Name: injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications
Uploaded: 2021-02-07T15:00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue financièrement par le Center for Human Systems Immunology avec la Fondation Bill &Melinda Gates (OPP1113682) et la Fondation Bill &Melinda Gates (OPP1211043). C.M.M. a été soutenu par une bourse d’études supérieures de Stanford et la bourse William et Lynda Steere de Stanford Bio-X. A.K.G. est reconnaissant pour une bourse de recherche supérieure de la National Science Foundation et la bourse Gabilan de la bourse d’études supérieures stanford en sciences et en ingénierie. S.C. a été soutenu par le National Cancer Institute des National Institutes of Health sous le numéro de bourse F32CA247352. Les auteurs tiennent également à remercier chaleureusement les membres d’Appel Lab, y compris le Dr Gillie Roth, le Dr Anthony Yu, le Dr Lyndsay Stapleton, le Dr Hector Lopez Hernandez, le Dr Andrea d’Aquino, la Dre Julie Baillet, Céline Liong, Ben Ou, Emily Meany, Emily Gale et le Dr Anton Smith, pour les efforts et le temps qu’ils ont consacrés à aider l’Appel Lab à élaborer ces protocoles au fil des ans.

Ces auteurs n’ont rien à divulguer.

Les hydrogels de polymères-nanoparticules (PNP) sont facilement fabriqués et permettent l’administration locale à long terme de cellules thérapeutiques et de médicaments par administration mini-invasive par injection directe ou par cathéter. Ces protocoles décrivent la formulation des hydrogels PNP et les méthodes de caractérisation pour assurer la qualité des matériaux résultants. Les hydrogels de PNP supramoléculaires sont évolutifs à fabriquer et sont formés par le simple mélange de polymères de cellulose modifiés et de nanoparticules polymères noyau-enveloppe. Les méthodes actuelles décrivent des procédures faciles pour former des gels préchargés dans des seringues grâce à de simples protocoles de mélange de coude. Grâce à des mesures de contrôle de la qualité de chacune des composantes, telles que DLS pour surveiller la taille et la distribution np, on peut formuler de manière reproductible des matériaux d’hydrogel PNP avec des propriétés rhéologiques cohérentes. En faisant varier la quantité de HPMC-C12 ou de NPs, on peut moduler la taille du maillage et la rigidité de l’hydrogel PNP résultant. Ces propriétés peuvent être réglées pour convenir au mieux à une application biomédicale particulière, et avec les méthodes rhéologiques détaillées ici, les chercheurs peuvent caractériser les propriétés de cisaillement-amincissement et d’auto-guérison des hydrogels PNP car ils optimisent la plate-forme pour leurs applications spécifiques. Les méthodes d’études de libération in vitro sont également décrites; les chercheurs peuvent utiliser ces études pour caractériser l’échelle de temps relative de libération des médicaments d’intérêt, en éclairant les futures études in vivo. À l’aide d’études de stabilité, les chercheurs peuvent également évaluer la capacité de ces matériaux à aider à préserver la structure biologique et la stabilité des produits biothérapeutiques sensibles au fil du temps et des températures extrêmes, avec des applications potentielles convaincantes pour réduire la dépendance de la chaîne du froid des biothérapeutiques. Enfin, avec des tests de viabilité cellulaire simples, la croissance et la migration cellulaires dans les matériaux PNP peuvent être évaluées, avec des applications potentielles dans les thérapies cellulaires et les échafaudages.
