Name: efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Bu çalışma Massachusetts Eye and Ear'deki Oküler Genomik Enstitüsü tarafından desteklendi.

ARVO Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin Bildiri'nin yönergelerine uyuldu.
NOT: Bu yöntemin C57BL/6J, B10 dahil olmak üzere farklı genetik geçmişlere sahip farelerde başarılı olduğu kanıtlanmıştır. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ ve albino fareler, çeşitli yaşlarda. Tercihen RPE hücreleri elde etmek için 8 ila 12 haftalık fareler kullanın. Yaşlı farelerden gelen RPE hücreleri kültürde daha az çoğalır ...

<ol>
	<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Konari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-retinal+barrier+in+vitro:+Formation+of+tight+junctions+as+revealed+by+occludin+and+ZO-1+correlates+with+the+barrier+function+of+chick+retinal+pigment+epithelial+cells.">Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells.</a> Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).</li><li>Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+protein+secretion+by+the+retinal+pigment+epithelium:+Roles+in+retinal+health+and+the+development+of+age-related+macular+degeneration.">Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).</li><li>Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+inflammatory+processes+in+drusen+formation+and+age+related+macular+degeneration.">Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+hypothesis+that+considers+drusen+as+biomarkers+of+immune-mediated+processes+at+the+RPE-Bruch's+membrane+interface+in+aging+and+age-related+macular+degeneration.">An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).</li><li>Lommatzsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+low+inflammatory+reactions+involved+in+exudative+age-related+macular+degeneration.">Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).</li><li>Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+creates+pro-angiogenic+environment+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+exposed+to+complement.">Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+local+complement+response+by+RPE+causes+early-stage+macular+degeneration.">A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).</li><li>Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+extracellular+matrix+cause+RPE+cells+to+make+basal+deposits+and+activate+the+alternative+complement+pathway.">Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway.</a> Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+triggers+formation+of+sub-retinal+pigment+epithelium+deposits+via+the+ubiquitin+proteasome+pathway.">C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Farkas, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Pre-mRNA+processing+factors+3,+8,+and+31+cause+dysfunction+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).</li><li>Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Barrier+Properties+and+Inducible+VEGF+Expression+of+Several+Types+of+Retinal+Pigment+Epithelium+in+Medium-Term+Culture.">Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture.</a> Current Eye Research. 31, 739 (2006).</li><li>Sch&#252;tze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+findings+in+patients+with+albinism+using+wide-field+polarization-sensitive+optical+coherence+tomography.">Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography.</a> Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Garland, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetics+and+proteomic+analyses+demonstrate+a+critical+role+for+complement+in+a+model+of+DHRD/ML,+an+inherited+macular+degeneration.">Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R345W+mutation+in+EFEMP1+is+pathogenic+and+causes+AMD-like+deposits+in+mice.">The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice.</a> Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).</li><li>Greenwald, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+NMNAT1-Leber+Congenital+Amaurosis+(LCA9)+Recapitulate+Key+Features+of+the+Human+Disease.">Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).</li><li>Gupta, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ift172+conditional+knock-out+mice+exhibit+rapid+retinal+degeneration+and+protein+trafficking+defects.">Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects.</a> Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li><li>Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+promotes+morphogenesis+of+apical+microvilli+and+basal+infoldings+in+retinal+pigment+epithelium.">Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium.</a> Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).</li><li>Nandrot, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+synchronized+retinal+phagocytosis+and+age-related+blindness+in+mice+lacking+&#945;v&#946;5+integrin.">Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking &#945;v&#946;5 integrin.</a> Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology.">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Brydon, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Augmentation+Therapy+Restores+Critical+Functions+in+Mutant+PRPF31+/&#8722;+iPSC-Derived+RPE+Cells.">AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/&#8722; iPSC-Derived RPE Cells.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).</li><li>Bonilha, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+disease-related+structural+changes+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium.</a> Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).</li></ol>

Fare RPE hücre izolasyonu ve kültürü için çeşitli yöntemler 1 ,13,20,22,26,27' den önce geliştirilmişken, Fernandez-Godino'nun yöntemi ilk olarak RPE hücrelerinin kültürde haftalarca verimli büyümesine izin sağlayan membran kesici uçları kullandı1,9.</s...

