Name: activity of posterior lateral line afferent neurons during swimming in zebrafish
Uploaded: 2021-02-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish at JoVE.com

我们感谢国家卫生研究院（DC010809）、国家科学基金会（IOS1257150，1856237）和惠特尼海洋生物科学实验室对J.C.L的支持。我们要感谢廖实验室过去和现在的成员鼓励讨论。

所有动物护理和实验都是按照佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会批准的协议进行的。
1. 为电生理记录准备材料
<ol><li>制作硅胶弹性体底录音盘。<ol>
<li>将一层薄薄的自混合硅弹性体组件（如 Sylgard）放入盖玻璃底组织培养盘中，直到它与浅井的边缘水平。大约 0.5 mL 就足够了。</li>
		<li>在室温下将菜盖上并治愈至少48小时。</li>
	</ol></li>
	<li>制作解剖引脚。<ol>
<li>使用?...

描述的实验协议提供了在完整、行为良好的脊椎动物中监测运动行为感官输入的内源性变化的潜力。具体来说，它详细介绍了一种体内方法，用于同时执行横向线轴神经元和幼虫斑马鱼腹腔运动根部的细胞外记录。自发性活动以前在斑马鱼中具有特征，没有考虑到潜在的并发运动活动1、2、39、40、41。</sup...