Notre groupe a trouvé de nombreuses applications convaincantes pour la plate-forme d’hydrogel PNP27. Les hydrogels PNP ont été utilisés pour ralentir l’administration des vaccins sous-unitaires, permettant des profils de libération cinétique appariés d’antigènes et d’adjuvants pour augmenter l’ampleur, la durée et la qualité de la réponse immunitaire humorale31. Les hydrogels PNP se sont avérés avoir un maillage plus petit que les hydrogels les plus couramment utilisés, ils sont donc efficaces pour ralentir la diffusion et libérer lentement la cargaison moléculaire. Les propriétés uniques d’adhérence tissulaire et les propriétés mécaniques des hydrogels PNP ont également été utilisées pour former des barrières physiques afin de prévenir les adhérences résultant de la chirurgie en pulvérisant les hydrogels sur de grandes surfaces d’organes après la chirurgie30. Les hydrogels PNP se sont également avérés être des véhicules d’administration de cellules efficaces, et les propriétés mécaniques protègent en fait les cellules des forces mécaniques survenant dans l’aiguille de la seringue pendant l’injection, améliorant la viabilité cellulaire29. Lorsque les IP sont conjugués avec un peptide adhésif cellulaire, les cellules peuvent se fixer et s’engager avec la matrice PNP pour rester viables. En utilisant cette approche, il a été démontré que les hydrogels PNP améliorent la rétention locale des cellules souches injectées par rapport aux méthodes utilisant des véhicules liquides28. En outre, il a été démontré que les hydrogels PNP empêchent l’agrégation thermiquement induite de l’insuline encapsulée, même dans des conditions de vieillissement stressées sévères, ce qui suggère que ces matériaux peuvent être en mesure de réduire la nécessité de réfrigérer les médicaments sensibles à la température38.
Dans l’ensemble, les méthodologies décrites ici permettront aux groupes de recherche de fabriquer et d’explorer les hydrogels PNP en tant que biomatériaux. Ces protocoles fournissent les techniques de synthèse à l’échelle du laboratoire pour fabriquer suffisamment de matériel d’hydrogel pour poursuivre des études in vitro et in vivo. Les études décrites ci-dessus indiquent que les réticulations dynamiques de ces matériaux lui permettent d’être adapté à une gamme d’applications biomédicales en permettant la motilité active des cellules piégées tout en limitant la diffusion passive de la cargaison moléculaire. On s’attend à ce que les chercheurs trouvent la plateforme PNP un outil accessible et puissant pour améliorer les résultats cliniques grâce à l’administration contrôlée de médicaments et pour étudier les mécanismes biologiques de base tels que le recrutement cellulaire et la mécanobiologie.

Les hydrogels injectables sont un outil émergent pour fournir des cellules thérapeutiques et des médicaments à l’organisme de manière contrôlée1. Ces matériaux peuvent être chargés de médicaments ou de cellules et peuvent être administrés d’une manière minimalement invasive par injection directe dans les tissus superficiels ou par l’administration de cathéter aux tissus profonds. En général, les hydrogels injectables sont composés de réseaux polymères gonflés à l’eau qui sont réticulés entre eux par des interactions physiques transitoires. Au repos, ces réticulations fournissent une structure solide aux gels, mais lors de l’application d’une force mécanique suffisante, ces réticulations sont temporairement perturbées, transformant le matériau en un état de type liquide qui peut facilement s’écouler2. Ce sont ces propriétés rhéologiques qui permettent aux hydrogels physiques de s’amenuiser et de s’écouler à travers de petits diamètres d’aiguille lors de l’injection3. Après injection, le réseau polymère du matériau se reforme, lui permettant de s’auto-guérir et de former rapidement un gel in situ de type solide4,5. Ces structures peuvent agir comme des dépôts à libération lente pour les médicaments ou des échafaudages pour la régénération tissulaire6,7. Ces matériaux ont été utilisés dans diverses applications englobant la technologie d’administration de médicaments, la médecine régénérative et l’immunoingénierie1,8,9,10,11,12.