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde fonksiyonel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare retina pigment epitel (RPE) hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntemi açıklar. RPE, nöral retina ile Bruch zarı arasında bulunan bir monolayerdir. Bu tek katman, bir petek2'yebenzeyen altıgen bir şekil sergileyen sıkı kavşaklarla birleştirilen son derece polarize ve pigmentli epitel hücrelerinden oluşur. Bu belirgin histolojik basitliğe rağmen, RPE retina ve normal görme döngüsü 2 ,3,4için kritik olan çok çeşitli işlevleri yerine getirir. RPE monolayer'ın ana işlevleri arasında ışık emilimi, fotoreceptörlerin beslenmesi ve yenilenmesi, metabolik uç ürünlerin çıkarılması, altretinal alanda iyon homeostazının kontrolü ve kan-retina bariyerinin bakımı2,3. RPE ayrıca göz 5 , 6 ,7,8,9,10,11bağışıklık sisteminin lokal modülasyonunda önemli bir role sahiptir. RPE'nin dejenerasyonu ve/veya işlev bozukluğu, retinitis pigmentosa, Leber konjenital amaurosis, albinizm, diyabetik retinopati ve makula dejenerasyonu12 , 13,14,15gibi birçok oküler bozukluk tarafından paylaşılan yaygın özelliklerdir. Ne yazık ki, insan dokularının mevcudiyeti sınırlıdır. İnsanlarla yüksek oranda korunmuş genetik homolojileri göz önüne alındığında, fare modelleri oküler bozuklukları incelemek için uygun ve yararlı bir aracı temsil eder16,17,18,19. Ayrıca, kültürlü birincil RPE hücrelerinin kullanımı, bu görme tehdit eden bozukluklar için yeni tedavilerin gelişimini hızlandırabilecek genetik manipülasyon ve ilaç testi gibi avantajlar sağlar9,11.
Fare RPE yalıtımı ve kültürü için mevcut yöntemler tekrarlanabilir bir şekilde eksiktir ve RPE özelliklerini in vivo olarak yeterli güvenilirlikle yeniden yakalamaz. Hücreler pigmentasyon, altıgen şekil ve transepithelial elektrik direncini (TER) kültürde birkaç gün içinde kaybetme eğilimindedir13,20. Bu birincil RPE hücre kültürlerini farelerden oluşturmak zor bir süreç olduğundan, bu optimize edilmiş protokol, fare gözlerini parçalamak, RPE'yi toplamak ve fareRPEhücrelerini in vitro olarak kültüre etmek içinRPE hücrelerini sıçan ve insan gözlerinden izole etmek için diğer protokollere dayanarak oluşturulmuştur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled micro forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 45&#176; Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Heat inactivated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin 1mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020-1 MG</td>
			<td>Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Supplement 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-914B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 12-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell supports 6.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors 8cm long, stainless steel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>6780-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient dissection and culture of primary mouse retinal pigment epithelial cells

Göz bozuklukları dünya çapında milyonlarca insanı etkiler, ancak insan dokularının sınırlı mevcudiyeti çalışmalarını engeller. Fare modelleri, insan anatomisi ve fizyolojisi ile benzerlikleri nedeniyle oküler hastalıkların patofizyolojisini anlamak için güçlü araçlardır. Morfoloji ve fonksiyon değişiklikleri de dahil olmak üzere retina pigment epitelindeki (RPE) değişiklikler, birçok oküler bozukluk tarafından paylaşılan yaygın özelliklerdir. Bununla birlikte, birincil fare RPE hücrelerinin başarılı izolasyonu ve kültürü çok zordur. Bu makale, birincil fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için daha önce Fernandez-Godino ve arkadaşları tarafından 2016'da yayınlanan protokolün güncellenmiş bir görsel-işitsel sürümüdür. Bu yöntem son derece tekrarlanabilir ve Transwells'te birkaç hafta boyunca sürdürülebilen yüksek polarize ve pigmentli RPE monolayerlerinin sağlam kültürleriyle sonuçlanır. Bu model, göz hastalıklarının altında kalan moleküler ve hücresel mekanizmaların incelenmesi için yeni yollar açmaktadır. Ayrıca, kalıtsal retina bozuklukları ve makula dejenerasyonları da dahil olmak üzere karşılanmamış tıbbi ihtiyaçları olan önemli göz hastalıklarını tedavi etmek için kullanılabilecek terapötik yaklaşımları test etmek için bir platform sağlar.

