Name: activity of posterior lateral line afferent neurons during swimming in zebrafish
Uploaded: 2021-02-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish at JoVE.com

Wir danken dem National Institute of Health (DC010809), der National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) und dem Whitney Laboratory for Marine Biosciences für J.C.L. Wir danken ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Liao Lab für anregende Diskussionen.

Alle Tierpflege und -experimente wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Florida genehmigt wurden.
1. Vorbereitung von Materialien für elektrophysiologische Aufnahmen
<ol><li>Machen Sie eine Aufnahmeschale mit Silikonelastomerboden.<ol>
<li>Geben Sie eine dünne Schicht selbstmischendem Silikonelastomerkomponenten (z. B. Sylgard) in eine Gewebekulturschale mit Deckglasboden, bis sie mit dem Rand des flac...

Das beschriebene experimentelle Protokoll bietet das Potenzial, endogene Veränderungen des sensorischen Inputs über motorisches Verhalten in einem intakten, sich verhaltenden Wirbeltier zu überwachen. Insbesondere beschreibt es einen In-vivo-Ansatz zur Durchführung simultaner extrazellulärer Aufnahmen von lateralen line afferenten Neuronen und ventralen motorischen Wurzeln in Larvenzebrafischen. Spontane affente Aktivität wurde zuvor bei Zebrafischen ohne Berücksichtigung einer möglichen gleichzeitigen motorische...

