Name: injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications
Uploaded: 2021-02-07T15:00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications at JoVE.com

Dit onderzoek werd financieel ondersteund door het Center for Human Systems Immunology met Bill &Melinda Gates Foundation (OPP1113682) en de Bill &Melinda Gates Foundation (OPP1211043). C.M.M. werd ondersteund door een Stanford Graduate Fellowship en de Stanford Bio-X William and Lynda Steere Fellowship. A.K.G. is dankbaar voor een National Science Foundation Graduate Research Fellowship en de Gabilan Fellowship van de Stanford Graduate Fellowship in Science and Engineering. S.C. werd ondersteund door het National Cancer Institute of the National Institutes of Health onder awardnummer F32CA247352. De auteurs willen ook appellableden, waaronder Dr. Gillie Roth, Dr. Anthony Yu, Dr. Lyndsay Stapleton, Dr. Hector Lopez Hernandez, Dr. Andrea d'Aquino, Dr. Julie Baillet, Celine Liong, Ben Ou, Emily Meany, Emily Gale en Dr. Anton Smith, hartelijk erkennen voor hun inspanningen en tijd om het Appel Lab te helpen deze protocollen door de jaren heen te ontwikkelen.

Deze auteurs hebben niets te onthullen.

Polymer-Nanoparticle (PNP) hydrogels zijn gemakkelijk te fabriceren en maken de langdurige lokale levering van therapeutische cellen en geneesmiddelen mogelijk door minimaal invasieve toediening via directe injectie of katheterafgifte. Deze protocollen beschrijven de formulering van PNP-hydrogels en de karakteriseringsmethoden om de kwaliteit van de resulterende materialen te garanderen. Supramoleculaire PNP-hydrogels zijn schaalbaar om te produceren en worden gevormd door het eenvoudig mengen van gemodificeerde cellulosepolymeren en polymere kernschilnanodeeltjes. De huidige methoden beschrijven facile procedures om gels te vormen die vooraf in spuiten zijn geladen door middel van eenvoudige elleboogmengprotocollen. Door middel van kwaliteitscontrolestatistieken van elk van de componenten, zoals DLS om de NP-grootte en -distributie te bewaken, kan men PNP-hydrogelmaterialen met consistente rheologische eigenschappen reproduceerbaar formuleren. Door de hoeveelheid HPMC-C12 of NPs te variëren, kan men de maaswijdte en stijfheid van de resulterende PNP-hydrogel moduleren. Deze eigenschappen kunnen worden afgestemd op het beste passen bij een bepaalde biomedische toepassing, en met de hier beschreven reologische methoden kunnen onderzoekers de afschuifverdunnende en zelfherstellende eigenschappen van PNP-hydrogels karakteriseren terwijl ze het platform optimaliseren voor hun specifieke toepassingen. Methoden voor in vitro release studies worden ook beschreven; onderzoekers kunnen deze studies gebruiken om de relatieve tijdschaal van afgifte van geneesmiddelen van belang te karakteriseren, waardoor toekomstige in vivo studies worden geïnformeerd. Met behulp van stabiliteitsstudies kunnen onderzoekers ook het vermogen van deze materialen beoordelen om de biologische structuur en stabiliteit van gevoelige biotherapeutica in de loop van de tijd en extreme temperaturen te helpen behouden, met overtuigende potentiële toepassingen om de afhankelijkheid van biotherapeutica in de koudeketen te verminderen. Ten slotte kunnen met eenvoudige cel levensvatbaarheidstesten celgroei en migratie binnen PNP-materialen worden geëvalueerd, met potentiële toepassingen in celtherapieën en steigers.
Onze groep heeft veel aantrekkelijke toepassingen gevonden voor het PNP hydrogel platform27. PNP-hydrogels zijn gebruikt voor langzame toediening van subeenheidvaccins, waardoor overeenkomende kinetische afgifteprofielen van antigenen en hulpstoffen de grootte, duur en kwaliteit van de humorale immuunrespons kunnen verhogen31. PNP-hydrogels blijken een kleinere maaswijdte te hebben dan de meest gebruikte hydrogels, dus ze zijn effectief in het vertragen van diffusie en het langzaam vrijgeven van moleculaire lading. De unieke weefselaanhechtingseigenschappen en mechanische eigenschappen van PNP-hydrogels zijn ook gebruikt om fysieke barrières te vormen om verklevingen als gevolg van chirurgie te voorkomen door de hydrogels na een operatie over grote oppervlakten van organen te spuiten30. PNP-hydrogels zijn ook effectief gebleken bij het leveren van cellen, en de mechanische eigenschappen beschermen cellen eigenlijk tegen de mechanische krachten die tijdens de injectie in de spuitnaald optreden, waardoor de levensvatbaarheid van de cellen wordt verbeterd29. Wanneer de NPs worden geconjugeerd met een celklevend peptide, kunnen cellen zich hechten en zich bezighouden met de PNP-matrix om levensvatbaar te blijven. Met behulp van deze aanpak is aangetoond dat PNP-hydrogels de lokale retentie van geïnjecteerde stamcellen verbeteren in vergelijking met methoden met vloeibare voertuigen28. Bovendien is aangetoond dat PNP-hydrogels thermisch geïnduceerde aggregatie van ingekapselde insuline voorkomen, zelfs onder zware stressomstandigheden, wat suggereert dat deze materialen de noodzaak om temperatuurgevoelige geneesmiddelen te koelen kunnen verminderen38.
Over het algemeen zullen de hier beschreven methodologieën onderzoeksgroepen in staat stellen PNP-hydrogels als biomateriaal te fabriceren en te verkennen. Deze protocollen bieden de synthesetechnieken op laboratoriumschaal om voldoende hydrogelmateriaal te fabriceren om zowel in vitro als in vivo studies uit te voeren. De hierboven beschreven studies geven aan dat de dynamische dwarskoppelingen van deze materialen het mogelijk maken om geschikt te zijn voor een reeks biomedische toepassingen door actieve beweeglijkheid van ingesloten cellen mogelijk te maken en tegelijkertijd passieve diffusie van moleculaire lading te beperken. Verwacht wordt dat onderzoekers het PNP-platform een toegankelijk en krachtig instrument zullen vinden om klinische resultaten te verbeteren door gecontroleerde medicijnafgifte en om fundamentele biologische mechanismen zoals celwerving en mechanobiologie te bestuderen.

