Name: activity of posterior lateral line afferent neurons during swimming in zebrafish
Uploaded: 2021-02-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish at JoVE.com

אנו מודים בהכרת תודה על תמיכת המכון הלאומי לבריאות (DC010809), הקרן הלאומית למדע (IOS1257150, 1856237), ומעבדת ויטני למדעי המוח הימיים ל J.C.L. ברצוננו להודות לחברי מעבדת ליאו בעבר ובהווה על הדיונים הממריצה.

כל הטיפול והניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פלורידה.
1. הכנת חומרים להקלטות אלקטרופיזיולוגיות
<ol><li>מכינים צלחת הקלטה עם תחתית סיליקון.<ol>
<li>לוותר על שכבה דקה של רכיבים אלסטומר סיליקון ...

הפרוטוקול הניסיוני המתואר מספק את הפוטנציאל לניטור שינויים אנדוגניים בקלט החושי על פני התנהגויות מוטוריות בחולייתן שלם ומתנהג. באופן ספציפי, הוא מפרט גישה in vivo לביצוע הקלטות חוץ תאיות בו זמנית של נוירונים afferent קו לרוחב ושורשים מוטוריים גחוניים בזברה זחל. פעילות ספונטנית מתאפיינת בעבר בז...

נוירונים afferent של מערכות mechanosensory להעביר מידע מתאי שיער למוח במהלך שמיעה ואיזון. אלקטרופיזיולוגיה יכולה לחשוף את הרגישות של נוירונים afferent באמצעות הקלטות ישירות. בעוד תיקון תאים שלמים מתאי שיער יכול להיות מאתגר, הקלטה מתאי עצב afferent במורד הזרם קל יותר ומאפשר הערכה של פוטנציאל פעולה בתגובה גירויים מבוקרים1,2,3. מגרה תאי שיער להוביל הסטה שלהם, אשר משנה מבנים mechanosensory, ובכך לעורר עלייה בפוטנציאל הפעולה (קוצים) בתאי עצב אדיש4,5,6. בהיעדר גירויים חיצוניים, נוירונים afferent גם ספייק באופן ספונטני עקב דליפת גלוטמט מתאי השיער על מסופים פוסט סינפטיים afferent7,8, והוכחו לתרום לשמירה על רגישות9,10. הקלטת מלחציים של פעילות afferent מאפשרת תצפית על רגישות לתאי השיער ודינמיקת אותות שאינם אפשריים באמצעות טכניקות ברזולוציה זמנית נמוכה יותר, כגון במיקרופוניקה11,12 או הדמיית סידן תפקודית13,14,15. הפרוטוקול הבא יאפשר הקלטה של פעילות afferent במקביל לפקודות המנוע לחשוף שינויים מיידיים ברגישות לתאי השיער.
דגי זברה(Danio rerio)משתמשים בתאי שיער הכלולים בנוירומסטים המרכיבים את מערכת הקו לרוחב כדי לזהות תנועת מים יחסית לגופם, המתורגמת לאותות עצביים החיוניים לניווט16,17,18, הימנעות טורפים, לכידת טרף19,20, ולימוד21. זרימת מים יכולה להיווצר גם על ידי תנועות של שחייה22,23,24,נשימה 22,25,26, והאכלה27. התנהגויות אלה מהוות תנועות חוזרות ונשנות שיכולות להתעייף מתאי השיער ולפגוע בחישה. לכן, זה קריטי כי מערכת הקו לרוחב מבדיל בין חיצוני (exafferent) ו עצמית שנוצר (reafferent) גירויים זרימה. פריקה קורולית מקלה על אותות זרימה עצמיים במהלך תנועה בזברה. אות מנוע חיזוי מעכב זה מועבר באמצעות נוירונים יורדים לקולטנים החושיים כדי לשנות את הקלט או להפריע לעיבוד המשוב החביב28,29. עבודה מהותית שתרמה להבנתנו המוקדמת את מערכת ההזנה הזו הסתמכה על הכנות במבחנה שבהן הקישוריות והפעילות האנדוגנית של המעגל העצבי לא נשמרו28,30,31,32,33,34,35. פרוטוקול זה מתאר גישה לשימור מעגל עצבי שלם שבו נשמרת דינמיקת משוב אנדוגני ובכך מאפשר הבנה טובה יותר של הפרשות corollary ב vivo.
הפרוטוקול המתואר כאן מתאר כיצד לפקח על הנוירונים האחוריים לרוחב קו פעילות נוירון מוטורי בו זמנית זברה זחל. אפיון דינמיקת האותות לפני, במהלך ואחרי פקודות מוטוריות מספק תובנות לגבי משוב אנדוגני בזמן אמת ממערכת העצבים המרכזית המווסתת את רגישות תאי השיער במהלך התנועה. פרוטוקול זה מתאר אילו חומרים יצטרכו להיות מוכנים לפני הניסויים ולאחר מכן מתאר כיצד לשתק ולהכין זחלי זברה. הפרוטוקול יתאר כיצד להקים הקלטה יציבה של תיקון רופף של נוירונים afferent ואת השורש הגחוני חוץ תאי (VR) הקלטות של נוירונים מוטוריים. נתונים מייצגים שניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה מוצגים מאדם למופת וניתוח בוצע בשכפולים מרובים של הפרוטוקול הניסיוני. עיבוד מראש של נתונים מתבצע באמצעות קבצי Script כתובים מותאמים אישית ב- MATLAB. בסך הכל, פרדיגמה ניסיונית זו in vivo צפויה לספק הבנה טובה יותר של משוב חושי במהלך תנועה במערכת תאי שיער בעלי חוליות מודל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL beaker</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>1000</td>
			<td>resceptacle for etchant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10xW</td>
			<td>low magnification for positioning larvae and recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td>higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>abfload.m</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffVR_preprocess.m</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB script for preprocessing recording data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC coaxial cables</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>2249-C-12</td>
			<td>connecting amplifier and digitizer channels; require 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150F-3</td>
			<td>inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>burst_detect</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>any computer should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Power Supply</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>72-420</td>
			<td>used for electrically etching dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophysiology digitizer</td>