Des matériaux naturels (par exemple, l’alginate et le collagène) et des matériaux synthétiques (par exemple, le poly(éthylène glycol) (PEG) ou des polymères hydrophiles similaires) ont été développés en tant que matériaux hydrogel injectables biocompatibles13,14,15. De nombreux matériaux naturels présentent des variations de lot à lot affectant la reproductibilité4,16. Ces matériaux sont souvent sensibles à la température, durcissant lorsqu’ils atteignent des températures physiologiques; ainsi, la manipulation de ces matériaux pose des défis techniques et logistiques supplémentaires17. Les matériaux synthétiques permettent un contrôle chimique plus précis et une excellente reproductibilité, mais ces matériaux peuvent parfois être soumis à des réponses immunitaires défavorables qui limitent leur biocompatibilité, une caractéristique critique pour les applications thérapeutiques in vivo6,18,19. Des effortsrécents ont montré qu’il existe de nombreux critères de conception complexes impliqués dans l’ingénierie d’un matériau hydrogel injectable, y compris l’optimisation des propriétés mécaniques, la taille du maillage du réseau polymère, les indices moléculaires bioactifs, la biodégradabilité et l’immunogénicité du matériau20,21,22, 23,24,25,26. Tous ces facteurs doivent être pris en compte en fonction de l’application d’intérêt, ce qui signifie qu’une plate-forme modulaire et réglable chimiquement est idéale pour satisfaire un large éventail d’applications.
Les présentes méthodes décrivent la formulation et l’utilisation d’une plateforme injectable polymère-nanoparticule (PNP) d’hydrogel qui présente des propriétés mécaniques accordables, un degré élevé de biocompatibilité et une faible immunogénicité, et présente des sites de conjugaison des indices moléculaires bioactifs27,28,29,30,31,32,33. Ces hydrogels PNP sont composés de polymères de cellulose modifiés hydrophobement et de nanoparticulesnoyau-enveloppe auto-assemblées comprenant du poly(éthylène glycol)- bloc-poly(acide lactique) (PEG-PLA)27,34 qui interagissent pour produire un réseau supramoléculaire. Plus précisément, les polymères d’hydroxypropylméthylcellulose modifiés par dodécyle (HPMC-C12) interagissent dynamiquement avec la surface des nanoparticules de PEG-PLA et font le pont entre ces nanoparticules pour former ce réseau polymère27,34. Ces interactions dynamiques et multivalentes permettent aux matériaux de s’amincir pendant l’injection et de s’auto-guérir rapidement après l’administration. Les composants de l’hydrogel PNP sont facilement fabriqués par de simples réactions à un pot et l’hydrogel PNP est formé dans des conditions douces par simple mélange des deux composants35. En raison de la facilité de fabrication, cette plate-forme d’hydrogel est hautement traduisible à grande échelle. Les propriétés mécaniques et la taille du maillage des hydrogels PNP sont contrôlées en modifiant le pourcentage en poids des composants polymères et nanoparticulaires dans la formulation. Des études antérieures avec cette plate-forme indiquent que les hydrogels PNP sont hautement biocompatibles, biodégradables et non immunogènes28,30,31. Dans l’ensemble, ces hydrogels présentent une grande utilité dans les applications biomédicales englobant la prévention de l’adhérence postopératoire, l’ingénierie tissulaire et la régénération, l’administration soutenue de médicaments et l’immuno-ingénierie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td>PNP hydrogel injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G, 4 in hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>N224</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates, black, clear bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3540</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, black</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-627</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, clear</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8729K66</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>NP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR759015-100EA</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DynaPro II Plate Reader</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>300007-392 (EA)</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>8300015027</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer elbow connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30800-12</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-456</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Spatula</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1229F13</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>TS-RT2-100</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11382II</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>DHR-2 Rheometer</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516-5G</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications

Ces méthodes décrivent comment formuler des hydrogels de polymères-nanoparticules (PNP) supramoléculaires injectables destinés à être utilisés comme biomatériaux. Les hydrogels PNP sont composés de deux composants : la cellulose modifiée hydrophobement en tant que polymère de réseau et les nanoparticules noyau-enveloppe auto-assemblées qui agissent comme des réticulateurs non covalents grâce à des interactions dynamiques et multivalentes. Ces méthodes décrivent à la fois la formation de ces nanoparticules auto-assemblées par nanoprécipitation ainsi que la formulation et le mélange des deux composants pour former des hydrogels aux propriétés mécaniques accordables. L’utilisation de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) et de la rhéologie pour caractériser la qualité des matériaux synthétisés est également détaillée. Enfin, l’utilité de ces hydrogels pour l’administration de médicaments, la stabilisation biopharmaceutique, l’encapsulation cellulaire et l’administration est démontrée par des expériences in vitro pour caractériser la libération de médicaments, la stabilité thermique, ainsi que le tassement et la viabilité cellulaires. En raison de sa biocompatibilité, de son injectabilité et de ses conditions de formation de gel doux, ce système d’hydrogel est une plate-forme facilement accordable adaptée à une gamme d’applications biomédicales.