机械感官系统的神经元在听觉和平衡过程中将信息从毛细胞传输到大脑。电子生理学可以通过直接记录揭示过敏神经元的敏感性。虽然从头发细胞的整个细胞修补可能具有挑战性，从下游的通风神经元记录更容易，并允许评估行动潜力，以响应受控刺激1，2，3。刺激头发细胞导致其偏转，从而改变机械感官结构，从而触发在无动于衷的神经元4，5，6的动作潜力（尖峰）增加。在没有外部刺激的情况下，由于谷氨酸从毛细胞泄漏到发精后7、8的终端，心酸神经元也会自发地尖峰，并被证明有助于保持敏感性9、10。贴片夹记录的通风活动，使观察头发细胞的敏感性和信号动力学，这是不可能使用技术与较低的时间分辨率，如在微音11，12或功能钙成像13，14，15。以下协议将允许记录与运动命令并存的无动于衷的活动，以显示毛细胞敏感性的瞬时变化。
斑马鱼（Danio rerio）使用神经瘤中所含的头发细胞组成横向线系统来检测相对于其身体的水运动，这些水体被转化为导航16、17、18、捕食者躲避、猎物捕获19、20和学校教育21所必需的神经信号。水流也可以由游泳22、23、24、呼吸22、25、26和喂食27的运动自行产生。这些行为包括重复运动，可以疲劳头发细胞和损害传感。因此，横向线系统必须区分外部（外向）和自生成（重现）流量刺激。在斑马鱼的运动过程中，必然放电会减弱自生成的流动信号。这种抑制性预测运动信号通过下降神经元传导到感官受体，以修改输入或中断处理再吸收反馈28，29。开创性的工作有助于我们早期了解这个馈送系统依赖于体外制备，其中神经回路的连接性和内源活动没有保持28，30，31，32，33，34，35。该协议描述了一种保存完整神经回路的方法，其中内源反馈动力学得以保持，从而能够更好地了解体内的必然放电。
此处概述的协议描述了如何同时监测幼虫斑马鱼的后横向线神经元和运动神经元活动。在运动指令之前、期间和之后对发光信号动态进行特征化，可深入了解中枢神经系统实时的内生反馈，这些反馈在运动过程中调节了毛细胞的敏感性。该协议概述了在实验前需要准备哪些材料，然后描述了如何瘫痪和准备斑马鱼幼虫。该协议将描述如何建立一个稳定的松散补丁记录的通风神经元和细胞外腹腔根（VR）记录的运动神经元。使用此协议可以获得的代表性数据来自一个范例个体，并针对实验协议的多个副本进行了分析。使用 MATLAB 中的自定义书面脚本对数据进行预处理。总的来说，这种体内实验范式有望在模型脊椎动物毛细胞系统中更好地了解运动过程中的感官反馈。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL beaker</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>1000</td>
			<td>resceptacle for etchant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10xW</td>
			<td>low magnification for positioning larvae and recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td>higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>abfload.m</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffVR_preprocess.m</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB script for preprocessing recording data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC coaxial cables</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>2249-C-12</td>
			<td>connecting amplifier and digitizer channels; require 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150F-3</td>
			<td>inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>burst_detect</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>any computer should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Power Supply</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>72-420</td>
			<td>used for electrically etching dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophysiology digitizer</td>
			<td>Axon Instruments, Molecular Devices</td>
			<td>Axon DigiData 1440A</td>
			<td>enables acquisition of patch-clamp data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>FB255B</td>
			<td>2.5 mm box filament used in micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>used to manipulate larvae and insert pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixed stage DIC microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible, tapered pipette tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-169</td>
			<td>flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.</td>
			<td>FD3510-100</td>
			<td>cover glass bottomed dish recording dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipe</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>task wipe used for wicking away excess fluid from larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Gard</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.</td>
			<td>710172</td>
			<td>self-mixing sylgard elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2020b</td>
			<td>command line software for preprocessing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microelectrode amplifier</td>
			<td>Axon Instruments, Molecular Devices</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>patch clamp amplifier for dual channel recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>to polish recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator control unit</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MC1000-eR/T</td>
			<td>4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td>for pulling capillary glass into recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope control unit</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MC1000e</td>
			<td>positions the microscope around the fixed stage and preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motorized micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MX7600</td>
			<td>positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp Commander</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>2.2.2</td>
			<td>downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical air table</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>VH3036W-OPT</td>
			<td>breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>10.7.0</td>
			<td>downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition &#38; Analysis Software Download page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>permanent ink marker</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>order from amazon.com</td>
			<td>for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri-dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35-3001</td>
			<td>used to immerse larvae in paralytic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td>hold recording electrode and connect to the headstage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pneumatic transducer</td>
			<td>Fluke Biomedical Instruments</td>
			<td>DPM1B</td>
			<td>for controlling recording electrode internal pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>etchant for etching dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>14-169-1A</td>
			<td>tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spike_detect</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td>used to visualize pin tips and during preparation of larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight edge razor blade</td>
			<td>Canopus</td>
			<td>order from amazon.com</td>
			<td>cuts the tungsten wire while making dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swimbout_detect</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Becton Dickinson Compoany</td>
			<td>309602</td>
			<td>filled with extracellular solution to inject into recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z135003-500EA</td>
			<td>single use, non-sterile pipette for transfering larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>12854</td>
			<td>pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tungsten wire</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.</td>
			<td>715500</td>
			<td>0.002 inch, 50.8 &#956;m diameter; used to make dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum filtration unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCGVU11RE</td>
			<td>single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>voltage-clamp current-clamp headstage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV-7B</td>
			<td>supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1601</td>
			<td>for immobilizing the larvae prior to recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activity of posterior lateral line afferent neurons during swimming in zebrafish

感官系统收集指导行为必不可少的线索，但动物必须破译哪些信息与生物学相关。运动产生重新获得线索，表明动物必须脱离周围环境的相关感官线索。例如，当鱼游泳时，由构成横向线系统的机械感应神经瘤（包括毛细胞）检测到身体起伏产生的流量。然后，毛细胞通过感官性神经元将流体运动信息从传感器传输到大脑。同时，电机指令的必然放电被传到毛细胞，以防止感官超载。因此，在评估横向线系统的灵敏度时，考虑运动过程中预测运动信号的抑制作用至关重要。我们已经开发出一种体内电生理学方法，可以同时监测斑马鱼幼虫（受精后4-7天）的后横向线轴神经元和腹腔运动根活动，这种活动可以持续几个小时。使用松散的贴片夹紧技术实现对有发声神经元的细胞外记录，该技术可以检测来自单个或多个神经元的活动。用玻璃电极通过皮肤进行心室根记录，以检测运动神经元活动。我们的实验协议提供了在完整、行为灵巧的脊椎动物中监测运动行为的内源性或唤起感官输入变化的潜力。

