Name: efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Ocular Genomics Institute vid Massachusetts Eye and Ear.

Riktlinjerna i ARVO:s uttalande om användning av djur inom oftalmisk forskning och synforskning följdes.
OBS: Denna metod har visat sig framgångsrik med möss med olika genetisk bakgrund, inklusive C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ och albino möss, i olika åldrar. Använd helst 8 till 12 veckor gamla möss för att få RPE-celler. RPE-celler från äldre möss förökar sig mindre i kulturen och yngre möss har färre och mindre celler, vilket kräver...

<ol>
	<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Konari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-retinal+barrier+in+vitro:+Formation+of+tight+junctions+as+revealed+by+occludin+and+ZO-1+correlates+with+the+barrier+function+of+chick+retinal+pigment+epithelial+cells.">Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells.</a> Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).</li><li>Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+protein+secretion+by+the+retinal+pigment+epithelium:+Roles+in+retinal+health+and+the+development+of+age-related+macular+degeneration.">Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).</li><li>Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+inflammatory+processes+in+drusen+formation+and+age+related+macular+degeneration.">Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+hypothesis+that+considers+drusen+as+biomarkers+of+immune-mediated+processes+at+the+RPE-Bruch's+membrane+interface+in+aging+and+age-related+macular+degeneration.">An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).</li><li>Lommatzsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+low+inflammatory+reactions+involved+in+exudative+age-related+macular+degeneration.">Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).</li><li>Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+creates+pro-angiogenic+environment+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+exposed+to+complement.">Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+local+complement+response+by+RPE+causes+early-stage+macular+degeneration.">A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).</li><li>Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+cause+RPE+cells+to+make+basal+deposits+and+activate+the+alternative+complement+pathway.">Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway.</a> Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+triggers+formation+of+sub-retinal+pigment+epithelium+deposits+via+the+ubiquitin+proteasome+pathway.">C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Farkas, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Pre-mRNA+processing+factors+3,+8,+and+31+cause+dysfunction+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).</li><li>Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Barrier+Properties+and+Inducible+VEGF+Expression+of+Several+Types+of+Retinal+Pigment+Epithelium+in+Medium-Term+Culture.">Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture.</a> Current Eye Research. 31, 739 (2006).</li><li>Sch&#252;tze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+findings+in+patients+with+albinism+using+wide-field+polarization-sensitive+optical+coherence+tomography.">Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography.</a> Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Garland, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetics+and+proteomic+analyses+demonstrate+a+critical+role+for+complement+in+a+model+of+DHRD/ML,+an+inherited+macular+degeneration.">Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R345W+mutation+in+EFEMP1+is+pathogenic+and+causes+AMD-like+deposits+in+mice.">The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice.</a> Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).</li><li>Greenwald, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+NMNAT1-Leber+Congenital+Amaurosis+(LCA9)+Recapitulate+Key+Features+of+the+Human+Disease.">Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).</li><li>Gupta, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ift172+conditional+knock-out+mice+exhibit+rapid+retinal+degeneration+and+protein+trafficking+defects.">Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects.</a> Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+promotes+morphogenesis+of+apical+microvilli+and+basal+infoldings+in+retinal+pigment+epithelium.">Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium.</a> Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).</li><li>Nandrot, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+synchronized+retinal+phagocytosis+and+age-related+blindness+in+mice+lacking+&#945;v&#946;5+integrin.">Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking &#945;v&#946;5 integrin.</a> Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology.">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Brydon, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Augmentation+Therapy+Restores+Critical+Functions+in+Mutant+PRPF31+/&#8722;+iPSC-Derived+RPE+Cells.">AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/&#8722; iPSC-Derived RPE Cells.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).</li><li>Bonilha, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+disease-related+structural+changes+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium.</a> Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).</li></ol>

Medan flera metoder för mus RPE cell isolering och kultur hade utvecklatsföre 1,13,20,22,26,27, Fernandez-Godino metod först används membraninsatser som möjliggör effektiv tillväxt av RPE-cellerna i kultur i veckor1,9. En annan stor förändring i deras protoko...