			<td>Axon Instruments, Molecular Devices</td>
			<td>Axon DigiData 1440A</td>
			<td>enables acquisition of patch-clamp data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>FB255B</td>
			<td>2.5 mm box filament used in micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>used to manipulate larvae and insert pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixed stage DIC microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible, tapered pipette tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-169</td>
			<td>flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.</td>
			<td>FD3510-100</td>
			<td>cover glass bottomed dish recording dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipe</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>task wipe used for wicking away excess fluid from larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Gard</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.</td>
			<td>710172</td>
			<td>self-mixing sylgard elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2020b</td>
			<td>command line software for preprocessing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microelectrode amplifier</td>
			<td>Axon Instruments, Molecular Devices</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>patch clamp amplifier for dual channel recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>to polish recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator control unit</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MC1000-eR/T</td>
			<td>4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td>for pulling capillary glass into recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope control unit</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MC1000e</td>
			<td>positions the microscope around the fixed stage and preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motorized micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MX7600</td>
			<td>positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp Commander</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>2.2.2</td>
			<td>downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical air table</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>VH3036W-OPT</td>
			<td>breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>10.7.0</td>
			<td>downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition &#38; Analysis Software Download page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>permanent ink marker</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>order from amazon.com</td>
			<td>for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri-dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35-3001</td>
			<td>used to immerse larvae in paralytic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td>hold recording electrode and connect to the headstage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pneumatic transducer</td>
			<td>Fluke Biomedical Instruments</td>
			<td>DPM1B</td>
			<td>for controlling recording electrode internal pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>etchant for etching dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>14-169-1A</td>
			<td>tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spike_detect</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td>used to visualize pin tips and during preparation of larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight edge razor blade</td>
			<td>Canopus</td>
			<td>order from amazon.com</td>
			<td>cuts the tungsten wire while making dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swimbout_detect</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Becton Dickinson Compoany</td>
			<td>309602</td>
			<td>filled with extracellular solution to inject into recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z135003-500EA</td>
			<td>single use, non-sterile pipette for transfering larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>12854</td>
			<td>pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tungsten wire</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.</td>
			<td>715500</td>
			<td>0.002 inch, 50.8 &#956;m diameter; used to make dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum filtration unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCGVU11RE</td>
			<td>single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>voltage-clamp current-clamp headstage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV-7B</td>
			<td>supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1601</td>
			<td>for immobilizing the larvae prior to recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activity of posterior lateral line afferent neurons during swimming in zebrafish