Affente Neuronen mechanosensorischer Systeme übertragen während des Hörens und Gleichgewichts Informationen von Haarzellen an das Gehirn. Die Elektrophysiologie kann die Empfindlichkeit afferenter Neuronen durch direkte Aufnahmen aufdecken. Während das Patchen ganzer Zellen aus Haarzellen eine Herausforderung sein kann, ist die Aufzeichnung von nachgeschalteten afferenten Neuronen einfacher und ermöglicht die Beurteilung von Aktionspotentialen als Reaktion auf kontrollierte Stimulationen1,2,3. Stimulierende Haarzellen führen zu ihrer Ablenkung, die mechanosensorische Strukturen verändert und so eine Zunahme der Aktionspotentiale (Spikes) in verschiedenen Neuronenauslöst 4,5,6. In Abwesenheit äußerer Reize steigen afferent neuronen auch spontan aufgrund von Glutamatlecks aus den Haarzellen auf die afferenten postsynaptischen Terminals7,8und tragen nachweislich zur Aufrechterhaltung der Empfindlichkeit bei9,10. Die Patch-Clamp-Aufzeichnung der afferenten Aktivität ermöglicht die Beobachtung der Empfindlichkeit und Signaldynamik von Haarzellen, die mit Techniken mit geringerer zeitlicher Auflösung nicht möglich sind, wie z.B. in der Mikrophonik11,12 oder funktionellen Calcium-Bildgebung13,14,15. Das folgende Protokoll ermöglicht die Aufzeichnung afferenter Aktivität gleichzeitig mit motorischen Befehlen, um sofortige Veränderungen der Haarzellempfindlichkeit aufzudecken.
Zebrafische (Danio rerio) verwenden Haarzellen, die in Neuromasten enthalten sind, die das Seitenliniensystem bilden, um Wasserbewegungen relativ zu ihrem Körper zu erkennen, die in neuronale Signale übersetzt werden, die für die Navigation unerlässlich sind16,17,18, Raubtiervermeidung, Beutefang19,20und Schulung21. Der Wasserfluss kann auch durch die Bewegungen des Schwimmens22 , 23,24, Atmung22 , 25,26und Fütterung27selbst erzeugt werden. Diese Verhaltensweisen umfassen sich wiederholende Bewegungen, die Haarzellen ermüden und die Wahrnehmung beeinträchtigen können. Daher ist es entscheidend, dass das Seitenliniensystem zwischen externen (exafferenten) und selbst erzeugten (reafferenten) Strömungsreizen unterscheidet. Eine Folgeentladung schwächt selbst erzeugte Strömungssignale während der Fortbewegung bei Zebrafischen ab. Dieses hemmende prädiktive motorische Signal wird über absteigende Neuronen an die sensorischen Rezeptoren weitergeleitet, um den Eingang zu modifizieren oder die Verarbeitung des reafferenten Feedbacks zu unterbrechen28,29. Bahnbrechende Arbeiten, die zu unserem frühen Verständnis dieses Feedforward-Systems beitrugen, stützten sich auf In-vitro-Präparate, bei denen die Konnektivität und die endogene Aktivität des neuronalen Schaltkreises nicht aufrechterhalten wurden28,30,31,32,33,34,35. Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Erhaltung eines intakten neuronalen Schaltkreises, in dem die endogene Rückkopplungsdynamik aufrechterhalten wird, wodurch ein besseres Verständnis der Folgeentladung in vivo ermöglicht wird.
Das hier beschriebene Protokoll beschreibt, wie die Aktivität von afferenten Neuronen und Motoneuronen in Larvenzebrafischen gleichzeitig überwacht werden kann. Die Charakterisierung der afferenten Signaldynamik vor, während und nach motorischen Befehlen liefert Einblicke in die endogene Rückkopplung des zentralen Nervensystems in Echtzeit, die die Empfindlichkeit der Haarzellen während der Fortbewegung moduliert. Dieses Protokoll beschreibt, welche Materialien vor Experimenten vorbereitet werden müssen und beschreibt dann, wie Zebrafischlarven gelähmt und vorbereitet werden können. Das Protokoll wird beschreiben, wie eine stabile lose Patch-Aufzeichnung von afferenten Neuronen und extrazellulären ventralen Wurzelaufnahmen (VR) von Motoneuronen erstellt werden kann. Repräsentative Daten, die mit diesem Protokoll gewonnen werden können, werden von einer beispielhaften Person präsentiert und die Analyse wurde an mehreren Replikaten des experimentellen Protokolls durchgeführt. Die Vorverarbeitung der Daten erfolgt mithilfe von benutzerdefinierten Skripten in MATLAB. Insgesamt ist dieses experimentelle In-vivo-Paradigma bereit, ein besseres Verständnis des sensorischen Feedbacks während der Fortbewegung in einem Modell-Wirbeltier-Haarzellsystem zu liefern.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL beaker</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>1000</td>
			<td>resceptacle for etchant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10xW</td>
			<td>low magnification for positioning larvae and recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td>higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>abfload.m</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffVR_preprocess.m</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB script for preprocessing recording data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC coaxial cables</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>2249-C-12</td>
			<td>connecting amplifier and digitizer channels; require 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150F-3</td>