Injecteerbare hydrogels zijn een opkomend hulpmiddel om therapeutische cellen en medicijnen op een gecontroleerde manier aan het lichaam te leveren1. Deze materialen kunnen worden geladen met medicijnen of cellen en kunnen op een minimaal invasieve manier worden toegediend door directe injectie op oppervlakkige weefsels of door katheterafgifte aan diepe weefsels. Over het algemeen bestaan injecteerbare hydrogels uit watergezwollen polymeernetwerken die met elkaar verbonden zijn door voorbijgaande, fysieke interacties. In rust zorgen deze crosslinks voor een vaste structuur aan de gels, maar bij toepassing van voldoende mechanische kracht worden deze crosslinks tijdelijk verstoord, waardoor het materiaal wordt omgezet in een vloeistofachtige toestand die gemakkelijk kan stromen2. Het zijn deze reologische eigenschappen die het mogelijk maken fysieke hydrogels te dun te scheren en door kleine naalddiameters te stromen tijdens injectie3. Na injectie herstelt het polymeernetwerk van het materiaal, waardoor het zichzelf kan genezen en snel een vaste gel kan vormen in situ4,5. Deze structuren kunnen fungeren als langzaam vrijkomende depots voor geneesmiddelen of steigers voor weefselregeneratie6,7. Deze materialen zijn gebruikt in diverse toepassingen die drugleveringstechnologie, regeneratieve geneeskunde, en immunoengineering1,8,9,10,11,12omvatten.
Zowel natuurlijke materialen (bijv. alginaat en collageen) als synthetische materialen (bv. poly(ethyleenglycol) (PEG) of soortgelijke hydrofiele polymeren) zijn ontwikkeld als biocompatibel injecteerbare hydrogelmaterialen13,14,15. Veel natuurlijke materialen vertonen batch-to-batch variatie die de reproduceerbaarheid beïnvloedt4,16. Deze materialen zijn vaak temperatuurgevoelig en genezen bij het bereiken van fysiologische temperaturen; het hanteren van deze materialen brengt dus extra technische en logistieke uitdagingen met zich mee17. Synthetische materialen zorgen voor een nauwkeurigere chemische controle en een uitstekende reproduceerbaarheid, maar deze materialen kunnen soms worden blootgesteld aan negatieve immuunresponsen die hun biocompatibiliteit beperken, een cruciaal kenmerk voor in vivo therapeutische toepassingen6,18,19. Recente inspanningen hebben aangetoond dat er veel complexe ontwerpcriteria zijn betrokken bij het ontwerpen van een injecteerbaar hydrogelmateriaal, waaronder het optimaliseren van mechanische eigenschappen, maaswijdte van het polymeernetwerk, bioactieve moleculaire signalen, biologische afbreekbaarheid en immunogeniciteit van het materiaal20,21,22,23,24,25,26. Al deze factoren moeten worden overwogen afhankelijk van de toepassing van interesse, wat betekent dat een modulair, chemisch afstembaar platform ideaal is om aan een breed scala aan toepassingen te voldoen.
De huidige methoden beschrijven de formulering en het gebruik van een injecteerbaar polymeer-nanodeeltje (PNP) hydrogelplatform dat afstembare mechanische eigenschappen, een hoge mate van biocompatibiliteit en lage immunogeniciteit vertoont en locaties presenteert voor het vervoegen van bioactieve moleculaire signalen27,28,29,30,31,32,33. Deze PNP-hydrogels zijn samengesteld uit hydrofobe gemodificeerde cellulosepolymeren en zelfgeassembleerde kernschilnanodeeltjes bestaande uit poly(ethyleenglycol)- blok-poly(melkzuur) (PEG-PLA)27,34 die interageren om een supramoleculair netwerk te produceren. Meer in het bijzonder werken de dodecyl-gemodificeerde hydroxypropylmethylcellulosepolymeren (HPMC-C12) dynamisch samen met het oppervlak van PEG-PLA nanodeeltjes en overbruggen ze tussen deze nanodeeltjes om dit polymeernetwerk te vormen27,34. Deze dynamische, multivalente interacties zorgen ervoor dat de materialen tijdens de injectie dunner worden en na toediening snel zelf genezen. De PNP-hydrogelcomponenten kunnen eenvoudig worden vervaardigd door eenvoudige eenpotreacties en de PNP-hydrogel wordt onder milde omstandigheden gevormd door eenvoudige menging van de twee componenten35. Door het fabricagegemak is dit hydrogel platform zeer vertaalbaar op schaal. De mechanische eigenschappen en maaswijdte van PNP-hydrogels worden gecontroleerd door het gewichtspercentage van de polymeer- en nanodeeltjescomponenten in de formulering te wijzigen. Eerdere studies met dit platform geven aan dat PNP-hydrogels zeer biocompatibel, biologisch afbreekbaar en niet-immunogeen28,30,31zijn . Over het algemeen bieden deze hydrogels een breed nut in biomedische toepassingen, waaronder postoperatieve hechtingspreventie, weefseltechnologie en regeneratie, aanhoudende medicijnafgifte en immunoengineering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td>PNP hydrogel injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G, 4 in hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>N224</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates, black, clear bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3540</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, black</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-627</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, clear</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8729K66</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>NP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR759015-100EA</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DynaPro II Plate Reader</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>300007-392 (EA)</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>8300015027</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer elbow connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30800-12</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-456</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Spatula</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1229F13</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>TS-RT2-100</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11382II</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>DHR-2 Rheometer</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516-5G</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications

