мыши модели представляют собой подходящий и полезный инструмент для изучения глазных расстройств16,17,18,19. Кроме того, использование культурных первичных клеток RPE обеспечивает такие преимущества, как генетические манипуляции и тестирование на наркотики, которые могут ускорить разработку новыхметодов лечения этих опасных для зрения расстройств 9,11.
Существующие методы, доступные для изоляции мыши RPE и культуры, не воспроизводимы и не подысовыв RPE-функции in vivo с достаточной надежностью. Клетки, как правило, теряют пигментацию, шестиугольную форму и трансепителиальное электрическое сопротивление (TER) в течение несколькихдней в культуре 13,20. Поскольку создание этих основных культур rpE клеток от мышей является сложным процессом, этот оптимизированный протокол был создан на основе других протоколов, чтобы изолировать клетки RPE открыс и человеческих глаз 21,22,23, чтобы вскрыть глаза мыши, собирать RPE и культуры мыши RPE клеток в пробирке.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled micro forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 45&#176; Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 1mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1 MG</td>
			<td>Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Supplement 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-914B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 12-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell supports 6.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors 8cm long, stainless steel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>6780-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells

Нарушения глаз затрагивают миллионы людей во всем мире, но ограниченная доступность тканей человека препятствует их изучению. Мыши модели являются мощными инструментами для понимания патофизиологии глазных заболеваний из-за их сходства с анатомией человека и физиологии. Изменения в эпителии пигмента сетчатки (RPE), включая изменения в морфологии и функции, являются общими чертами, разделяемыми многими глазными расстройствами. Тем не менее, успешная изоляция и культура первичных клеток RPE мыши является очень сложной задачей. Данный документ представляет 100-ю аудиовизуальную версию протокола, ранее опубликованного Фернандесом-Годино и др. в 2016 году для эффективной изоляции и культуры первичных ячеек мыши RPE. Этот метод является весьма воспроизводимым и приводит к надежной культуры сильно поляризованных и пигментированных rpE монослой, которые могут быть сохранены в течение нескольких недель на Transwells. Эта модель открывает новые возможности для изучения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе заболеваний глаз. Кроме того, он предоставляет платформу для тестирования терапевтических подходов, которые могут быть использованы для лечения важных глазных заболеваний с неудовлетворенными медицинскими потребностями, включая наследственные расстройства сетчатки и макулярную дегенерацию.

Этот протокол был использован для изоляции и культуры RPE клеток от генетически модифицированных мышей1. Различий между штаммами мышей или полом не наблюдалось. Результаты помогли понять некоторые важные аспекты механизма, лежащие в основе глазных заболеваний, таких как во...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Этот протокол, который был первоначально сообщил Фернандес-Годино и др. в 2016году 1, описывает метод эффективной изоляции и культуры мыши RPE клетки, которые образуют функциональные и поляризованные RPE монослой в течение одной недели на пластинах Transwell. Процедура занимает около 3 часов.

Эффективное рассечение и культура первичной мыши сетчатки Пигмент эпителиальных клеток

