Name: activity of posterior lateral line afferent neurons during swimming in zebrafish
Uploaded: 2021-02-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish at JoVE.com

Ulusal Sağlık Enstitüsü (DC010809), Ulusal Bilim Vakfı (IOS1257150, 1856237) ve Whitney Deniz Biyobilimleri Laboratuvarı'ndan J.C.L.'ye desteklerini minnetle kabul ediyoruz. Liao Lab'ın geçmiş ve şimdiki üyelerine tartışmaları teşvik eden için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan bakım ve deneyleri Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Elektrofizyolojik kayıtlar için malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Silikon elastomer tabanlı bir kayıt kabı yapın.<ol>
<li>Kendinden karıştırmalı silikon elastomer bileşenlerinin ince bir tabakasını (örneğin, Sylgard) sığ kuyunun kenarıyla düzleşene kadar bir kapak camı tabanlı doku kültürü kabına ...

Açıklanan deneysel protokol, sağlam ve neşeli bir omurgalıda motor davranışlar arasında duyusal girişteki endojen değişiklikleri izleme potansiyeli sağlar. Özellikle, larva zebra balıklarında yanal çizgi afferent nöronların ve ventral motor köklerinin eşzamanlı hücre dışı kayıtlarını gerçekleştirmeye yönelik in vivo bir yaklaşımı detaylandırıyor. Spontan afferent aktivite daha önce zebra balıklarında potansiyel eşzamanlı motoraktivitesi 1,2 ,<sup...