Detta protokoll, som ursprungligen rapporterades av Fernandez-Godino et al. 20161, beskriver en metod för att effektivt isolera och odla mus näthinnepigmentepiteler (RPE) celler, som bildar en funktionell och polariserad RPE monolayer inom en vecka på Transwell plattor. RPE är ett monoskikt som ligger i ögat mellan neurala näthinnan och Bruchs membran. Detta enda lager består av mycket polariserade och pigmenterade epitelceller förenade av snäva korsningar, som uppvisar en sexkantig form som liknar enbikake 2. Trots denna uppenbara histologiska enkelhet utför RPE en mängd olika funktioner som är kritiska för näthinnan och den normala visuella cykeln2,3,4. RPE-monoskiktets huvudfunktioner inkluderar ljusabsorption, näring och förnyelse av fotoreceptorer, avlägsnande av metabola slutprodukter, kontroll av jonhomeostas i subretinalutrymmet och underhåll av blodretinalbarriären2,3. RPE har också en viktig roll i lokal modulering av immunsystemet i ögat5,6,7,8,9,10,11. Degeneration och/eller dysfunktion av RPE är vanliga funktioner som delas av många okulär störningar såsom retinitis pigmentosa, Leber medfödd amauris, albinism, diabetiker retinopati och makuladegeneration12,13,14,15. Tyvärr är tillgången på mänskliga vävnader begränsad. Med tanke på deras mycket bevarade genetiska homologi med människor representerar musmodeller ett lämpligt och användbart verktyg för att studera okulär störningar16,17,18,19. Dessutom ger användningen av odlade primära RPE-celler fördelar som genetisk manipulation och läkemedelstestning som kan påskynda utvecklingen av nya terapier för dessa synhotande sjukdomar9,11.
Befintliga metoder för mus RPE-isolering och kultur saknar reproducerbart och rekapitulerar inte RPE-funktionerna in vivo med tillräcklig tillförlitlighet. Celler tenderar att förlora pigmentering, sexkantig form och transepithelial elektrisk resistans (TER) inom några dagar i kultur13,20. Sedan dessa primära RPE-cellkulturer från möss etableras är en utmanande process, har detta optimerade protokoll skapats baserat på andra protokoll för att isolera RPE-celler från råtta och mänskliga ögon21,22,23 för att dissekera musögonen, samla RPE och odla musens RPE-celler in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled micro forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 45&#176; Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 1mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1 MG</td>
			<td>Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Supplement 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-914B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 12-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell supports 6.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors 8cm long, stainless steel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>6780-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells

Ögonsjukdomar påverkar miljontals människor över hela världen, men den begränsade tillgången på mänskliga vävnader hindrar deras studie. Musmodeller är kraftfulla verktyg för att förstå patofysiologin hos okulärsjukdomar på grund av deras likheter med mänsklig anatomi och fysiologi. Förändringar i retinal pigment epitel (RPE), inklusive förändringar i morfologi och funktion, är vanliga funktioner som delas av många okulär störningar. Framgångsrik isolering och kultur av primära mus RPE-celler är dock mycket utmanande. Detta dokument är en uppdaterad audiovisuell version av protokollet som tidigare publicerades av Fernandez-Godino m.fl. 2016 för att effektivt isolera och odla primära mus RPE-celler. Denna metod är mycket reproducerbar och resulterar i robusta kulturer av högpolariserade och pigmenterade RPE monolager som kan bibehållas i flera veckor på Transwells. Denna modell öppnar nya vägar för studier av de molekylära och cellulära mekanismerna bakom ögonsjukdomar. Dessutom ger det en plattform för att testa terapeutiska metoder som kan användas för att behandla viktiga ögonsjukdomar med ouppfyllda medicinska behov, inklusive ärvda näthinnesjukdomar och makuladegenerationer.