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Этот протокол обеспечивает эффективную изоляцию и культуру клеток RPE мыши. Здоровые первичные культуры RPE мыши являются ценными моделями для понимания механизмов основных заболеваний глаз. Слияние и жизнеспособные культуры RPE получить в течение трех дней и могут быть выращены в течение нескольких недель.Этот протокол был успешно использован для понимания механизмов, лежащих в основе ранней возрастной макулярной дегенерации, которая является основной причиной слепоты среди пожилых людей в развитых странах. Важно визуализировать шаги вскрытия. Детали имеют решающее значение для успеха протокола, например, как обращаться с глазными яблоками, так что склера не ударил, где именно сокращения должны быть выполнены, и как вставлять чашки глаз в трипсин, чтобы они остаются открытыми.Начните с подготовки всех необходимых реагентов для протокола. Затем начните очистку глазного яблока, тщательно удаляя все соединительной ткани, крови и мышц, используя Дюмон номер пять типсов и угловые ножницы, не делая никаких порезов в склере. Передача глазного яблока на свежее блюдо, содержащее три миллилитров буфера HBSS без HEPES, чтобы держать глаз свежим и чистым и избежать загрязнения.Используйте зрительный нерв в качестве ручки, чтобы держать глазное яблоко и сделать отверстие в центре роговицы с острым лезвием стали углерода 11. Сделайте три разреза роговицы через отверстие с дюмоном номер пять ножницами, гарантируя, что есть достаточно места, чтобы удалить объектив. Держите зрительный нерв и применить небольшое давление на ора серрата с основанием угловых ножниц, пока объектив выходит полностью.Держите эпителий радужной оболочки нетронутыми, чтобы предотвратить отслоение нервной сетчатки и RPE во время инкубации. Поместите глаз в буфер HBSS без HEPES. Инкубировать глаза без линз в растворе гиалуронидазы при 37 градусах по Цельсию в течение 45 минут в 5%-х углекислом газе аэрированном инкубаторе, чтобы отделить нервную сетчатку от RPE.Поместите каждый глаз в новую колодец с 1,5 миллилитров холодного буфера HBSS HEPES на колодец и инкубировать его на льду в течение 30 минут. После мытья поместите каждый глаз в 35-миллиметровое блюдо культуры со свежим буфером HBSS HEPES. Вырезать роговицу через оригинальные разрезы с восьми сантиметров Vannas ножницами, пока ора серрата не будет достигнута, а затем сократить ниже ора серрата, чтобы удалить эпителий радужной оболочки глаза и роговицы.Держите серрату оры изогнутыми пинцетами и используя угловые микротяги, ототяните нервную сетчатку, убедившись, что слой RPE не разрезан. Затем, сократить внутреннее присоединение к зрительного нерва. Вырезать зрительный нерв и передать каждый глаз чашку на различные 12 хорошо пластины, содержащей 1,5 миллилитров свежего трипсина-ЭДТА на колодец.Убедитесь, что глаз чашки остаются открытыми и полностью погружены в трипсин. Инкубировать чашки для глаз при 37 градусах по Цельсию в течение 45 минут в инкубаторе с 5%-ным углекислым газом. Соберите каждую чашку глаза вместе с любыми листами RPE, отделенными во время инкубации трипсина, и перенесите их в 12 хорошо пластин, содержащих 1,5 миллилитров раствора FBS на колодец.Если листы RPE остаются в растворе трипсина, используйте микропайпетт для передачи их в колодец с раствором FBS. Держите каждую чашку глаза зрительным нервом и встряхните ее лицом вниз в 12 хорошо пластины, содержащей 1,5 миллилитров 20%FBS в буфере HBSS HEPES до полного отслоения листов RPE достигается. Соберите любые листы RPE и кластеры RPE с помощью микропипетта, избегая любых белых кусочков склеры или хороида, которые могут загрязнять культуры, и поместить их в 15 миллилитровую трубку.Вытяните два глаза от одной и той же мыши в одной трубке. Затем центрифуга смеси RPE при температуре 340 х г в течение двух минут при комнатной температуре и отбросить супернатант. Аккуратно повторно посвоить гранулы RPE в одной миллилитровой смеси 0,25%трипсина-ЭДТА и инкубировать его в течение одной минуты в водяной бане при 37 градусах по Цельсию, чтобы дезагрегировать листы RPE в одиночные клетки.Затем аккуратно пипетки вверх и вниз 10 раз, избегая образования пузырьков. Добавьте девять миллилитров свежеприготовленной среды RPE, чтобы разбавить и инактивировать трипсин и центрифугу смеси при температуре 340 х г в течение двух минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант и тщательно повторно помыть клеточные гранулы в 150 микролитров RPE среды с 5%FBS.Затем удалите PBS из нижней камеры ранее подготовленной мембранной вставки с покрытием ламинина и добавьте к ней 700 микролитров среды RPE. Удалите ламинин из верхней камеры мембранной вставки и распредельте подвеску RPE-клетки капли-мудрый и равномерно к центру камеры. Поместите мембрану вставить спокойно в 5%carbon dioxide инкубатор при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере 24 часов.Затем проверьте мембранную вставку под микроскопом, чтобы убедиться, что большинство клеток RPE прикреплены к вставке и слияние, по крайней мере 50%Не меняйте средства массовой информации в течение первых 72 часов. RpE клетки изолированы с помощью этого протокола показали типичный размер RPE, морфология, и пигментации. Через неделю наблюдался высокополяризованный монослой RPE с двумя ядрами, соединенными плотными соединениями, а также наличием апических микровилли и базальных вложения.Поляризация монослой RPE была подтверждена значениями TER, при этом средний показатель был выше 200 охм сем в квадрате, который оставался стабильным с течением времени. При фагоцитозных анализах, выполненных на FITC с маркировкой крупного рогатого скота POS, наблюдалось поглощение и переваривание POS, что указывает на образование функционального стечения монослоя клеток RPE. Жизнеспособные культуры требуют короткого времени вскрытия, которое достигается с опытом.Некоторые клетки RPE могут оставаться прикрепленными к нервной сетчатке, но если несколько листов RPE остаются прикрепленными, протокол не увенчается успехом. Свежие гиалуронидазы должны быть использованы каждый раз, чтобы предотвратить эту проблему. Эти функциональные первичные культуры клеток мыши RPE являются ценным инструментом для изучения патобиологии RPE во многих глазных заболеваний.Например, этот протокол дал возможность изучить патобиологию RPE в мышиной модели макулярной дегенерации.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Экс Vivo культуры первичных человеческих маточных труб эпителиальных клеток

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Профили микроРНК выражение человеческой плюрипотентных клеток, пигментного эпителия сетчатки, полученных из IPS, и плода пигментного эпителия сетчатки

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Субретинальное трансплантации эмбриональных стволовых клеток человека производные сетчатки пигментного эпителиальных клеток в большой eyed модель географической атрофии

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Культуры главной ячейки от мыши пигментный эпителий сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Выделение, культивация и генная инженерия первичных пигментных эпителиальных клеток млекопитающих для невирусной генной терапии

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Первичная культура пигментных эпителиальных клеток свиньи свиней

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Выделение первичных пигментированных клеток эпителия сетчатки мыши

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Эффективная и последовательная генерация пигментных эпителиев сетчатки / плоских гор сосудистой оболочки из глаз человека для гистологического анализа

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...