Mekanosensory sistemlerinin afferent nöronları işitme ve denge sırasında saç hücrelerinden beyne bilgi aktarır. Elektrofizyoloji, afferent nöronların hassasiyetini doğrudan kayıtlarla ortaya alabilir. Saç hücrelerinden tüm hücre yamalama zor olsa da, aşağı akış afferent nöronlardan kayıt yapmak daha kolaydır ve kontrollü stimülasyonlara yanıt olarak eylem potansiyellerinin değerlendirilmesine izin verir1,2,3. Saç hücrelerini uyarmak, mekanosensör yapıları değiştiren sapmalarına yol açar, böylece afferent nöronlarda eylem potansiyellerinde (sivri) bir artışı tetikler4,5,6. Dış uyaranların yokluğunda, afferent nöronlar da saç hücrelerinden7,8sonrası afferent post-sinaptik terminallere glutamat sızıntısı nedeniyle kendiliğinden yükselir ve duyarlılığın korunmasına katkıda bulunduğu gösterilmiştir9,10. Afferent aktivitenin yama kelepçesi kaydı, mikrofonikler 11 , 12 veya fonksiyonelkalsiyum görüntüleme13, 14,15 gibi daha düşük zamansal çözünürlüğe sahip teknikler kullanılarak mümkün olmayan saç hücresi hassasiyetinin ve sinyal dinamiklerinin gözlemlenmesine olanak tanır. Aşağıdaki protokol, saç hücresi duyarlılığındaki anlık değişiklikleri ortaya çıkarmak için motor komutlarla eşzamanlı afferent aktivitenin kaydedilmasına izin verecektir.
Zebra balığı (Danio rerio) vücutlarına göre su hareketini tespit etmek için yanal çizgi sistemini oluşturan nöromistiklerde bulunan saç hücrelerini kullanır, bu da navigasyon için gerekli sinir sinyallerine çevrilir16,17,18, avcı kaçınma, av yakalama19,20ve okul21. Su akışı ayrıca yüzme hareketleri ile kendi kendine üretilebilir22 , 23,24, solunum22,25,26ve besleme27. Bu davranışlar saç hücrelerini yorabilen ve algılamayı bozabilen tekrarlayan hareketlerden oluşur. Bu nedenle, yanal çizgi sisteminin dış (exafferent) ve kendi kendine oluşturulan (reafferent) akış uyaranları arasında ayrım yaptığı kritik öneme sahiptir. Bir corollary deşarjı, zebra balıklarında hareket sırasında kendi kendine oluşturulan akış sinyallerini hafifletir. Bu inhibitör tahmine dayalı motor sinyal, girişi değiştirmek veya reafferent geri bildirimin işlenmesini kesmek için azalan nöronlar aracılığıyla duyu reseptörlerine aktarılır28,29. Bu besleme sistemini erken anlamamıza katkıda bulunan ufuk açıcı çalışma, nöral devrenin bağlantı ve endojen aktivitesinin korunmadığı in vitro preparatlara dayanıyordu28, 30,31,32,33,34,35. Bu protokol, endojen geri bildirim dinamiklerinin korunduğu bozulmamış bir sinir devresini korumaya yönelik bir yaklaşımı açıklar, böylece corollary deşarj in vivo'nun daha iyi anlaşılmasını sağlar.
Burada özetlenen protokol, larva zebra balıklarında posterior lateral çizgi afferent nöron ve motor nöron aktivitesinin aynı anda nasıl izleneceğini açıklar. Motor komutlarından önce, sırasında ve sonrasında farklı sinyal dinamiklerini karakterize etmek, merkezi sinir sisteminden gelen ve hareket sırasında saç hücresi hassasiyetini modüle eden gerçek zamanlı, endojen geri bildirimler hakkında içgörüler sağlar. Bu protokol, deneylerden önce hangi malzemelerin hazırlanması gerektiğini özetler ve daha sonra zebra balığı larvalarının nasıl felç edileceğini ve hazırlanacağını açıklar. Protokol, afferent nöronların ve motor nöronların hücre dışı ventral kök (VR) kayıtlarının istikrarlı bir gevşek yama kaydının nasıl oluşturulacağını açıklayacaktır. Bu protokol kullanılarak elde edilebilen temsili veriler örnek bir bireyden sunulur ve deneysel protokolün birden fazla çoğaltması üzerinde analiz yapılır. Verilerin önceden işlenmesi MATLAB'da özel yazılı komut dosyaları kullanılarak gerçekleştirilir. Genel olarak, bu in vivo deneysel paradigma, model omurgalı saç hücresi sistemindeki hareket sırasında duyusal geri bildirimlerin daha iyi anlaşılmasını sağlamaya hazırdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL beaker</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>1000</td>
			<td>resceptacle for etchant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10xW</td>
			<td>low magnification for positioning larvae and recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td>higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>abfload.m</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffVR_preprocess.m</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB script for preprocessing recording data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC coaxial cables</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>2249-C-12</td>
			<td>connecting amplifier and digitizer channels; require 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries w/ filament</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150F-3</td>
			<td>inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>burst_detect</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>any computer should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Power Supply</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>72-420</td>
			<td>used for electrically etching dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophysiology digitizer</td>
			<td>Axon Instruments, Molecular Devices</td>
			<td>Axon DigiData 1440A</td>
			<td>enables acquisition of patch-clamp data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filament</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>FB255B</td>
			<td>2.5 mm box filament used in micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10</td>
			<td>used to manipulate larvae and insert pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixed stage DIC microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible, tapered pipette tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-169</td>
			<td>flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.</td>
			<td>FD3510-100</td>
			<td>cover glass bottomed dish recording dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipe</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>task wipe used for wicking away excess fluid from larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Gard</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.</td>
			<td>710172</td>
			<td>self-mixing sylgard elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2020b</td>
			<td>command line software for preprocessing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microelectrode amplifier</td>
			<td>Axon Instruments, Molecular Devices</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>patch clamp amplifier for dual channel recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830 microforge</td>
			<td>to polish recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator control unit</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MC1000-eR/T</td>
			<td>4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td>for pulling capillary glass into recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope control unit</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MC1000e</td>
			<td>positions the microscope around the fixed stage and preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motorized micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MX7600</td>
			<td>positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp Commander</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>2.2.2</td>
			<td>downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical air table</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>VH3036W-OPT</td>
			<td>breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>10.7.0</td>
			<td>downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition &#38; Analysis Software Download page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>permanent ink marker</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>order from amazon.com</td>
			<td>for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri-dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35-3001</td>
			<td>used to immerse larvae in paralytic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td>hold recording electrode and connect to the headstage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pneumatic transducer</td>
			<td>Fluke Biomedical Instruments</td>
			<td>DPM1B</td>
			<td>for controlling recording electrode internal pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>etchant for etching dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>14-169-1A</td>
			<td>tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spike_detect</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td>used to visualize pin tips and during preparation of larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight edge razor blade</td>
			<td>Canopus</td>
			<td>order from amazon.com</td>
			<td>cuts the tungsten wire while making dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swimbout_detect</td>
			<td></td>
			<td>supplemental coding file</td>
			<td>custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Becton Dickinson Compoany</td>
			<td>309602</td>
			<td>filled with extracellular solution to inject into recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z135003-500EA</td>
			<td>single use, non-sterile pipette for transfering larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>12854</td>
			<td>pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tungsten wire</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.</td>
			<td>715500</td>
			<td>0.002 inch, 50.8 &#956;m diameter; used to make dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum filtration unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCGVU11RE</td>
			<td>single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>voltage-clamp current-clamp headstage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV-7B</td>
			<td>supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1601</td>
			<td>for immobilizing the larvae prior to recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activity of posterior lateral line afferent neurons during swimming in zebrafish