מערכות חושיות אוספות רמזים החיוניים להכוונת התנהגות, אך בעלי חיים חייבים לפענח איזה מידע רלוונטי ביולוגית. תנועה מייצרת רמזים חוזרים כי בעלי חיים חייבים להתנתק מרמזים חושיים רלוונטיים של הסביבה שמסביב. לדוגמה, כאשר דג שוחה, זרימה הנוצרת מגלי גוף מזוהה על ידי נוירומסטים מכניים, הכוללים תאי שיער, המרכיבים את מערכת הקו לרוחב. תאי השיער מעבירים מידע על תנועת נוזלים מהחיישן למוח דרך תאי העצב החושיים. במקביל, פריקה corollary של הפקודה המוטורית מועברת לתאי השיער כדי למנוע עומס חושי. חשבונאות ההשפעה המעכבת של אותות מנוע חזוי במהלך הקטר הוא, אם כן, קריטי בעת הערכת הרגישות של מערכת הקו לרוחב. פיתחנו גישה אלקטרופיזיולוגית in vivo כדי לפקח בו זמנית על נוירון afferent קו לרוחב אחורי ופעילות שורש מנוע הגחוני בזחלים זברה (4-7 ימים לאחר הפריה) שיכול להימשך מספר שעות. הקלטות חוץ-תאיות של נוירונים afferent מושגות באמצעות טכניקת מהדק תיקון רופף, אשר יכול לזהות פעילות של נוירונים בודדים או מרובים. הקלטות שורש גחוני מבוצעות דרך העור עם אלקטרודות זכוכית כדי לזהות פעילות נוירון מוטורי. הפרוטוקול הניסיוני שלנו מספק את הפוטנציאל לנטר שינויים אנדוגניים או מעוררים בקלט חושי על פני התנהגויות מוטוריות בחולייתן שלם ומתנהג.

לאחר זחלי זברה משתקים כראוי ואת גנגליון קו לרוחב האחורי והקלטת VR מושגת, פעילות הן נוירונים afferent ומוטורי ניתן למדוד בו זמנית. ערוצי הקלטה מוצגים באמצעות פרוטוקולי הקלטה ללא פערים (שלב 1.4) לניטור רציף של פעילות afferent ו- VR. בזמן אמת, ניתן להבחין בירידות בשיעור הזינוק הספונטני במקביל לפעילות מצי?...

Watch this Scientific Journal Video about Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish at JoVE.com

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

אנו מתארים פרוטוקול לניטור שינויים בפעילות הנוירונים האדיבים במהלך פקודות מוטוריות במערכת תאי שיער של בעלי חוליות מודל.