			<td>inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>burst_detect</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>any computer should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Power Supply</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>72-420</td>
			<td>used for electrically etching dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophysiology digitizer</td>
			<td>Axon Instruments, Molecular Devices</td>
			<td>Axon DigiData 1440A</td>
			<td>enables acquisition of patch-clamp data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>FB255B</td>
			<td>2.5 mm box filament used in micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>used to manipulate larvae and insert pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixed stage DIC microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible, tapered pipette tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-169</td>
			<td>flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.</td>
			<td>FD3510-100</td>
			<td>cover glass bottomed dish recording dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipe</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>task wipe used for wicking away excess fluid from larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Gard</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.</td>
			<td>710172</td>
			<td>self-mixing sylgard elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2020b</td>
			<td>command line software for preprocessing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microelectrode amplifier</td>
			<td>Axon Instruments, Molecular Devices</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>patch clamp amplifier for dual channel recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>to polish recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator control unit</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MC1000-eR/T</td>
			<td>4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td>for pulling capillary glass into recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope control unit</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MC1000e</td>
			<td>positions the microscope around the fixed stage and preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motorized micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MX7600</td>
			<td>positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp Commander</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>2.2.2</td>
			<td>downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical air table</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>VH3036W-OPT</td>
			<td>breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>10.7.0</td>
			<td>downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition &#38; Analysis Software Download page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>permanent ink marker</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>order from amazon.com</td>
			<td>for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri-dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35-3001</td>
			<td>used to immerse larvae in paralytic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td>hold recording electrode and connect to the headstage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pneumatic transducer</td>
			<td>Fluke Biomedical Instruments</td>
			<td>DPM1B</td>
			<td>for controlling recording electrode internal pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>etchant for etching dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>14-169-1A</td>
			<td>tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spike_detect</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td>used to visualize pin tips and during preparation of larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight edge razor blade</td>
			<td>Canopus</td>
			<td>order from amazon.com</td>
			<td>cuts the tungsten wire while making dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swimbout_detect</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Becton Dickinson Compoany</td>
			<td>309602</td>
			<td>filled with extracellular solution to inject into recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z135003-500EA</td>
			<td>single use, non-sterile pipette for transfering larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>12854</td>
			<td>pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tungsten wire</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.</td>
			<td>715500</td>
			<td>0.002 inch, 50.8 &#956;m diameter; used to make dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum filtration unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCGVU11RE</td>
			<td>single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>voltage-clamp current-clamp headstage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV-7B</td>
			<td>supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1601</td>
			<td>for immobilizing the larvae prior to recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activity of posterior lateral line afferent neurons during swimming in zebrafish