Duyusal sistemler davranışları yönlendirmek için gerekli ipuçlarını toplar, ancak hayvanlar hangi bilgilerin biyolojik olarak ilgili olduğunu deşifre etmelidir. Locomotion, hayvanların çevredeki çevrenin ilgili duyusal ipuçlarından ayrılmaları gereken farklı ipuçları üretir. Örneğin, bir balık yüzdüğünde, vücut dalgalanmalarından oluşan akış, yanal çizgi sistemini oluşturan saç hücrelerinden oluşan mekanoresptif nöromstlar tarafından tespit edilir. Saç hücreleri daha sonra duyusal afferent nöronlar aracılığıyla sensörden beyne sıvı hareket bilgilerini iletir. Eş zamanlı olarak, sensörlü aşırı yüklemeyi önlemek için motor komutunun corollary deşarjı saç hücrelerine aktarılır. Bu nedenle, yanal hat sisteminin hassasiyetini değerlendirirken, locomotion sırasında tahmine dayalı motor sinyallerinin inhibitör etkisinin muhasebesi kritik öneme sahiptir. Zebra balığı larvalarında (döllenme sonrası 4-7 gün) posterior lateral çizgi afferent nöron ve ventral motor kök aktivitesini aynı anda izlemek için birkaç saat sürebilen in vivo elektrofizyolojik bir yaklaşım geliştirdik. Afferent nöronların hücre dışı kayıtları, tek veya birden fazla nörondan aktiviteyi algılayabilen gevşek yama kelepçe tekniği kullanılarak elde edilir. Motor nöron aktivitesini tespit etmek için cam elektrotlarla deriden ventral kök kayıtları yapılır. Deneysel protokolümüz, sağlam ve neşeli bir omurgalıda motor davranışlarda duyusal girişteki endojen veya çağrıştırılan değişiklikleri izleme potansiyeli sağlar.

Zebra balığı larvaları düzgün bir şekilde hareketsiz hale getirildikten ve arka lateral çizgi afferent ganglion ve VR kaydı elde edildikten sonra, hem afferent hem de motor nöronlardaki aktivite aynı anda ölçülebilir. Kayıt kanalları, kayıtsız ve VR etkinliğinin sürekli izlenmesi için boşluksuz kayıt protokolleri (adım 1.4) kullanılarak görüntülenir. Gerçek zamanlı olarak, spontan afferent ani artış oranındaki düşüşler, fiktif yüzme nöbetlerinin göstergesi olan VR aktivitesi ile e?...

Watch this Scientific Journal Video about Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish at JoVE.com

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Model omurgalı saç hücresi sisteminde motor komutlar sırasında afferent nöron aktiviteslerindeki değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklıyoruz.

Zebra Balıklarında Yüzme Sırasında Posterior Lateral Line Afferent Neurons'un Aktivitesi