Fabrication et caractérisation de l’hydrogel PNP Les hydrogels PNP sont formés par le mélange des deux composants primaires - les polymères HPMC modifiés hydrophobement et les nanoparticules de PEG-PLA(Figure 1a). La cargaison thérapeutique est plus facilement incorporée dans le tampon supplémentaire utilisé pour diluer le composant nanoparticulaire avant la préparation de l’hydrogel. Pour la caractérisation biomédicale en aval, il est pratique d’utiliser une méthode de mélange de coude qui permet un mélange simple et reproductible des deux composants(figure 1b). Après un mélange adéquat, l’hydrogel doit se sentir ferme dans la seringue, mais céder sous pression et extruder à partir d’une aiguille standard (21G montré) (Figure 1c). Après l’injection, l’hydrogel doit rapidement se fixer dans un matériau solide qui résiste à l’écoulement de la gravité. Pour caractériser pleinement l’hydrogel et assurer la cohérence des produits de lot à lot, les échantillons doivent être analysés à l’aide de plusieurs expériences différentes sur un rhéomètre. Les capacités de cisaillement-amincissement et d’auto-guérison du gel seront facilement observées à l’aide d’un protocole de balayage d’écoulement et d’un protocole de cisaillement par étapes, respectivement(figure 2a,b). Pour les gels plus rigides, tels que la formulation 2:10, l’utilisateur doit rechercher une viscosité pour diminuer d’au moins deux ordres de grandeur pendant le balayage de l’écoulement car le taux de cisaillement est augmenté de 0,1 à 100 s-1, ce qui simule les conditions mécaniques lors de l’injection. Le protocole de cisaillement par étapes devrait révéler une diminution d’un ordre de grandeur de la viscosité sous les étapes de cisaillement élevé et un retour rapide (temps de récupération de <5 s) à la viscosité de base pendant les étapes de cisaillement faible. La caractérisation des modules de stockage et de perte à l’aide d’une expérience de balayage de fréquence de cisaillement oscillatoire dans le régime viscoélastique linéaire devrait révéler des propriétés de type solide à des gammes de fréquences allant de 0,1 à 100 rad s-1 (figure 2c). En particulier, il ne devrait généralement pas y avoir de croisement des modules de stockage et de perte de cisaillement observable à basse fréquence pour des formulations plus rigides comme les hydrogels 2:10. Un tel événement croisé peut indiquer des problèmes dans la qualité des matériaux de départ, soit le polymère HPMC ou PEG-PLA modifié, soit la taille et la dispersion des nanoparticules de PEG-PLA. Il convient de noter qu’un événement croisé peut être attendu pour les formulations d’hydrogel plus faibles, telles que l’hydrogel 1:5. Les balayages de l’amplitude de cisaillement oscillatoire sur les hydrogels PNP révèlent que les matériaux ne cèdent pas tant que des valeurs de contrainte élevées ne sont pas appliquées, indiquant que ces matériaux possèdent une limite d’élasticité, une quantité seuil de contrainte requise pour que le matériau s’écoule.