斑马鱼幼虫被正确固定，并实现后横向线腹膜和VR记录后，可以同时测量无光和运动神经元的活性。使用无间隙录制协议（第 1.4 步）显示录制通道，以持续监控通风和 VR 活动。实时地，可以观察到自发性尖峰率的降低与VR活动同时观察，指示虚构的游泳比赛（图1E）。我们发现，最佳结果和准确的峰值检测是记录产品，其信号与噪声比至少达到 0.5。自定义书面预处理脚本生...

Watch this Scientific Journal Video about Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish at JoVE.com

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

我们描述了一个协议，以监测在模型脊椎动物毛细胞系统运动命令期间的无动于衷的神经元活动的变化。

斑马鱼游泳期间后横向线阿弗伦特神经元的活动

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

该协议使研究人员能够监测单个感觉神经元在完整行为椎骨中对受控刺激的活动和反应。此贴片电生理学是实时记录单个神经元尖刺活性快速而直接的方法。这比大多数光学成像技术以更低的成本提供了更好的时间分辨率和灵敏度。横向线毛细胞与人类内耳的毛细胞同源。因此，这项技术有望揭示适用于人类耳聋和听力障碍的毛细胞回路的特性。电生理学是一种使用精细运动技能的工艺，需要观察和身体模仿。仅文本说明会留下太多的误解空间。首先，将一层薄薄的自混合硅胶弹性体（如 Sylgard）放入盖玻璃底组织培养盘中，制作硅胶弹性体底部记录盘。要进行解剖引脚，请使用直流电源向 Etchant 的 100 毫升烧嘴提供 5 伏的负电荷，并将钨丝连接到正电荷输出上。反复将电线尖浸入埃昌特浴缸中，直到尖端变窄到尖点。在立体显微镜下，用直边剃须刀刀片将电线从尖端切开约一毫米。重复三次，然后使用细钳将引脚插入固化的录音盘中。要准备录制电极，使用带盒长丝的微皮拉器拉动薄薄玻璃毛细管。电极应有一个直径为 30 微米的尖端，带有锥度，用于记录后横向线的通风神经元。将额外的薄氧玻璃毛细管拉入一对直径较小的一至五微米尖端的电极中。每只手握住一个电极，轻轻地将提示相互碾过，以打破提示。使用微型锻造机，抛光斜面尖端，直到光滑。最终尖端直径应在 30 至 50 微米之间。固定斑马鱼幼虫，并转移到35毫米的培养皿使用大尖转移移液器。尽可能多地删除周围的解决方案。将幼虫浸入10微升0.1%的α-邦加罗毒素中约5分钟。用细胞外溶液清洗瘫痪的幼虫10分钟。然后，使用转移移液器将幼虫从细胞外溶液浴转移到硅胶底录制盘。在立体显微镜下，用细尖的钳子轻轻地将幼虫放置在这个硅胶垫的中心上方，侧面与身体的前部和后部从左到右运行。使用细尖钳，通过幼虫的后部诺乔德直接向肛门插入边缘针正交到硅胶上。将第二个针穿过靠近尾部的鼻梁，并通过气囊的鼻梁插入第三个针脚。通过声波囊插入第四个销，同时提供轻微的旋转，因为销插入封装剂。当应用轻微的旋转时，注意和象形囊泡之间的组织，以显示发热的索马塔集群。将针幼虫置于 DIC 显微镜固定阶段的 10 倍目标下，并定向与左头阶段矢量平行的肌肉块的感官裂口。将接地线放入浴缸溶液中，并确保连接到左头舞台。使用灵活的凝胶加载移液器尖端填充 VR 记录电极，并将其插入左头级移液器支架。将放大倍数提高到 40 倍，将记录移液器降低到盘中，同时施加气动传感器产生的正压。将电极尖端在两个肌膜腹腔之间的肌塞上带到横向线，直到裂口以VR电极尖孔径为中心，降低移液器，直到尖端孔径的滞后边缘轻轻地接触上皮。初始接触后，对角操纵移液器，以确保前缘进行接触并生成密封。使用气动传感器施加负压并按住它。在补丁夹软件中，单击工具栏上的"播放"按钮以监控 VR 信号。一旦观察到具有威尔斯定型突发信号动力学的运动神经元活动，确保实现 VR 记录。将通风记录电极填充 30 微升细胞外溶液，并插入右头级移液器支架。