Sensorische Systeme sammeln Hinweise, die für die Steuerung des Verhaltens unerlässlich sind, aber Tiere müssen entschlüsseln, welche Informationen biologisch relevant sind. Die Fortbewegung erzeugt reafferente Hinweise, die Tiere von relevanten sensorischen Hinweisen der Umgebung entwirren müssen. Wenn beispielsweise ein Fisch schwimmt, wird der aus Körperandulationen erzeugte Fluss von den mechanorezeptiven Neuromasten erkannt, die aus Haarzellen bestehen, aus denen das Seitenliniensystem besteht. Die Haarzellen übertragen dann flüssige Bewegungsinformationen vom Sensor über die sensorisch afferenten Neuronen an das Gehirn. Gleichzeitig wird die Folgeentladung des Motorbefehls an die Haarzellen weitergeleitet, um eine Reizüberflutung zu verhindern. Die Berücksichtigung der hemmenden Wirkung prädiktiver motorischer Signale während der Fortbewegung ist daher bei der Bewertung der Empfindlichkeit des Seitenliniensystems von entscheidender Bedeutung. Wir haben einen elektrophysiologischen In-vivo-Ansatz entwickelt, um gleichzeitig die aktivität des hinteren lateralen Line afferenten Neurons und der ventralen motorischen Wurzel bei Zebrafischlarven (4-7 Tage nach der Befruchtung) zu überwachen, die mehrere Stunden dauern können. Extrazelluläre Aufnahmen von afferenten Neuronen werden mit der Loose Patch Clamp-Technik erreicht, die Die Aktivität einzelner oder mehrerer Neuronen erkennen kann. Ventrale Wurzelaufnahmen werden durch die Haut mit Glaselektroden durchgeführt, um die Aktivität von Motoneuronen zu erkennen. Unser experimentelles Protokoll bietet das Potenzial, endogene oder evozierte Veränderungen des sensorischen Inputs über motorisches Verhalten in einem intakten, sich verhaltenden Wirbeltier zu überwachen.

Nachdem Zebrafischlarven richtig immobilisiert und die hintere Seitenlinie afferentes Ganglion und VR-Aufzeichnung erreicht wurde, kann die Aktivität sowohl in afferenten als auch in Motoneuronen gleichzeitig gemessen werden. Die Anzeige der Aufzeichnungskanäle über lückenlose Aufzeichnungsprotokolle (Schritt 1.4) zur kontinuierlichen Überwachung der Afferent- und VR-Aktivität. In Echtzeit kann gleichzeitig mit der VR-Aktivität, die auf fiktive Schwimmkämpfe hinweist, eine Abnahme der spontanen afferenten Spitzen...