Detta protokoll har använts för att isolera och odla RPE-celler från genetiskt modifierade möss1. Inga skillnader har observerats mellan musstammar eller kön. Resultaten har bidragit till att förstå några viktiga aspekter av mekanismen bakom okulär sjukdomar såsom åldersrelaterad makuladegeneration, som är den vanligaste orsaken till synförlust bland äldre9. RPE celler isolerade efter detta protokoll var helt bifogas membranet infoga 24 timmar efter sådd och ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Detta protokoll, som ursprungligen rapporterades av Fernandez-Godino et al. 20161, beskriver en metod för att effektivt isolera och odla mus RPE-celler, som bildar en funktionell och polariserad RPE monolayer inom en vecka på Transwell-plattor. Proceduren tar cirka 3 timmar.

Effektiv dissekering och kultur av primära mus retinal pigment epitelceller

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Detta protokoll möjliggör effektiv isolering och odling av musens RPE-celler. Friska primära mus RPE kulturer är värdefulla modeller för att förstå mekanismerna för underliggande ögonsjukdomar. Konfluenta och livskraftiga RPE-kulturer erhåller inom tre dagar och kan odlas i veckor.Detta protokoll har framgångsrikt använts för att förstå mekanismerna bakom tidig åldersrelaterad makuladegeneration, som är den främsta orsaken till blindhet bland äldre i utvecklade länder. Det är viktigt att visualisera dissekeringsstegen. Detaljer är avgörande för protokollets framgång, till exempel hur man hanterar ögongloberna så att sclera inte stansas, var exakt skärsår ska utföras och hur man bäddar in ögonkopparna i trypsin så att de håller öppet.Börja med att förbereda alla nödvändiga reagenser för protokollet. Börja sedan rengöra ögongloben genom att försiktigt ta bort all bindväv, blod och muskler, med Dumont nummer fem tång och vinklad sax, utan att göra några nedskärningar i sclera. Överför ögongloben till en färsk skål som innehåller tre milliliter HEPES-fri HBSS-buffert regelbundet för att hålla ögat friskt och rent och undvika kontaminering.Använd synnerven som handtag för att hålla ögongloben och göra ett hål i mitten av hornhinnan med ett skarpt kolstål nummer 11 blad. Gör tre snitt i hornhinnan genom hålet med Dumont nummer fem sax, vilket säkerställer att det finns tillräckligt med utrymme för att ta bort linsen. Håll den optiska nerven och tryck lätt på ora serratan med basen av den vinklade saxen tills linsen kommer ut helt.Håll iris epitel intakt för att förhindra avlossning av neurala näthinnan och RPE under inkubation. Placera ögat i HEPES-fri HBSS-buffert. Inkubera ögonen utan linser i hyaluronidaselösning vid 37 grader Celsius i 45 minuter i en 5%koldioxidsyrad inkubator för att lossa neurala näthinnan från RPE.Placera varje öga i en ny brunn med 1,5 milliliter kall HBSS HEPES-buffert per brunn och inkubera den på is i 30 minuter. Efter tvätt, placera varje öga i en 35 millimeters odlingsskål med färsk HBSS HEPES-buffert. Skär hornhinnan genom de ursprungliga snitten med åtta centimeter Vannas sax tills ora serrata nås och skär sedan under ora serrata för att ta bort iris epitel och hornhinna.Håll ora serrata med böjda pincett och använd vinklade mikro tångar, dra bort neurala näthinnan och se till att RPE-skiktet inte skärs. Skär sedan den inre fästanordningen på synnerven. Skär synnerven och överför varje ögonkopp till en annan 12 brunnsplatta som innehåller 1,5 milliliter färsk trypsin-EDTA per brunn.Se till att ögonkopparna förblir öppna och helt nedsänkta i trypsin. Inkubera ögonkopparna vid 37 grader Celsius i 45 minuter i en 5%koldioxidinkubator. Samla varje ögonkopp tillsammans med eventuella RPE-ark som lossnar under trypsininkubationen och överför dem till en 12-brunnsplatta som innehåller 1,5 milliliter FBS-lösning per brunn.Om RPE-ark finns kvar i trypsinlösningen, använd en mikropipett för att överföra dem till brunnen med FBS-lösning. Håll varje