פעילות של נוירונים אפרנט קו לרוחב אחורי במהלך שחייה בזברהפיש

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקר לעקוב אחר הפעילות והתגובה של נוירונים חושיים בודדים לגירוי מבוקר בחוליות התנהגות שלמות. אלקטרופיזיולוגיה תיקון זה היא דרך מהירה וישירה להקליט מן הפעילות spiking של נוירונים בודדים בזמן אמת. וזה מספק רזולוציית זמן ורגישות טובות יותר בעלות נמוכה יותר מרוב טכניקות ההדמיה האופטית.תאי השיער הקווים לרוחב הם הומולוגיים לאלה של האוזן הפנימית האנושית. אז טכניקה זו צפויה לחשוף את המאפיינים של מעגלי תאי השיער החלים על חירשות אנושית והפרעות שמיעה. אלקטרופיזיולוגיה היא מלאכה המשתמשת במיומנויות מוטוריות עדינות שיש לראות ולחקות פיזית.הוראות טקסט בלבד משאירות יותר מדי מקום לפרשנות שגויה. כדי להתחיל, לוותר על שכבה דקה של אלסטומר סיליקון ערבוב עצמי כגון Sylgard לתוך צלחת תרבית רקמות תחתית זכוכית כיסוי לעשות צלחת הקלטה התחתונה אלסטומר סיליקון. כדי לבצע סיכות ניתוח, לספק מטען שלילי של חמישה וולט 100 מיליליטר של Etchant באמצעות ספק כוח DC ולחבר חוט טונגסטן לפלט טעון חיובית.שוב ושוב טובלים את קצה החוט לתוך האמבטיה Etchant עד הקצה מצטמצם לנקודה חדה. תחת מיקרוסקופ סטריאו, חותכים את החוט כמילימטר מהקצה עם סכין גילוח בקצה ישר. חזור על זה שלוש פעמים ולאחר מכן להכניס סיכות לתוך צלחת ההקלטה נרפא באמצעות מלקחיים עדינים.כדי להכין אלקטרודות הקלטה, למשוך צינורות נימי זכוכית borosilicate באמצעות פולר micropipette עם חוט תיבת. האלקטרודה צריכה להיות קצה קוטר 30 מיקרומטר עם להתחדד שישמש כדי להקליט נוירונים afferent מהקו לרוחב האחורי. משוך צינור נימי זכוכית בורוסיליקט נוסף לתוך זוג אלקטרודות עם קטרים קטנים יותר של קצה אחד עד חמישה מיקרומטר.מחזיק אלקטרודה אחת בכל יד, בעדינות להפעיל את הטיפים אחד על פני השני כדי לשבור את הטיפים. בעזרת מיקרופורג', יש ללטש את הקצה המשופע עד לקבלת מרקם חלק. קוטר הקצה הסופי צריך להיות בין 30 ל 50 מיקרומטר.לשתק זחלי זברה ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי 35 מילימטר באמצעות קצה גדול להעביר פיפטה. הסר כמה שיותר מהפתרון שמסביב. לטבול זחלים ב 10 microliters של 0.1%אלפא-Bungarotoxin במשך כחמש דקות.לשטוף את הזחל משותק עם פתרון חוץ תאי במשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה העברה להעביר את הזחל מאמבט פתרון חוץ תאי לצלחת הקלטה תחתית סיליקון. תחת מיקרוסקופ סטריאו, מקם בעדינות את הזחלים עם מלקחיים עדינים מעל מרכז מחצלת סיליקון זו, צד לרוחב כלפי מעלה עם הקצוות הצדדיים והאחוריים של הגוף רצים משמאל לימין.באמצעות מלקחיים עדינים, הכנס את סיכת הקצה אורתוגונלית לסיליקון דרך הנוכורד הגבי של הזחלים ישירות הגב לפי הטבעת. הכנס את הסיכה השנייה דרך notochord ליד סוף הזנב והכנס את הסיכה השלישית דרך הגב notochord של שלפוחית הגז. הכנס את הסיכה הרביעית דרך מעטה האוטי תוך מתן סיבוב קל כאשר הסיכה מוכנסת לתוך האנקפסולנט.כמו סיבוב קל מוחל, לצפות את הרקמה בין cleithrum ואת vesicle אוטי לחשוף את האשכול של סומטה afferent. מניחים את זחל הסיכה תחת המטרה 10 פעמים על שלב קבוע של מיקרוסקופ DIC ומכוונים את שסועות mioceptal של גושי השרירים במקביל וקטור שלב הראש השמאלי. מניחים את חוט הקרקע בתמיסת האמבטיה ומבטיחים שהוא מחובר לשלב הראש השמאלי.מלאו את אלקטרודת הקלטת ה-VR ב-30 מיקרוליטרים של פתרון חוץ-תאי בעזרת קצה פיפטה גמיש לטעינת ג'ל והכניסו אותו למחזיק פיפטה שמאלי. להגדיל את ההגדלה ל 40 פעמים ולהוריד את פיפטה הקלטה לתוך הפתרון צלחת תוך הפעלת לחץ חיובי המיוצר על ידי מתמר פנאומטי. מביאים את קצה האלקטרודה מעל myoseptum בין שני מיומרים גחוני לקו לרוחב עד שסוע מרוכז צמצם קצה אלקטרודה VR התחתון את פיפטה עד הקצה מפגר של מפתח קצה בעדינות יוצר קשר עם האפיתל.לאחר מגע ראשוני, לתמרן את פיפטה באלכסון כדי להבטיח את הקצה המוביל יוצר קשר והוא יכול ליצור חותם. החל לחץ שלילי עם מתמר פנאומטי ולהחזיק אותו. בתוכנת מלחציים תיקון, לחץ על כפתור הפעל בסרגל הכלים כדי לפקח על אות VR.