Caractérisation de la cinétique de libération des hydrogels de PNP Une étape essentielle dans la conception de gels PNP pour l’administration de médicaments est la caractérisation de la cinétique de libération de médicaments à partir d’une formulation choisie. Il existe plusieurs techniques pour cela, mais une méthodologie in vitro simple fournit des données utiles lors du développement précoce de la formulation (Figure 3a). La variation de la teneur en polymère des hydrogels PNP par modulation de la quantité de HPMC-C12 ou de NPs est le moyen le plus simple d’ajuster les propriétés mécaniques et la taille du maillage de ces hydrogels, ce qui peut avoir un impact direct sur la diffusion de la cargaison à travers le réseau polymère et le taux de libération des matériaux(Figure 3b). Pour la cargaison qui est plus grande que le maillage dynamique (c.-à-d. poids moléculaire élevé ou grand rayon hydrodynamique), les chercheurs doivent s’attendre à un rejet lent et médié par la dissolution de la cargaison du dépôt d’hydrogel. Les formulations avec des maillages dynamiques supérieurs ou égaux à la taille de la cargaison permettront une libération médiée par diffusion qui peut être décrite à l’aide des modèles traditionnels de diffusion et de libération de la cargaison46,47,48,49. En fonction de la forme de la courbe de libération, les chercheurs peuvent reformuler l’hydrogel pour l’ajuster vers une libération plus lente (p. ex., augmenter la teneur en polymère) ou plus rapide (p. ex., diminuer la teneur en polymère).
Évaluation de la stabilité de la cargaison thérapeutique Déterminer la stabilité de la cargaison thérapeutique dans une formulation d’hydrogel est essentiel avant de commencer des études précliniques ou cellulaires. Par rapport à d’autres méthodes synthétiques d’encapsulation des médicaments, les hydrogels PNP incorporent la cargaison en douceur en se mélangeant dans le matériau en vrac, et il est peu probable que l’encapsulation endommage la cargaison. Ces études indiquent que les hydrogels PNP peuvent également stabiliser la cargaison qui est sensible à l’instabilité thermique, comme l’insuline, prolongeant considérablement la durée de conservation et réduisant la dépendance à l’entreposage frigorifique et à la distribution(figure 4). Il est important d’évaluer l’état de la cargaison immédiatement après l’encapsulation dans l’hydrogel ainsi qu’après de longues périodes de stockage. Ces données montrent que l’insuline reste stable dans les hydrogels après 28 jours de stockage sous contrainte thermique et mécanique continue, en utilisant un test de fluorescence simple pour mesurer l’agrégation de l’insuline. Une autre technique pour les cas où un dosage approprié sur plaque n’est pas disponible serait d’effectuer des mesures de dichroïsme circulaire de la cargaison, ce qui est particulièrement utile pour déterminer la structure secondaire des médicaments protéiques.
Détermination de la viabilité et de la dispersion des cellules dans les hydrogels de PNP De nombreuses cellules thérapeutiques nécessitent des motifs d’adhésion pour rester viables, et donc l’inclusion de motifs d’intégrine comme les peptides d’acide arginine-glycine-aspartique (RGD) est une étape importante dans l’adaptation des hydrogels PNP pour les thérapies cellulaires50. Le polymère modulairePEG-PLAcomprenant les PN permet la fonctionnalisation chimique de la couronne PEG par de simples chimies « clic »28,51. Dans cet exemple, des peptides RGD adhésifs cellulaires ont été attachés au polymère PEG-PLA pour favoriser l’engagement cellulaire avec la structure de l’hydrogel PNP. Les formulations dépourvues de sites d’adhésion auront une faible viabilité cellulaire car les cellules encapsulées ne prolifèrent pas par rapport aux cellules encapsulées dans des formulations avec ces motifs d’adhésion(figure 5a,b). Les cellules encapsulées peuvent être étiquetées avec de la calcéne AM ou un autre colorant fluorescent approprié (p. ex., CFSE) pour faciliter le comptage cellulaire avec un microscope à fluorescence. Au cours de l’optimisation, la viabilité doit être comparée aux hydrogels de PNP non modifiés pour s’assurer que les formulations fonctionnalisées par l’intégrine offrent une viabilité et une prolifération accrues. Si les formulations intégrin-fonctionnalisées offrent une efficacité similaire à celle des hydrogels non modifiés, cela peut indiquer un échec de la chimie de conjugaison utilisée pour incorporer les motifs d’adhésion.