Deze methoden beschrijven hoe injecteerbare, supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes (PNP) hydrogels kunnen worden geformuleerd voor gebruik als biomaterialen. PNP-hydrogels bestaan uit twee componenten: hydrofoob gemodificeerde cellulose als netwerkpolymeer en zelfgeassembleerde kernschilnanodeeltjes die fungeren als niet-covalente dwarsdoorsneden door dynamische, multivalente interacties. Deze methoden beschrijven zowel de vorming van deze zelfgeassembleerde nanodeeltjes door nanoprecipitatie als de formulering en het mengen van de twee componenten om hydrogels met afstembare mechanische eigenschappen te vormen. Het gebruik van dynamische lichtverstrooiing (DLS) en reologie om de kwaliteit van de gesynthetiseerde materialen te karakteriseren is ook gedetailleerd. Ten slotte wordt het nut van deze hydrogels voor medicijnafgifte, biofarmaceutische stabilisatie en celencapsulatie en -levering aangetoond door middel van in vitro experimenten om medicijnafgifte, thermische stabiliteit en celbezinking en levensvatbaarheid te karakteriseren. Vanwege de biocompatibiliteit, injecteerbaarheid en milde gelvormingsomstandigheden is dit hydrogelsysteem een gemakkelijk afstembaar platform dat geschikt is voor een reeks biomedische toepassingen.