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

Bu protokol, araştırmacının tek duyusal nöronların bozulmamış bir omurda kontrollü bir stimülasyona aktivitesini ve tepkisini izlemesini sağlar. Bu yama elektrofizyolojisi, bireysel nöronların artan aktivitesinden gerçek zamanlı olarak kayıt yapmanın hızlı ve doğrudan bir yoludur. Ve bu, çoğu optik görüntüleme tekniğinden daha düşük maliyetle daha iyi zaman çözünürlüğü ve hassasiyet sağlar.Yanal çizgi saç hücreleri insan iç kulağınınkine homologdur. Yani bu teknik, insan sağırlığı ve işitme bozuklukları için geçerli olan saç hücresi devrelerinin özelliklerini ortaya çıkarmak için hazırlanmıştır. Elektrofizyoloji, görülmesi ve fiziksel olarak taklit edilmesi gereken ince motor becerileri kullanan bir zanaattır.Metin yalnızca talimatlar yanlış yorumlama için çok fazla yer bırakır. Başlamak için, silikon elastomer alt kayıt kabı yapmak için Sylgard gibi kendi kendini karıştıran silikon elastomer ince bir tabaka bir kapak cam tabanlı doku kültürü çanak içine dağıtın. Diseksiyon pimleri yapmak için, bir DC güç kaynağı kullanarak 100 mililitrelik bir Etchant kabına beş volt negatif şarj sağlayın ve pozitif yüklü çıkışa bir tungsten teli takın.Ucu keskin bir noktaya daralıp gidene kadar telin ucunu tekrar tekrar Etchant banyosuna batırın. Stereo mikroskop altında, düz kenarlı bir jiletle teli ucundan yaklaşık bir milimetre kesin. Bunu üç kez tekrarlayın, ardından ince forseps kullanarak kürlenmiş kayıt kabına pimler yerleştirin.Kayıt elektrotları hazırlamak için, kutu filamentli bir mikropipette puller kullanarak borosilikat cam kılcal tüpleri çekin. Elektrot, arka lateral çizgiden afferent nöronları kaydetmek için kullanılacak bir konik ile 30 mikrometre çapında bir uluğa sahip olmalıdır. Ek bir borosilikat cam kılcal boru, daha küçük bir ila beş mikrometre uç çapına sahip bir çift elektrot içine çekin.Her elinde bir elektrot tutarak, uçları kırmak için uçları yavaşça birbirine doğru çalıştırın. Bir mikroforge kullanarak, eğimli ucu pürüzsüz olana kadar parlatın. Son uç çapı 30 ila 50 mikrometre arasında olmalıdır.Zebra balığı larvalarını hareketsiz hale getirmek ve pipet aktarmak için büyük bir uç kullanarak 35 milimetrelik bir petri kabına aktarın. Çevredeki çözeltinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Larvaları yaklaşık beş dakika boyunca% 0.1 alfa-Bungarotoxin'in 10 mikrolitresinde daldırin.Felçli larvaları hücre dışı çözelti ile 10 dakika yıkayın. Daha sonra, larvayı hücre dışı çözelti banyosundan silikon tabanlı kayıt kabına taşımak için bir transfer pipet kullanın. Stereo mikroskop altında, larvaları ince uçlu ön uçlarla bu silikon paspasın merkezinin üzerine, yanal tarafı vücudun ön ve arka uçları sola sağa doğru çalışırken hafifçe yerleştirin.İnce uçlu tokalar kullanarak, kenar pimini, larvaların dorsal notochord'u aracılığıyla silikona doğrudan anüse ortogonal olarak yerleştirin. İkinci pimi kuyruğun ucuna yakın notochord'dan yerleştirin ve üçüncü pimi gaz mesanesinin notochord dorsalına yerleştirin. Pim kapsüle takarken hafif bir dönüş sağlarken dördüncü pimi otik veziklikten takın.Hafif bir dönüş uygulandığında, afferent somata kümesini ortaya çıkarmak için klatrorum ve otik vezikül arasındaki dokuyu izleyin. Pim larvalarını DIC mikroskopunun sabit bir aşamasına 10 kat hedefin altına yerleştirin ve sol baş evre vektörüne paralel olarak kas bloklarının miyoseptal yarıklarını yönlendirin. Zemin telini banyo çözeltisine yerleştirin ve sol baş aşamasına bağlı olduğundan emin olun.VR kayıt elektrodunu esnek bir jel yükleme pipet ucu kullanarak 30 mikrolitre hücre dışı çözelti ile doldurun ve sol baş sahne pipet tutucusuna yerleştirin. Büyütmeyi 40 kata çıkarın ve bir pnömatik dönüştürücü tarafından üretilen pozitif basıncı uygularken kayıt pipetini bulaşık çözeltisine küçümseyin. Yarık VR elektrot ucu diyaframında ortalanana kadar elektrot ucunu iki miyomer ventral arasındaki bir mioseptum üzerinden yanal çizgiye getirin Uç diyaframının gecikme kenarı epitelle hafifçe temas edene kadar pipeti kütüğe diriltin.