然后将其降低到盘中溶液中，同时施加气动传感器产生的正压。定位电极，并将电极尖端带到标本上。使用微操纵器，降低心电极尖端，直到它保持在夹层上方的位置。将放大倍数增加到浸入的 40 倍，并定位后横向线神经和夹板的交叉点。将电极尖端带过发泡的结节，降低移液器，直到尖端接触上皮。轻轻地，操纵电极，使整个尖端周长接触到发热的结节。使用气动传感器施加负压并按住它。单击补丁夹软件中的 Play 后，确保当峰值大约每 100 到 200 毫秒自发发生时，实现整个细胞松散的神经元贴片记录。检测到异常神经元和运动神经元活动后，单击峰值夹 10 工具栏上的"记录"按钮，以捕获两个通道中同时无间隙的录制。执行文本手稿中描述的数据预处理。使用此无间隙记录协议，可以同时测量有声神经元和VR神经元的实时活动。自定义编写的预处理脚本生成图，以便使用阈值、最小持续时间和最小间歇间隔等参数帮助可视化峰值检测。通过调整预处理脚本中的下界和上界检测变量来获得隔离信号。文特尔根尖峰检测遵循相同的参数与额外的输入。电机命令内的爆发由至少持续 5 毫秒的 0.1 毫秒内的两个峰值定义，并以至少三次爆发的间隔小于 200 毫秒的突发性划定，预处理脚本将覆盖在明确定义的兴趣期内进入的通风活动的部分。在这种情况下，平均自发活动显示对 X 轴上描述的运动活动开始的反应发生巨大变化，时间等于零。游泳前峰值速率与游泳后峰值速率之间存在显著差异。异常峰值率与游泳持续时间呈负相关。未检测到相对峰值速率和游泳频率之间的相关性。动物健康是尝试这个程序时最重要的事情。监测快速血液流动不仅能确保动物的福利，还能增加神经记录成功的可能性，这一点至关重要。通过利用斑马鱼现有的遗传工具，这种电生理学协议可以通过转基因线来有力地研究毛细胞系统内外的解剖和功能电路连接性。这种对贴片夹紧钳技术的简化修改使我们能够监控感官系统在体内的功能。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

从胚胎脊髓​​连合神经的解剖和文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

科研

神经科学

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

横向扩散和培养的神经元膜蛋白的胞吐评估使用荧光恢复和荧光损失漂白

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetic激活斑马鱼的体感神经元使用厨师tdTomato的

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

鉴定转基因鱼的完整的大脑中的神经元的电活动记录

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

解剖和斑马鱼的胚胎横向安装：脊髓发展分析

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

大脑侧向颅骨切开术大脑活动的中尺度广角光学成像

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

在鼠标空肠和结肠段肠系膜传入神经活性的体外记录

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

体外大鼠结肠传入纤维的电生理特性

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

幼虫斑马鱼外系头发细胞的活体钙成像

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

自由游泳鱼中可移动的特龙对神经元的无线电生理记录

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...