PNP hydrogel fabricage en karakterisering PNP-hydrogels worden gevormd door het mengen van de twee primaire componenten - hydrofobe gemodificeerde HPMC-polymeren en PEG-PLA-nanodeeltjes (figuur 1a). Therapeutische lading kan het gemakkelijkst worden opgenomen in de extra buffer die wordt gebruikt om de nanodeeltjescomponent te verdunnen voorafgaand aan hydrogelpreparaat. Voor downstream biomedische karakterisering is het handig om een elleboogmengmethode te gebruiken die eenvoudige en reproduceerbare menging van de twee componenten mogelijk maakt (figuur 1b). Na voldoende mengen moet de hydrogel stevig aanvoelen in de spuit, maar onder druk produceren en extruderen uit een standaardnaald (21G afgebeeld) (figuur 1c). Na injectie moet de hydrogel snel worden omgezet in een vast materiaal dat bestand is tegen de zwaartekracht. Om de hydrogel volledig te karakteriseren en consistente batch-to-batch-producten te garanderen, moeten monsters worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimenten op een rheometer. De shear-thinning en zelfgenezend vermogen van de gel zal gemakkelijk worden waargenomen met behulp van een flow sweep protocol en step-shear protocol, respectievelijk(figuur 2a,b). Voor stijvere gels, zoals de 2:10-formulering, moet de gebruiker op zoek gaan naar viscositeit om ten minste twee ordes van grootte te verminderen tijdens de stroomveeg, omdat de afschuifsnelheid wordt verhoogd van 0,1 tot 100 s-1, wat de mechanische omstandigheden tijdens de injectie simuleert. Het step-shear protocol moet een orde-van-grootte afname van de viscositeit onder de high-shear stappen onthullen, en een snelle terugkeer (<5 s hersteltijd) naar baseline viscositeit tijdens de lage afschuifstappen. Karakterisering van de opslag- en verliesmoduli met behulp van een oscillatoire afschuiffrequentieveegexperiment in het lineaire visco-elastische regime moet solide eigenschappen onthullen bij frequentiebereiken van 0,1-100 rad s-1 (Figuur 2c). In het bijzonder mag er meestal geen cross-over van de afschuifopslag en verliesmoduli zijn die waarneembaar is bij lage frequenties voor stijvere formuleringen zoals de 2:10 hydrogels. Een dergelijke crossover-gebeurtenis kan wijzen op problemen in de kwaliteit van de uitgangsmaterialen, hetzij het gemodificeerde HPMC- of PEG-PLA-polymeer, hetzij de grootte en dispersie van de PEG-PLA-nanodeeltjes. Opgemerkt moet worden dat een crossover-gebeurtenis kan worden verwacht voor zwakkere hydrogelformuleringen, zoals de 1:5 hydrogel. Oscillatoire schuifamplitudes op PNP-hydrogels laten zien dat de materialen pas opbrengen als hoge spanningswaarden zijn toegepast, wat aangeeft dat deze materialen een opbrengstspanning hebben, een drempelhoeveelheid stress die nodig is om het materiaal te laten stromen.
Kenmerkende releasekinetiek van PNP hydrogels Een essentiële stap in het ontwerpen van PNP-gels voor medicijnafgifte is de karakterisering van kinetiek van medicijnafgifte uit een gekozen formulering. Hiervoor zijn verschillende technieken, maar een eenvoudige in vitro methodologie levert nuttige gegevens op tijdens de vroege ontwikkeling van formuleringen (figuur 3a). Het variëren van het polymeergehalte van de PNP-hydrogels door het moduleren van de hoeveelheid HPMC-C12 of NPs is de meest eenvoudige manier om de mechanische eigenschappen en maaswijdte van deze hydrogels af te stemmen, wat een directe invloed kan hebben op de diffusie van lading door het polymeernetwerk en de snelheid van afgifte uit de materialen (figuur 3b). Voor lading die groter is dan de dynamische maaswijdte (d.w.z. hoog moleculair gewicht of grote hydrodynamische straal), moeten onderzoekers een langzame, oplossingsgemedieerde afgifte van lading uit het hydrogeldepot verwachten. Formuleringen met dynamische maaswijdten groter dan of gelijk aan de grootte van de lading maken diffusiegemedieerde vrijgave mogelijk die kan worden beschreven met behulp van traditionele modellen van ladingdiffusie en vrijgave46,47,48,49. Op basis van de vorm van de releasecurve kunnen onderzoekers de hydrogel herformuleren om deze langzamer af te stemmen (bijv. het polymeergehalte verhogen) of sneller (bijv. het polymeergehalte verlagen).