ודא כי הקלטת VR מושגת לאחר פעילות נוירון מוטורי עם דינמיקת אות פרץ סטריאוטיפי ולס נצפו. מלאו את אלקטרודת ההקלטה האדישה ב-30 מיקרוליטרים של תמיסת חוץ-תאית והכניסו אותה למחזיק פיפטה של שלב הראש הימני. ואז להוריד אותו לתוך פתרון המנה תוך הפעלת לחץ חיובי המיוצר על ידי מתמר פנאומטי.אתר את האלקטרודה והבא את קצה האלקטרודה מעל הדגימה. באמצעות micromanipulator, להוריד את קצה אלקטרודה afferent עד שהוא מחזיק עמדה מעל cleithrum. להגדיל את ההגדלה ל 40 פעמים טבילה ולאתר את הצומת של עצב הקו לרוחב האחורי cleithrum.מביאים את קצה האלקטרודה מעל הגנגליון האדיש ומנמיכים את הפיפט עד שהקצה יוצר קשר עם האפיתל. בעדינות, לתמרן את האלקטרודה כך היקף הקצה כולו יוצר קשר עם גנגליון afferent. החל לחץ שלילי עם מתמר פנאומטי ולהחזיק אותו.לאחר לחיצה על הפעל בתוכנת מהדק התיקון, ודא כי הקלטת תיקון רופף התא כולו של נוירונים afferent מושגת כאשר קוצים להתרחש באופן ספונטני בערך כל 100 עד 200 אלפיות שנייה. לאחר נוירון afferent ופעילות נוירון מוטורי מזוהים שניהם, לחץ על כפתור הקלטה בסרגל הכלים בהידוק שיא 10 כדי ללכוד הקלטות ללא פער בו זמנית בשני הערוצים. בצע עיבוד מקדים של נתונים כמתואר בכתב היד של הטקסט.באמצעות פרוטוקול הקלטה זה ללא פערים, ניתן למדוד בו-זמנית את הפעילות בזמן אמת של נוירונים afferent ו- VR. קבצי Script שנכתבו מראש ועיבוד מראש מותאמים אישית יוצרים התוויות כדי לסייע בהדמיה של זיהוי ספייק באמצעות פרמטרים כגון סף, משך זמן מינימלי ומרווח ביניים מינימלי. אותות מבודדים הושגו על-ידי התאמת משתני הזיהוי בגבול התחתון ובגבול העליון בקובץ ה- Script שלפני העיבוד.זיהוי ספייק שורשים גחוני עוקב אחר פרמטרים זהים עם כניסות נוספות. התפרצויות בתוך פקודה מוטורית מוגדרות על ידי מינימום של שני קוצים בתוך 0.1 אלפיות השניה שנמשכים לפחות חמש אלפיות שנייה ומתווים על ידי מינימום של שלושה התפרצויות עם מרווחי אינטרברסט של פחות מ -200 אלפיות שנייה סקריפטים לעיבוד מראש יעמיסו מקטעים של פעילות תוחמת שהוזנה על תקופה מוגדרת היטב של עניין. במקרה זה, פעילות ספונטנית ממוצעת מראה שינויים דרמטיים בתגובה לתחילת הפעילות המוטורית המתוארת על ציר ה- X כזמן השווה לאפס.הבדלים משמעותיים התגלו בשיעורי עלייה חדים בין שיעורי עלייה חדה לפני השחייה ושיעורי עלייה חדה הן בתקופות השחייה והן בתקופות שלאחר השחייה. שיעורי הזינוק היו בקורלציה שלילית עם משך השחייה. לא זוהה מתאם בין קצב עלייה יחסי לתדירות השחייה.בריאות בעלי חיים היא הדבר החשוב ביותר כאשר מנסים לנסות את ההליך הזה. זה חיוני כדי לפקח על זרימת דם מהירה לא רק להבטיח רווחת בעלי חיים, אלא גם להגדיל את הסבירות של הצלחה הקלטה עצבית. על ידי מינוף כלים גנטיים הזמינים ב- Zebrafish, פרוטוקול אלקטרופיזיולוגיה זה יכול להיות מוחמא על ידי קווים מהונדסים לחקור בעוצמה קישוריות מעגל אנטומי ותפקודי במערכות תאי השיער ומעבר.שינוי פשוט זה של טכניקת המהדק התיקון מאפשר לנו לפקח על האופן שבו מערכות חושיות מתפקדות ב- vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

הפעלה של נוירונים Optogenetic דג זברה החושית באמצעות שף tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

נוהל Craniotomy Lateral גדול עבור דימות אופטי Mesoscale רחב בתחום של פעילות המוח

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

במבחנת ההקלטה של פעילות עצבית Mesenteric מביא עכבר Jejunal ופלחים גסים

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

במבחנה אפיון של המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבי מביא שטיפת המעי הגס בחולדות

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

הקלטה אלקטרופיסיולוגית של הנוירונים על ידי להזזה Tetrodes בחינם שחייה דגים

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...