ögonkopp av synnerven och skaka den med ansiktet nedåt i 12-brunnsplattan som innehåller 1,5 milliliter 20%FBS i HBSS HEPES-bufferten tills fullständig lossning av RPE-arken uppnås. Samla alla RPE-ark och RPE-kluster med en mikropipett, undvik vita bitar av sclera eller choroid, som kan förorena kulturerna och placera dem i ett 15 milliliter rör.Dra två ögon från samma mus i ett rör. Centrifugera sedan RPE-blandningen vid 340 x g i två minuter vid rumstemperatur och kassera supernaten. Återanvänd försiktigt RPE-pelleten i en milliliterblandning på 0,25% trypsin-EDTA och inkubera den i en minut i ett vattenbad vid 37 grader Celsius för att dela upp RPE-arken i enstaka celler.Rör sedan försiktigt upp och ner 10 gånger, vilket undviker bubbelbildning. Tillsätt nio milliliter nyberedd RPE-medium för att späda ut och inaktivera trypsin och centrifugera blandningen vid 340 x g i två minuter vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten och återanvänd försiktigt cellpelleten i 150 mikroliter RPE-medium med 5%FBS.Ta sedan bort PBS från bottenkammaren i den tidigare beredda lamininbelagda membraninsatsen och tillsätt 700 mikroliter RPE-medium till den. Ta bort laminin från membranets övre kammare och fördela RPE-cellupphängningen droppvis och jämnt till mitten av kammaren. Placera membraninsatsen ostört i en 5%koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius i minst 24 timmar.Kontrollera sedan membraninsatsen under mikroskopet för att se till att de flesta RPE-celler är fästa vid insatsen och att sammanflödet är minst 50 %Ändra inte mediet under de första 72 timmarna. RPE celler isolerade med hjälp av detta protokoll visade den typiska RPE storlek, morfologi och pigmentering. En högpolariserad RPE monolayer med två atomkärnor förenade av snäva korsningar, tillsammans med förekomsten av apical microvilli och basala infoldings, observerades efter en vecka.Polarisering av RPE monolayer bekräftades av TER värden, med genomsnittet högre än 200 ohms centimeter kvadratiska, som förblev stabil över tiden. I faagocytos analyser utförs på FITC märkt nötkreatur POS observerades uppslukning och matsmältning av POS, vilket indikerar bildandet av en funktionell sammanflöde monolayer av RPE celler. Livskraftiga kulturer kräver kort dissekeringstid, vilket uppnås med erfarenhet.Vissa RPE-celler kan förbli kopplade till neurala näthinnan, men om flera RPE-ark förblir kopplade kommer protokollet inte att lyckas. Färsk hyaluronidase måste användas varje gång för att förhindra detta problem. Dessa funktionella primära mus RPE cell kulturer är ett värdefullt verktyg för att studera patobiologin hos RPE i många ögonsjukdomar.Detta protokoll gjorde det till exempel möjligt att studera RPE: s patobiologi i en musmodell av makuladegeneration.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex vivo Kultur av primära humana äggledaren epitelceller

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MikroRNA Expression Profiler av Human iPS-celler, pigmentepitelet härledas från iPS, och Fetal pigmentepitelet

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal Transplantation av mänskliga embryonala stamceller härstammar-retinal Pigment epitelial celler till en stor-eyed modell av geografisk atrofi

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primära cellkulturer från mus Retinal pigmentepitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Isolering, kultur och genteknik av däggdjurs primära pigment epitelceller för icke-viral genterapi

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primär odling av svin retinala pigmentepitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolering av primära musretinala pigmenterade epitelceller

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Effektiv och konsekvent generering av retinal pigmentepitel / choroid flatmounts från mänskliga ögon för histologisk analys

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...