Beoordeling van de stabiliteit van therapeutische lading Het bepalen van de stabiliteit van de therapeutische lading in een hydrogelformulering is van cruciaal belang voordat wordt beginnen met preklinische of cellulaire studies. In vergelijking met andere synthetische methoden voor het inkapselen van drugs, nemen PNP-hydrogels lading op een zachte manier op door zich in het bulkmateriaal te mengen, en het is onwaarschijnlijk dat inkapseling de lading zal beschadigen. Deze studies tonen aan dat PNP-hydrogels ook lading kunnen stabiliseren die gevoelig is voor thermische instabiliteit, zoals insuline, waardoor de houdbaarheid aanzienlijk wordt verlengd en de afhankelijkheid van koude opslag en distributie wordt verminderd (figuur 4). Het is belangrijk om de toestand van de lading onmiddellijk na inkapseling in de hydrogel en na langere opslagperioden te evalueren. Deze gegevens tonen aan dat insuline stabiel blijft in hydrogels na 28 dagen opslag onder continue thermische en mechanische stress, met behulp van een eenvoudige fluorescentietest voor het meten van insulineaggregatie. Een alternatieve techniek voor gevallen waarin een geschikte plaattest niet beschikbaar is, zou zijn om circulaire dichroïsmemetingen van de lading uit te voeren, wat met name nuttig is voor het bepalen van de secundaire structuur van eiwitgeneesmiddelen.
Bepalen van cel levensvatbaarheid en dispersie in PNP hydrogels Veel therapeutische cellen vereisen hechtingsmotieven om levensvatbaar te blijven, en dus is het opnemen van integrinmotieven zoals arginine-glycine-asparaginezuur (RGD) peptiden een belangrijke stap in het aanpassen van PNP-hydrogels voor cellulaire therapieën50. Het modulaire PEG-PLA polymeer bestaande uit de NPs maakt chemische functionalisering van de PEG corona mogelijk door middel van eenvoudige "click" chemie28,51. In dit voorbeeld werden cellijme RGD-peptiden bevestigd aan het PEG-PLA-polymeer om celbetrokkenheid met de PNP-hydrogelstructuur te bevorderen. Formuleringen zonder hechtingsplaatsen zullen een lage levensvatbaarheid van cellen hebben, aangezien ingekapselde cellen zich niet verspreiden in vergelijking met cellen die zijn ingekapseld in formuleringen met deze adhesiemotieven (figuur 5a, b). Ingekapselde cellen kunnen worden gelabeld met calceïne AM of een andere geschikte fluorescerende kleurstof (bijv. CFSE) om het tellen van cellen met een fluorescentiemicroscoop te vergemakkelijken. Tijdens optimalisatie moet de levensvatbaarheid worden vergeleken met ongewijzigde PNP-hydrogels om ervoor te zorgen dat integrin-gefunctionaliseerde formuleringen zorgen voor een verbeterde levensvatbaarheid en proliferatie. Als integrin-gefunctionaliseerde formuleringen vergelijkbare werkzaamheid bieden als ongewijzigde hydrogels, kan dit wijzen op een falen in de vervoegingschemie die wordt gebruikt om de hechtingsmotieven op te nemen.
Onderzoekers moeten verwachten dat ingekapselde cellen gelijkmatig worden verspreid door het hydrogelmedium bij gebruik van een geschikte hydrogelformulering. Dit maakt een consistente en voorspelbare dosering van cellen tijdens de toediening van hydrogel mogelijk en moet zich vertalen in lokale retentie van cellen in de hydrogel na toediening. De verdeling van cellen kan eenvoudig worden bepaald met behulp van fluorescentiemicroscopietechnieken. Cellen kunnen worden gelabeld met een geschikte kleurstof en vervolgens worden afgebeeld met confocale microscopie. De beelden kunnen visueel (figuur 5c) en ook kwantitatief (figuur 5d) worden beoordeeld met behulp van ImageJ-software om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit langs de verticale as van het beeld te meten (of langs welke as celbezinking als gevolg van de zwaartekracht wordt verwacht). Als de hydrogelformulering te zwak is om de cellen gedurende langere tijd in suspensie te ondersteunen, zal celbezinking optreden, zoals waargenomen in de 1:1-formulering in figuur 5. Het verhogen van het polymeergehalte kan problemen met inhomogene celdispersie als gevolg van vestiging oplossen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig1v4.jpg"> Figuur 1: Polymeer-nanodeeltjes (PNP) hydrogels kunnen gemakkelijk worden gevormd door twee componenten te mengen. (a) De eerste component is een oplossing van dodecyl-gemodificeerde hydroxypropylmethylcellulose (HPMC-C12), en de tweede component is een oplossing van poly(ethyleenglycol)-blok-poly (melkzuur) (PEG-PLA) nanodeeltjes samen met elke therapeutische lading. Zachte menging van deze twee componenten levert een injecteerbare hydrogel op, waarbij de HPMC-C12 polymeren fysiek worden gekruist door dynamische, multivalente interacties met de PEG-PLA nanodeeltjes. (b) Foto die gelformulering demonstreert door te mengen met twee spuiten, elk met één component van de PNP-hydrogel. Door de twee spuiten aan te sluiten op een Luer-lock elleboogconnector, kunnen de twee componenten gemakkelijk worden gemengd onder steriele omstandigheden om een bubbelvrije hydrogel