İlk temastan sonra, öndeki kenarın temas etmesini ve bir conta oluşturabilmesini sağlamak için pipeti çapraz olarak manevra yap. Pnömatik dönüştürücü ile negatif basınç uygulayın ve tutun. Yama kelepçe yazılımında, VR sinyalini izlemek için araç çubuğundaki Oynat düğmesine tıklayın.Wells stereotipli patlama sinyali dinamikleri ile motor nöron aktivitesi gözlendikten sonra VR kaydının sağlandığından emin olun. Farklı kayıt elektrotunun içini 30 mikrolitre hücre dışı çözelti ile doldurun ve sağ baş sahne pipet tutucusuna yerleştirin. Daha sonra pnömatik dönüştürücü tarafından üretilen pozitif basıncı uygularken bulaşık çözeltisine küçümser.Elektrot'u bulun ve elektrot ucunu numunenin üzerine getirin. Bir mikromanipülatör kullanarak, afferent elektrot ucunu klatronun üzerinde pozisyon tutana kadar küçümseyin. Büyütmeyi 40 kat daldırma için artırın ve arka lateral çizgi siniri ve klatromunun kesişimini bulun.Elektrot ucunu afferent ganglionun üzerine getirin ve uç epitelle temas edene kadar pipetleri küçümseyin. Yavaşça, elektrot manevrası yaparak tüm uç çevresinin afferent ganglionla temas ettiğini belirtin. Pnömatik dönüştürücü ile negatif basınç uygulayın ve tutun.Yama kelepçe yazılımında Oynat'a tıkladıktan sonra, ani artışlar kabaca her 100 ila 200 milisaniyede bir meydana geldiğinde, afferent nöronların tüm hücre gevşek yama kaydının elde edildiğinden emin olun. Afferent nöron ve motor nöron aktivitesi tespit edildikten sonra, her iki kanalda da eşzamanlı boşluksuz kayıtları yakalamak için tepe kelepçesi 10'daki araç çubuğundaki Kaydet düğmesine tıklayın. Metin taslağında açıklandığı gibi veri ön işleme gerçekleştirin.Bu boşluksuz kayıt protokolü kullanılarak, afferent ve VR nöronlarının gerçek zamanlı etkinliği aynı anda ölçülebilir. Özel yazılı, ön işleme komut dosyaları, eşik, minimum süre ve minimum ara aralık gibi parametreleri kullanarak ani algılamanın görselleştirilmesine yardımcı olacak çizimler oluşturur. İzole sinyaller, ön işleme komut dosyasındaki alt ve üst sınır algılama değişkenleri ayarlanarak elde edildi.Ventral kökler başak algılama ek girişler ile özdeş parametreleri izler. Bir motor komutundaki patlamalar, en az beş milisaniye süren 0,1 milisaniye içindeki en az iki ani artışla tanımlanır ve 200 milisaniyeden daha az patlama aralıklarıyla en az üç patlama ile tanımlanır Ön işleme komut dosyaları, iyi tanımlanmış bir ilgi süresine girilen farklı etkinliğin bölümlerini kaplar. Bu durumda, ortalama spontan aktivite, X ekseninde sıfıra eşit zaman olarak gösterilen motor aktivitenin başlangıcına yanıt olarak çarpıcı değişiklikler gösterir.Yüzme öncesi ani artış oranları ile hem yüzme hem de yüzme sonrası dönemlerin ani artış oranları arasında belirgin ani artış oranlarında anlamlı farklılıklar saptandı. Afferent ani artış oranları yüzme süresi ile negatif korelasyona uğramıştır. Göreceli yükselme hızı ve yüzme sıklığı arasında korelasyon saptanmamıştır.Bu prosedürü denerken hayvan sağlığı en önemli şeydir. Sadece hayvan refahını sağlamak için değil, aynı zamanda sinirsel kayıt başarısının olasılığını artırmak için hızlı kan akışını izlemek çok önemlidir. Zebra balığında bulunan genetik araçlardan yararlanarak, bu elektrofizyoloji protokolü, saç hücresi sistemlerinde ve ötesinde anatomik ve fonksiyonel devre bağlantısını güçlü bir şekilde araştırmak için transgenik çizgiler tarafından tamamlanabilir.Yama kelepçe tekniğinin bu basitleştirilmiş modifikasyonu, duyusal sistemlerin in vivo olarak nasıl çalıştığını izlememizi sağlar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Chef-tdTomato kullanarak Zebrafish Somatosensoriyel Nöron Optogenetic Etkinleştirme

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Transgenik Balık Sağlam Beyin Tespit Edilen nöronlar Elektrik Aktivitesi Kayıt

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Beyin Faaliyet Mesoscale Geniş alan Optik Görüntüleme için Büyük Yanal Kraniotomi Prosedürü

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Fare jejunal ve Kolon Segmentlerde Mezenterik Afferent Sinir Faaliyet Vitro kaydedilmesi

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Vitro Sıçanlarda kolon Afferent liflerinin Elektrofizyolojik özellikleri karakterizasyonu

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

Serbest Yüzme Balık hareketli Tetrodes tarafından Nöronların Kablosuz Elektrofizyolojik Kayıt

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...