Les chercheurs devraient s’attendre à ce que les cellules encapsulées soient dispersées uniformément à travers le milieu hydrogel lorsqu’ils utilisent une formulation d’hydrogel appropriée. Cela permettra un dosage cohérent et prévisible des cellules pendant l’administration d’hydrogel et devrait se traduire par une rétention locale des cellules dans l’hydrogel après l’administration. La distribution des cellules peut être facilement déterminée à l’aide de techniques de microscopie à fluorescence. Les cellules peuvent être étiquetées avec un colorant approprié, puis iées à l’aide de la microscopie confocale. Les images peuvent être évaluées visuellement(figure 5c)et aussi quantitativement(figure 5d)à l’aide du logiciel ImageJ pour mesurer l’intensité moyenne de fluorescence le long de l’axe vertical de l’image (ou le long de l’axe de stabilisation cellulaire dû à la gravité). Si la formulation d’hydrogel est trop faible pour soutenir les cellules en suspension sur des périodes prolongées, la décantation cellulaire se produira, comme observé dans la formulation 1:1 de la figure 5. L’augmentation de la teneur en polymère peut résoudre les problèmes de dispersion des cellules non homogènes dus à la décantation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig1v4.jpg"> Figure 1: Leshydrogels polymères-nanoparticules (PNP) se forment facilement en mélangeant deux composants. (a) Le premier composant est une solution d’hydroxypropylméthylcellulose modifiée par dodécyle (HPMC-C12)et le second composant est une solution de nanoparticules de poly(éthylène glycol)-bloc-poly(acide lactique) (PEG-PLA) avec toute cargaison thérapeutique. Le mélange doux de ces deux composants donne un hydrogel injectable, où les polymères HPMC-C12 sont physiquement réticulés par des interactions dynamiques et multivalentes avec les nanoparticules de PEG-PLA. b)Photographie démontrant la formulation du gel par mélange avec deux seringues, chacune contenant un composant de l’hydrogel PNP. En connectant les deux seringues avec un connecteur de coude Luer-lock, les deux composants peuvent être facilement mélangés dans des conditions stériles pour donner un hydrogel sans bulles préchargé dans une seringue pour une utilisation immédiate. La solution NP est teintée en bleu à des fins de démonstration. c)Démonstration de l’injection d’hydrogels PNP et de leur re-solidification. i) Hydrogel PNP dans une seringue munie d’une aiguille 21G attachée. ii) L’injection place l’hydrogel sous cisaillement qui rompt temporairement les interactions entre le polymère et les nanoparticules, créant ainsi une consistance semblable à celle d’un fluide. (iii) Après l’injection, les interactions dynamiques polymère-nanoparticule se reforment rapidement, permettant à l’hydrogel de s’auto-guérir en un solide. iv) L’hydrogel solide ne s’écoule pas sous des forces plus faibles que sa limite d’élasticité, telles que la gravité. L’hydrogel PNP est teinté en bleu à des fins de démonstration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig2v3.jpg"> Figure 2: Caractérisation rhéologique de deux formulations d’hydrogel PNP. Les formulations sont notées polymère en poids.%: NP en poids.