te produceren die vooraf in een spuit is geladen voor onmiddellijk gebruik. De NP-oplossing is blauw geverfd voor demonstratie. c) Demonstratie van de injectie van PNP-hydrogels en de restolling daarvan. i) PNP-hydrogel in een spuit met een bijgevoegde 21G-naald. ii) Injectie plaatst de hydrogel onder afschuiving die tijdelijk de interacties tussen polymeer en nanodeeltjes breekt, waardoor een vloeistofachtige consistentie ontstaat. (iii) Na de injectie veranderen de dynamische polymeer-nanodeeltjes interacties snel, waardoor de hydrogel zichzelf kan genezen tot een vaste stof. iv) De vaste hydrogel stroomt niet onder krachten die zwakker zijn dan de opbrengstspanning, zoals zwaartekracht. De PNP hydrogel is blauw geverfd ten behoeve van demonstratie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig2v3.jpg"> Figuur 2: Rheologische karakterisering van twee PNP hydrogelformuleringen. Formuleringen worden aangeduid als polymeer wt.%: NP wt.%. (a) De constante afschuifstroom veegt van lage naar hoge afschuifsnelheid van PNP-hydrogels. Viscositeit als functie van afschuifsnelheid kenmerkt afschuifverdunnende eigenschappen. (b) Viscositeit als functie van oscillerende afschuifsnelheden tussen lage afschuifsnelheden (witte achtergrond; 0,1 s−1) tot hoge afschuifsnelheden (rode achtergrond; 10 s−1) die zelfherstellende eigenschappen van PNP-hydrogels aantonen. Afschuiftarieven worden opgelegd voor 30 s per stuk. (c) Elastische opslagmodulus G′ en viskeuze verliesmodulus G" als functie van de frequentie bij een constante stam van 1% voor verschillende PNP-hydrogelformuleringen. (d) Amplitude veegt met een constante frequentie van 10 rad/s om elastische opslagmodulus G′ en viskeuze verliesmodulus G" van PNP-hydrogels te karakteriseren als functie van stress. Deze reologische karakterisering kan worden gebruikt als vergelijking voor kwaliteitscontrole. Dit cijfer is aangepast van Grosskopf et al.28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2.jpg"> Figuur 3: In vitro afgifte van runderserumalbumine (BSA) uit PNP-hydrogels. Formuleringen worden aangeduid als polymeer wt.%: NP wt.%. a) Schematisch beschrijven van het experimentele protocol voor in-vitro-afgifte. Aliquots worden na verloop van tijd uit PNP hydrogel-geladen capillaire buizen verwijderd. b)de in-vitro-afgifte van BSA van 1:10 PNP, 2:5 PNP en 2:10 PNP gerapporteerd als de massa die wordt verzameld door het opgegeven tijdstip gedeeld door de totale massa die tijdens de test is verzameld (gegevens die worden weergegeven als gemiddelde ± SD; n = 3). BSA werd gedetecteerd door absorptiemetingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2.jpg"> Figuur 4: Thermische stabiliteit van insuline ingekapseld in PNP-hydrogels door ThT-test. Formuleringen worden aangeduid als polymeer wt.%: NP wt.%. Insuline ingekapseld in zowel 1:5 als 2:10 PNP hydrogel bleef gedurende meer dan 28 dagen niet samengevoegd bij stressverouderingscondities van 37 °C en constante agitatie. De tijd tot aggregatie voor insuline geformuleerd in PBS was 20 ± 4 uur (gemiddelde ± SD, aggregatiedrempel 750.000 AFU). Gegevens gepresenteerd als gemiddeld n = 4 experimentele replica's (AFU, willekeurige fluorescentie-eenheden). Deze figuur is aangepast van Meis et al.38<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2.jpg"> Figuur 5: Levensvatbaarheid van cellen en celbezinking in PNP-hydrogels. (a,b) Cel levensvatbaarheidsstudies in PNP-hydrogels met menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC's). a) Representatieve afbeeldingen van levensvatbare hMSC's in 1:5 PNP-hydrogels met en zonder het cellijme arginine-glycine-asparaginezuur (RGD) motief vervoegd met de PEG-PLA NPs. hMSC's werden gedurende 30 minuten vóór confocale beeldvorming calceïnebeitst. Schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm. (b) Levensvatbaarheid van cellen op dag 6 gedefinieerd als aantal fluorescerende cellen in de afbeelding ten opzichte van het aantal fluorescerende cellen op dag 1 (gegevens weergegeven als gemiddelde ± SD; n = 3). c,d) Cel inkapseling en het regelen van experimenten met hMSC's. (c) Beelden met maximale intensiteit van calceine AM-bevlekte hMSC's ingekapseld in 1:1 PNP hydrogel (bovenste rij) en 1:5 PNP hydrogel (onderste rij) gedurende 4 uur om celbezinking te kwantificeren. Schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm. (d) Gemiddelde horizontale pixelintensiteit van hMSC's langs het verticale profiel van de hydrogel. Dit cijfer is aangepast van Grosskopf et al.28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications at JoVE.com