Bu protokol, RPE hücrelerini genetiği değiştirilmiş farelerden izole etmek ve kültüre etmek için kullanılmıştır1. Fare suşları veya cinsiyet arasında herhangi bir fark gözlenmemiştir. Sonuçlar, yaşlılar arasında görme kaybının en yaygın nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi oküler hastalıkların altında kalan mekanizmanın bazı önemli yönlerinin anlaşılmasına yardımcı oldu9. Bu protokolden sonra izole edilen RPE hücreleri, ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Bu protokol, fare RPE hücrelerinin verimli bir şekilde yalıtılıp kültüre sahip olduğunu sağlar. Sağlıklı birincil fare RPE kültürleri, alttaki göz hastalıklarının mekanizmalarını anlamak için değerli modellerdir. Birleştiğinde ve uygulanabilir RPE kültürleri üç gün içinde elde edilir ve haftalarca yetiştirilebilir.Bu protokol, gelişmiş ülkelerde yaşlılar arasında körlüğün önde gelen nedeni olan erken yaşa bağlı makula dejenerasyonu altında kalan mekanizmaları anlamak için başarıyla kullanılmıştır. Diseksiyon adımlarını görselleştirmek önemlidir. Ayrıntılar protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir, örneğin skleranın yumruklanmaması için göz kürelerinin nasıl ele alınacağı, tam olarak nerede kesiklerin yapılması gerektiği ve göz kapaklarının açık kalacak şekilde tripsin içine nasıl gömüleceği.Protokol için gerekli tüm reaktifleri hazırlamakla başlayın. Ardından, sklerada herhangi bir kesik yapmadan Dumont beş numaralı periptüs ve açılı makas kullanarak tüm bağ dokusunu, kanı ve kasları dikkatlice çıkararak göz küresini temizlemeye başlayın. Gözü temiz ve temiz tutmak ve herhangi bir kirlenmeyi önlemek için göz küresini düzenli olarak üç mililitre HEPES içermeyen HBSS tamponu içeren taze bir tabağa aktarın.Optik siniri göz küresini tutmak ve korneanın ortasında 11 numaralı keskin bir karbon çeliği ile bir delik açmak için bir tutamak olarak kullanın. Korneada dumont beş numaralı makasla delikten üç kesi yaparak lensi çıkarmak için yeterli alan olmasını sağlayın. Optik siniri tutun ve lens tamamen çıkana kadar açılı makasın tabanı ile ora serrataya hafif basınç uygulayın.İnkübasyon sırasında nöral retina ve RPE'nin kopmasını önlemek için iris epitelini sağlam tutun. Gözü HEPES içermeyen HBSS tampona yerleştirin. Nöral retinayı RPE'den ayırmak için % 5 karbondioksit havalandırılmış inkübatörde 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede hyaluronidaz çözeltisinde lenssiz gözleri kuluçkaya yatırın.Her gözü kuyu başına 1,5 mililitre soğuk HBSS HEPES tamponu ile yeni bir kuyuya yerleştirin ve 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Yıkadıktan sonra, her gözü taze HBSS HEPES tamponu ile 35 milimetrelik bir kültür yemeğine yerleştirin. Korneayı ora serrata ulaşılana kadar sekiz santimetre Vannas makası ile orijinal kesilerden kesin, ardından iris epitelini ve korneayı çıkarmak için ora serratanın altında kesin.Ora serratayı kavisli cımbızla tutun ve açılı mikro önpsler kullanarak RPE tabakasının kesilmemesini sağlamak için sinir retinasını çekin. Daha sonra, optik sinire iç bağlanmayı kesin. Optik siniri kesin ve her göz kabını kuyu başına 1,5 mililitre taze tripsin-EDTA içeren farklı bir 12 kuyu plakasına aktarın.Göz kapaklarının açık kaldığından ve tripsin'e tamamen batırıldığından emin olun. %5 