%. (a)Le flux de cisaillement constant balaie du taux de cisaillement faible à élevé des hydrogels PNP. La viscosité en fonction du taux de cisaillement caractérise les propriétés de cisaillement-amincissement. b)Viscosité en fonction des taux de cisaillement oscillants entre de faibles taux de cisaillement (fond blanc; 0,1 s−1)et des taux de cisaillement élevés (fond rouge; 10 s−1)démontrant les propriétés auto-cicatrisantes des hydrogels PNP. Les taux de cisaillement sont imposés pour 30 s chacun. (c)Module de stockage élastique G′et module de perte visqueux G" en fonction de la fréquence à une déformation constante de 1% pour diverses formulations d’hydrogel PNP. (d)L’amplitude balaie à une fréquence constante de 10 rad/s pour caractériser le module de stockage élastique G′et le module de perte visqueux G »des hydrogels PNP en fonction de la contrainte. Cette caractérisation rhéologique peut être utilisée comme comparaison pour le contrôle de la qualité. Ce chiffre a été adapté de Grosskopf et al.28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2.jpg"> Figure 3: Libération in vitro d’albumine sérique bovine (BSA) à partir d’hydrogels PNP. Les formulations sont notées polymère en poids.%: NP en poids.%. (a) Schéma décrivant le protocole expérimental de libération in vitro. Les aliquotes sont retirées des tubes capillaires chargés d’hydrogel PNP au fil du temps. b)La libération in vitro de BSA à partir de 1:10 PNP, 2:5 PNP et 2:10 PNP rapporté comme étant la masse collectée par le point de temps spécifié divisée par la masse totale recueillie au cours de l’essai (données indiquées en moyenne ± ET; n = 3). BSA a été détecté par des mesures d’absorbance. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2.jpg"> Figure 4: Stabilité thermique de l’insuline encapsulée dans des hydrogels PNP par dosage ThT. Les formulations sont notées polymère en poids.%: NP en poids.%. L’insuline encapsulée dans l’hydrogel PNP 1:5 et 2:10 est restée non aggréguée pendant plus de 28 jours à des conditions de vieillissement stressées de 37 °C et à une agitation constante. Le temps à l’agrégation pour l’insuline formulée dans pbs était 20 ± 4 h (écart-type moyen ±, seuil d’agrégation 750.000 AFU). Données présentées en moyenne de n = 4 répétitions expérimentales (AFU, unités de fluorescence arbitraires). Ce chiffre a été adapté de Meis et al.38<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2.jpg"> Figure 5: Viabilité cellulaire et décantation cellulaire dans les hydrogels PNP. (a,b) Études de viabilité cellulaire dans les hydrogels PNP avec des cellules souches mésenchymateuses humaines (HMSC). (a) Images représentatives de hMSCs viables dans 1:5 hydrogels de PNP avec et sans le motif cellule-adhésif d’arginine-glycine-acide aspartique (RGD) conjugué au PEG-PLA NPs. hMSCs ont été calcein-souillés pendant la minute 30 avant la formation image confocale. La barre d’échelle représente 100 μm.(b)Viabilité cellulaire au jour 6 définie comme le nombre de cellules fluorescentes dans l’image par rapport au nombre de cellules fluorescentes au jour 1 (données présentées comme moyenne ± l’écart-type; n = 3). (c,d) Expériences d’encapsulation et de règlement cellulaires avec des hMSCs. c) Images d’intensité maximale de hMSCs colorés en calcine AM encapsulés dans de l’hydrogel PNP 1:1 (rangée du haut) et de l’hydrogel PNP 1:5 (rangée du bas) sur 4 heures pour quantifier le tassement cellulaire. La barre d’échelle représente 1 mm.(d)L’intensité moyenne en pixels horizontaux des HMSC le long du profil vertical de l’hydrogel. Ce chiffre a été adapté de Grosskopf et al.28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications at JoVE.com

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

Ce protocole décrit la synthèse et la formulation de biomatériaux injectables supramoléculaires d’hydrogel polymère-nanoparticule (PNP). Les applications de ces matériaux pour l’administration de médicaments, la stabilisation biopharmaceutique, l’encapsulation cellulaire et l’administration sont démontrées.