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

Dit protocol beschrijft de synthese en formulering van injecteerbare, supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes (PNP) hydrogel biomaterialen. Toepassingen van deze materialen voor medicijnafgifte, biofarmaceutische stabilisatie en celencapsulatie en -levering worden gedemonstreerd.

Injecteerbare supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes hydrogels voor cel- en medicijnafgiftetoepassingen

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

Ons protocol vergemakkelijkt de formulering van polymeer-nanodeeltjes hydrogels voor gebruik als biomaterialen. We hopen dat onderzoekers dit materiaal zullen ontwikkelen voor translationele toepassingen en om fundamentele biologische vragen te verkennen. PNP hydrogels worden gemakkelijk geïnjecteerd door naalden en katheters met een kleine diameter, maar genezen snel zelf na injectie.Dit maakt de niet-invasieve gecontroleerde levering van geneesmiddelen en cellen over lange tijdschalen mogelijk. Deze technologie verlegt de grenzen voor gelokaliseerde therapie en uitgebreide medicijnafgifte, met implicaties voor brede razende aandoeningen van kanker tot weefselregeneratie tot passieve immunisatie. Om nanodeeltjes te synthetiseren door nanoprecipitatie, voegt u 50 milligram PEG-PLA-polymeer toe aan een glazen scintillatieflacon van acht milliliter en voegt u één milliliter acetonitril toe aan de flacon.Vortex om volledig op te lossen. Voeg vervolgens 10 milliliter ultrazuiver water toe aan een glazen scintillatieflacon van 20 milliliter met een kleine roerstaaf en plaats de flacon op een roerplaat die is ingesteld op 600 omwentelingen per minuut. Gebruik een pipet van 200 microliter om een milliliter polymeeroplosmiddeloplossing druppelgewijs aan de flacon water toe te voegen.Kern-shell nanodeeltjes zullen zich vormen als de polymeer oplosmiddeloplossing snel wordt verspreid door het water. Controleer de deeltjesgrootte door dynamische lichtverstrooiing volgens standaardprotocollen. Breng vervolgens de nanodeeltjesoplossing over in een centrifugaalfiltereenheid om de oplossing te concentreren op minder dan 250 microliter en de nanodeeltjes in een geschikte buffer te resuspeneren.Om de hydrogel te bereiden, voegt u 333 milligram 6% HPMC-C12-voorraadoplossing toe aan een Luer-slotspuit van één milliliter en voegt u 500 microliter van de 20% nanodeeltjesvoorraadoplossing en 167 microliter PBS toe aan een flacon van acht milliliter. Gebruik na het mengen een naald om nog een luer-slotspuit van een milliliter te vullen met de verdunde nanodeeltjesoplossing en bevestig de twee spuiten aan een elleboogmixer. Meng de twee oplossingen gedurende ongeveer 60 cycli tot er een homogeen, ondoorzichtig wit hydrogelmateriaal is gevormd.Om de rheologische eigenschappen van de geformuleerde hydrogel te meten, injecteert u het juiste volume hydrogel volgens de geselecteerde geometrieopening in het midden van een gekartelde rheometerplaat en gebruikt u oscillatie- en stroomtests om de mechanische eigenschappen van het monster te meten. Om de afgifte van geneesmiddelen uit de hydrogel te karakteriseren, bereidt u eerst een glazen haarvaten voor met behulp van epoxy om het ene uiteinde van elke buis af te dichten. Wanneer de epoxy is ingesteld, gebruikt u een 4-inch 22 gauge injectienaald om 100 tot 200 microliter hydrogel in minimaal drie buizen per monster te injecteren en voeg voorzichtig 200 tot 300 microliter PBS toe aan elk volume hydrogel.Gebruik op de juiste tijdstippen, volgens de verwachte tijdschaal van het vrijkomen van geneesmiddelen, een naald om de PBS voorzichtig uit elk capillair te verwijderen zonder het hydrogeloppervlak te verstoren en een nieuw volume PBS toe te voegen. Analyseer aan het einde van het onderzoek de verzamelde PBS-aliquots met een geschikte methode om de hoeveelheid geneesmiddel te kwantificeren die op elk moment vrijkomt. Om de thermische stabiliteit van gel ingekapselde insuline te karakteriseren, laadt u zowel insuline als thioflavine T in de hydrogel zoals aangetoond en gebruikt u een naald van 21 gauge om 200 microliters van de lading en sonde geladen hydrogel in ten minste drie putten van een zwarte 96-put plaat per monster te injecteren.Sluit de plaat vervolgens af met een optisch heldere zelfklevende plaatafdichting om verdamping te voorkomen en plaats de plaat in een plaatlezer die is uitgerust met