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Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung von Veränderungen der afferenten Neuronenaktivität während motorischer Befehle in einem Modell-Wirbeltier-Haarzellsystem.

Aktivität von posterioren Lateral Line Afferent Neuronen beim Schwimmen im Zebrafisch

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

Dieses Protokoll ermöglicht es dem Forscher, die Aktivität und Reaktion einzelner sensorischer Neuronen auf eine kontrollierte Stimulation in intakten sich verhaltenden Wirbeln zu überwachen. Diese Patch-Elektrophysiologie ist eine schnelle und direkte Möglichkeit, die Spiking-Aktivität einzelner Neuronen in Echtzeit aufzuzeichnen. Und das bietet eine bessere Zeitauflösung und Empfindlichkeit zu geringeren Kosten als die meisten optischen Bildgebungstechniken.Die seitlichen Haarzellen sind homolog zu denen des menschlichen Innenohrs. Diese Technik ist also bereit, die Eigenschaften von Haarzellkreisläufen aufzudecken, die für menschliche Taubheit und Hörstörungen gelten. Elektrophysiologie ist ein Handwerk mit Feinmotorik, das gesehen und physisch nachgeahmt werden muss.Nur Textanweisungen lassen zu viel Raum für Fehlinterpretationen. Geben Sie zunächst eine dünne Schicht aus selbstmischendem Silikonelastomer wie Sylgard in eine Gewebekulturschale mit Deckglasboden, um eine Silikonelastomer-Bodenaufnahmeschale herzustellen. Um Sezierstifte herzustellen, stellen Sie einem 100-Milliliter-Becherglas von Etchant mit einem DC-Netzteil eine negative Ladung von fünf Volt zur Verfügung und befestigen Sie einen Wolframdraht an den positiv geladenen Ausgang.Tauchen Sie die Spitze des Drahtes wiederholt in das Etchant-Bad, bis sich die Spitze zu einem scharfen Punkt verengt. Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop den Draht etwa einen Millimeter von der Spitze entfernt mit einer rasiermesserscharfen Klinge mit gerader Kante. Wiederholen Sie dies dreimal und stecken Sie dann die Stifte mit einer feinen Pinzette in die ausgehärtete Aufnahmeschale.Um Aufnahmeelektroden vorzubereiten, ziehen Sie Borosilikatglaskapillarröhren mit einem Mikropipettenzieher mit Boxfilament. Die Elektrode sollte eine Spitze mit einem Durchmesser von 30 Mikrometern und einer Verjüngung haben, mit der affelinete Neuronen aus der hinteren Seitenlinie aufgezeichnet werden. Ziehen Sie ein zusätzliches Kapillarrohr aus Borosilikatglas in ein Elektrodenpaar mit kleineren Spitzendurchmessern von einem bis fünf Mikrometern.Halten Sie eine Elektrode in jeder Hand und führen Sie die Spitzen vorsichtig übereinander, um die Spitzen zu brechen. Polieren Sie die abgeschränkte Spitze mit einer Mikroschmiede, bis sie glatt ist. Der endgültige Spitzendurchmesser sollte zwischen 30 und 50 Mikrometern liegen.Immobilisieren Sie Zebrafischlarven und übertragen Sie sie mit einer großen Spitze in eine 35-Millimeter-Petrischale, um die Pipette zu übertragen. Entfernen Sie so viel wie möglich von der umgebenden Lösung. Tauchen Sie larven Sie für etwa fünf Minuten in 10 Mikroliter 0,1% alpha-Bungarotoxin.Waschen Sie die gelähmte Larve mit extrazellulärer Lösung für 10 Minuten. Verwenden Sie dann eine Transferpipette, um die Larve aus dem extrazellulären Lösungsbad in die Aufzeichnungsschale mit Silikonboden zu bewegen. Positionieren Sie die Larven unter einem Stereomikroskop vorsichtig mit einer feinspitzigen Zette über der Mitte dieser Silikonmatte, seitlich mit den vorderen und hinteren Enden des Körpers, die von links nach rechts verlaufen.Mit einer feinspitzigen Pinzette den Kantenstift orthogonal durch das dorsale Notochord der Larven direkt dorsal zum Anus einführen. Führen Sie den zweiten Stift durch das Notochord in der Nähe des Schwanzendes ein und führen Sie den dritten Stift durch den Notochord dorsal der Gasblase ein. Setzen Sie den vierten Stift durch das Otikvesikel ein, während Sie eine leichte Drehung bereitstellen, wenn der Stift in die Kapselung einführt.Wenn eine leichte Rotation angewendet wird, achten Sie auf das Gewebe zwischen dem Cleithrum und dem otischen Vesikel, um die Ansammlung von afferenten Somata freizulegen. Legen Sie die Stiftlarve unter das 10-fache Objektiv auf eine feste Stufe des DIC-Mikroskops und richten Sie die miozepalen Spalten der Muskelblöcke parallel zum linken Kopfstadiumvektor aus. Legen Sie den Erdungsdraht in die Badlösung und stellen Sie sicher, dass er mit der linken Kopfstufe verbunden ist.Füllen Sie die VR-Aufnahmeelektrode mit 30 Mikrolitern extrazellulärer Lösung unter Verwendung einer flexiblen Gel-Loading-Pipettenspitze und führen Sie sie in den linken Kopftischpipettenhalter ein. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf das 40-fache und senken Sie die Aufzeichnungspipette in die Schalenlösung, während Sie einen positiven Druck ausüben, der von einem pneumatischen Wandler erzeugt wird. Bringen Sie die Elektrodenspitze über ein Myoseptum zwischen den beiden Myomeren ventral zur Seitenlinie, bis die Spalte in der VR-Elektrodenspitzenöffnung zentriert ist Senken Sie die Pipette, bis die verzögerte Kante der Spitzenöffnung das Epithel sanft berührt.Manövrieren Sie die Pipette nach dem ersten Kontakt diagonal, um sicherzustellen, dass die Vorderkante Kontakt herstellt und eine Dichtung erzeugen kann. Unterdruck mit dem pneumatischen Wandler ausüben und halten. Klicken Sie in der Patch-Clamp-Software auf die Schaltfläche Play in der Symbolleiste, um das VR-Signal zu überwachen.Stellen Sie sicher, dass die VR-Aufzeichnung erreicht wird, sobald die Motoneuronaktivität mit der stereotypen Burst-Signaldynamik von Wells beobachtet wird. Füllen Sie die afferenten Aufzeichnungselektrode mit 30 Mikrolitern extrazellulärer Lösung und führen Sie sie in den rechten Kopftischpipettenhalter ein. Senken Sie es dann in die Spüllösung, während Sie einen positiven Druck ausüben, der von einem pneumatischen Messumformer erzeugt wird.Suchen Sie die Elektrode und bringen Sie die Elektrodenspitze über die Probe. Senken Sie mit einem Mikromanipulator die afferentielle Elektrodenspitze ab, bis sie die Position über dem Cleithrum hält. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf das 40-fache Eintauchen und lokalisieren Sie den Schnittpunkt des hinteren Seitenliniennervs und des Cleithrums.Bringen Sie die Elektrodenspitze über das afferenten Ganglion und senken Sie die Pipette, bis die Spitze das Epithel kontaktiert. Manövrieren Sie die Elektrode vorsichtig so, dass der gesamte Spitzenumfang das affente Ganglion kontaktiert. Unterdruck mit dem pneumatischen Wandler ausüben und halten.Nachdem Sie in der Patch-Clamp-Software auf Play geklickt haben, stellen Sie sicher, dass die gesamte Zelle lose Patch-Aufnahme von afferenten Neuronen erreicht wird, wenn Spikes spontan etwa alle 100 bis 200 Millisekunden auftreten. Sobald sowohl die Aktivität unterschiedlicher Neuronen als auch der Motoneuronen erkannt wurde, klicken Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen auf der Symbolleiste in Peak Clamp 10, um gleichzeitig lückenlose Aufnahmen in beiden Kanälen aufzunehmen. Führen Sie die Datenvorverarbeitung wie im Textmanuskript beschrieben durch.Mit diesem lückenlosen Aufzeichnungsprotokoll kann die Echtzeitaktivität von afferenten und VR-Neuronen gleichzeitig gemessen werden. Benutzerdefinierte Skripte mit Vorverarbeitung generieren Diagramme, um die Visualisierung der Spike-Erkennung mithilfe von Parametern wie Schwellenwert, Mindestdauer und minimalem Interspike-Intervall zu unterstützen. Isolierte Signale wurden durch Anpassung der Erkennungsvariablen für die Unter- und Obergrenze im Vorverarbeitungsskript erhalten.Die Erkennung ventraler Wurzelspitzen folgt identischen Parametern mit zusätzlichen Eingängen. Bursts innerhalb eines Motorbefehls werden durch mindestens zwei Spikes innerhalb von 0,1 Millisekunden definiert, die mindestens fünf Millisekunden dauern und durch mindestens drei Bursts mit Interburst-Intervallen von weniger als 200 Millisekunden abgegrenzt werden Vorverarbeitungsskripte überlagern Abschnitte unterschiedlicher Aktivität, die in einem genau definierten Zeitraum von Interesse eingegeben wurden. In diesem Fall zeigt die mittlere spontane Aktivität dramatische Veränderungen als Reaktion auf den Beginn der motorischen Aktivität, die auf der X-Achse als Zeit gleich Null dargestellt wird.Signifikante Unterschiede wurden in den afferenten Spike-Raten zwischen den Spike-Raten vor dem Schwimmen und den Spike-Raten sowohl der Schwimm- als auch der Post-Swim-Perioden festgestellt. Afferenten Spike-Raten waren negativ mit der Schwimmdauer korreliert. Es wird keine Korrelation zwischen relativer Spitzenrate und Schwimmfrequenz festgestellt.Tiergesundheit ist das Wichtigste, wenn Sie versuchen, dieses Verfahren zu versuchen. Es ist wichtig, den schnellen Blutfluss zu überwachen, um nicht nur das Wohlergehen der Tiere zu gewährleisten, sondern auch die Wahrscheinlichkeit eines neuronalen Aufzeichnungserfolgs zu erhöhen. Durch die Nutzung genetischer Werkzeuge, die in Zebrafischen verfügbar sind, kann dieses Elektrophysiologie-Protokoll durch transgene Linien ergänzt werden, um die Konnektivität anatomischer und funktioneller Schaltkreise in Haarzellsystemen und darüber hinaus leistungsfähig zu untersuchen.Diese vereinfachte Modifikation der Patch-Clamp-Technik ermöglicht es uns, zu überwachen, wie sensorische Systeme in vivo funktionieren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetische Aktivierung der Zebrafisch Somatosensory Neuronen mit Chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Ein Großer Lateral Craniotomy Verfahren für Mesoskalige Breitfeld Optical Imaging von Hirnaktivität

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

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In - vitro - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

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In-vitro- Charakterisierung der elektrophysiologischen Eigenschaften des Kolon afferenten Fasern in Ratten

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

Drahtlose elektrophysiologische Aufzeichnung von Neuronen durch bewegliche Tetrodes in frei schwimmenden Fischen

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...