karbondioksit inkübatöründe göz kapaklarını 37 santigrat derecede 45 dakika kuluçkaya yatırın. Her göz kabını trypsin inkübasyonu sırasında ayrılan RPE levhalarla birlikte toplayın ve kuyu başına 1,5 mililitre FBS çözeltisi içeren 12 kuyu plakasına aktarın.RPE sayfaları tripsin çözeltisinde kalırsa, FBS çözümü ile kuyuya aktarmak için bir mikropipette kullanın. Her göz kabını optik sinirden tutun ve RPE levhalarının tamamen kopması elde edilene kadar HBSS HEPES tamponunda 1,5 mililitre%20 FBS içeren 12 kuyu plakasına yüzüstü sallayın. Kültürleri kirletebilecek beyaz sklera veya koroid parçalarından kaçınarak mikropipette ile herhangi bir RPE yaprağı ve RPE kümesi toplayın ve bunları 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.Bir tüpte aynı fareden iki göz çekin. Ardından, RPE karışımını oda sıcaklığında iki dakika boyunca 340 x g'da santrifüjleyin ve süpernatantı atın. RPE peletini%0,25 trypsin-EDTA'nın bir mililitre karışımında hafifçe yeniden biriktirin ve RPE yapraklarını tek hücrelere ayırmak için 37 santigrat derecede bir su banyosunda bir dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra kabarcık oluşumunu önleyerek 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipet. Trypsin'i seyreltmek ve devre dışı bırakmak ve karışımı oda sıcaklığında iki dakika boyunca 340 x g'da santrifüj etmek için dokuz mililitre taze hazırlanmış RPE ortamı ekleyin. Süpernatantı emiş edin ve hücre peletini %5 FBS ile 150 mikrolitre RPE ortamında dikkatlice yeniden ıslatın.Ardından, PBS'yi önceden hazırlanmış laminin kaplı membran kesici ucun alt haznesinden çıkarın ve içine 700 mikrolitre RPE ortamı ekleyin. Laminin'i membran kesici ucun üst odasından çıkarın ve RPE hücre süspansiyonunu damla açısından ve düzgün bir şekilde odanın ortasına dağıtın. Membran kesici ucu en az 24 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit inkübatörüne bozulmadan yerleştirin.Ardından, çoğu RPE hücresinin kesici uça bağlı olduğundan ve izdihamın en az%50 olduğundan emin olmak için mikroskop altındaki membran kesici ucu kontrol edin İlk 72 saat boyunca ortamı değiştirmeyin. Bu protokol kullanılarak yalıtılmış RPE hücreleri tipik RPE boyutunu, morfolojisini ve pigmentasyonunu gösterdi. Bir hafta sonra, apikal mikrovilli ve bazal infoldların varlığı ile birlikte sıkı kavşaklarla birleştirilen iki çekirdekli yüksek polarize bir RPE monolayer gözlendi.RPE monolayer'in polarizasyonu TER değerleri tarafından doğrulandı ve ortalama 200 ohms santimetre kareden daha yüksekti ve bu da zaman içinde sabit kaldı. FITC etiketli sığır POS'unda yapılan fagositoz tahlillerinde, RPE hücrelerinin fonksiyonel bir birleştiği monolayer oluşumuna işaret eden POS'un yutulduğu ve sindirilmesi gözlendi. Yaşanabilir kültürler, deneyimle elde edilen kısa diseksiyon süresi gerektirir.Bazı RPE hücreleri nöral retinaya bağlı kalabilir, ancak birkaç RPE sayfası takılı kalırsa, protokol başarılı olmaz. Bu sorunu önlemek için her zaman taze hyaluronidaz kullanılmalıdır. Bu fonksiyonel birincil fare RPE hücre kültürleri, birçok göz hastalığında RPE'nin patobiyolojisini incelemek için değerli bir araçtır.Örneğin, bu protokol, RPE'nin patobiyolojisini bir fare modeli olan makula dejenerasyonunda incelemeyi mümkün kıldı.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...