temperatuurregeling, schudden en een kinetische leesprogrammering. Om de levensvatbaarheid van de hydrogel ingekapselde cellen te beoordelen, gebruikt u een naald met een 21 meter om 150 microliter hydrogel met de juiste concentratie cellen in elk van de drie putten per monster te injecteren in een heldere bodemplaat van 96 putten en voegt u 100 microliters van het juiste celmedium toe aan elk volume hydrogel. Vervang op de eerste dag van de kweek het supernatant op elke hydrogel op het juiste tijdstip voor elke monstergroep door 50 microliter calceïne AM-oplossing van twee millimolar.Na een incubatie van 30 minuten, beeld het centrum van elke put door confocale microscopie. Om het vermogen van de ingekapselde cellen om zich vóór injectie in een spuit te nestelen te evalueren, verdunt u de cellen van belang tot een maal 10 tot de zes cellen per milliliter in PBS-concentratie en bevlekt u de cellen met 50 microliter van twee millimolar Calcein AM gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Meng aan het einde van de incubatie de cellen met 500 tot 700 microliter hydrogel zoals aangetoond en gebruik een naald van 21 gauge om 100 tot 200 microliter celhoudende hydrogel in de bodem van ten minste één cuvette per monster te injecteren.Stel vervolgens de cuvetten die plat op hun zijkanten liggen op het podium van een confocale microscoop onmiddellijk na injectie en op één en vier uur na het zaaien in beeld om te zien of de cellen zich in de hydrogel hebben gevestigd of dat ze zijn blijven hangen. De afschuifverdunning en zelfherstellend vermogen van de gel kunnen worden waargenomen met behulp van respectievelijk flow sweep- en step-shear-protocollen. Karakterisering van de opslag- en verliesmoduli met behulp van een oscillatoire shear frequency sweep experiment in het lineaire visco-elastische regime met frequentiebereiken van 0,1 tot 100 radialen per seconde onthult de vaste eigenschappen.Er mag meestal geen crossover van de afschuifopslag en verliesmoduli worden waargenomen bij lage frequenties voor stijvere formuleringen, terwijl crossover-gebeurtenissen kunnen worden verwacht voor een zwakkere hydrogelformulering. Het variëren van het polymeergehalte van de PNP-hydrogels kan een directe invloed hebben op de verspreiding van lading via het polymeernetwerk en de snelheid van afgifte uit de materialen. PNP-hydrogels kunnen ook lading stabiliseren die gevoelig is voor thermische instabiliteit, waardoor de houdbaarheid van de lading aanzienlijk wordt verlengd en de afhankelijkheid van opslag en distributie van koudeketens wordt verminderd.De opname van integrin motieven kan nuttig zijn voor het aanpassen van PNP hydrogels voor cellulaire therapieën. Ingekapselde cellen kunnen fluorescerend worden gelabeld om hun visualisatie en kwantificering te vergemakkelijken. Formuleringen zonder hechtingsplaatsen zullen bijvoorbeeld een lage levensvatbaarheid van cellen hebben, omdat ingekapselde cellen zich niet verspreiden in vergelijking met ingekapselde cellen en formuleringen met adhesiemotieven, zoals RGD.We onderzoeken nog steeds hoe veranderingen in de formulering de rheologische kenmerken en het dynamische gaas van de polymeermatrix beïnvloeden. We gebruiken FRAP ook om de diffusie van moleculen in de hydrogel te bestuderen. Deze materialen kunnen worden gebruikt om nieuwe biologische vragen te stellen over hoe aanhoudende toediening de levering van geneesmiddelen, de ontwikkeling van vaccins of kankerimmunotherapie kan beïnvloeden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modellen en methoden om vervoer van Drug Delivery Systems Across Cellular Barrières Evalueer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Een injecteerbare en-Drug geladen Supramoleculaire Hydrogel voor Local Catheter injectie in de Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

De synthese van RGD-gefunctionaliseerde Hydrogels als een instrument voor therapeutische toepassingen

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Light-gemedieerde Vorming en patroonvorming van hydrogels voor Cultuur van de Cel Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Fabricage en Drug Delivery Toepassingen van Silk Nanodeeltjes

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Mesenchymale stromale Cell Cultuur en Levering in autologe Voorwaarden: een slimme aanpak voor orthopedische toepassingen

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...