Hydrogels supramoléculaires injectables de polymères-nanoparticules pour les applications cellulaires et d’administration de médicaments

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

Notre protocole facilite la formulation d’hydrogels polymères-nanoparticules pour une utilisation comme biomatériaux. Nous espérons que les chercheurs développeront ce matériel pour des applications translationnelles et pour explorer les questions biologiques de base. Les hydrogels PNP sont facilement injectés par des aiguilles et des cathéters de petit diamètre, mais s’auto-guérissent rapidement après l’injection.Cela permet l’administration contrôlée non invasive de médicaments et de cellules sur de longues échelles de temps. Cette technologie repousse les limites d’un traitement localisé et d’une libération prolongée de médicaments, avec des implications pour de vastes conditions déchaînées allant du cancer à la régénération des tissus en passant par l’immunisation passive. Pour synthétiser des nanoparticules par nano précipitation, ajoutez 50 milligrammes de polymère PEG-PLA à un flacon de scintillation en verre de huit millilitres et ajoutez un millilitre d’acétonitrile au flacon.Vortex à dissoudre complètement. Ajoutez ensuite 10 millilitres d’eau ultra pure à un flacon de scintillation en verre de 20 millilitres avec une petite barre d’agitation et placez le flacon sur une plaque d’agitation réglée à 600 tours par minute. Utilisez une pipette de 200 microlitres pour ajouter un millilitre de la solution de solvant polymère goutte à goutte dans le flacon d’eau.Des nanoparticules noyau-enveloppe se formeront lorsque la solution de solvant polymère sera rapidement dispersée dans l’eau. Vérifiez la taille des particules par diffusion dynamique de la lumière selon les protocoles standard. Ensuite, transférez la solution de nanoparticules dans une unité de filtre centrifuge pour concentrer la solution sur moins de 250 microlitres et ressuscitez les nanoparticules dans un tampon approprié.Pour préparer l’hydrogel, ajoutez 333 milligrammes de solution mère HPMC-C12 à 6% à une seringue à verrouillage Luer d’un millilitre et ajoutez 500 microlitres de la solution mère de nanoparticules à 20% et 167 microlitres de PBS à un flacon de huit millilitres. Après le mélange, utilisez une aiguille pour remplir une autre seringue luer millilitre avec la solution de nanoparticules diluée et fixez les deux seringues à un mélangeur de coude. Mélanger les deux solutions pendant environ 60 cycles jusqu’à ce qu’un matériau d’hydrogel blanc homogène et opaque se soit formé.Pour mesurer les propriétés rhéologiques de l’hydrogel formulé, injectez le volume approprié d’hydrogel en fonction de l’écart de géométrie sélectionné au centre d’une plaque de rhéomètre dentelée et utilisez des tests oscillatoires et d’écoulement pour mesurer les propriétés mécaniques de l’échantillon. Pour caractériser la libération de médicament de l’hydrogel, tout d’abord, préparer un capillaire en verre en utilisant de l’époxy pour sceller une extrémité de chaque tube. Lorsque l’époxy est réglé, utilisez une aiguille hypodermique de calibre 22 de quatre pouces pour injecter 100 à 200 microlitres d’hydrogel dans un minimum de trois tubes par échantillon, et ajoutez soigneusement 200 à 300 microlitres de PBS sur chaque volume d’hydrogel.Aux moments appropriés, selon l’échelle de temps prévue pour la libération du médicament, utilisez une aiguille pour retirer soigneusement le PBS de chaque capillaire sans perturber la surface de l’hydrogel et ajouter un nouveau volume de PBS. À la fin de l’étude, analyser les aliquotes du PBS recueillies à l’aide d’une méthode appropriée pour quantifier la quantité de médicament libérée à chaque moment. Pour caractériser la stabilité thermique de l’insuline encapsulée en gel, chargez à la fois l’insuline et la thioflavine T dans l’hydrogel comme démontré et utilisez une aiguille de calibre 21 pour injecter 200 microlitres de la cargaison et sondez l’hydrogel chargé dans au moins trois puits d’une plaque noire de 96 puits par échantillon.Ensuite, scellez la plaque avec un joint de plaque adhésive optiquement claire pour éviter l’évaporation et insérez la plaque dans un lecteur de plaque équipé d’un contrôle de la température, d’une secousse et d’une programmation de lecture cinétique. Pour évaluer la viabilité des cellules encapsulées par hydrogel, utilisez une aiguille de calibre 21 pour injecter 150 microlitres d’hydrogel contenant la concentration appropriée de cellules dans chacun des trois puits par échantillon dans une plaque claire de 96 puits et ajoutez 100 microlitres du milieu cellulaire approprié dans chaque volume d’hydrogel. Le premier jour de la culture, remplacer le surnageant sur chaque hydrogel au point de temps approprié pour chaque groupe d’échantillon par 50 microlitres de deux solution millimolaires de calcine AM.Après une incubation de 30 minutes, imagez le centre de chaque puits par microscopie confocale. Pour évaluer la capacité des cellules encapsulées à se déposer dans une seringue avant l’injection, diluer les cellules d’intérêt à un fois 10 aux six cellules par millilitre en concentration de PBS et colorer les cellules avec 50 microlitres de deux calcines millimolaires AM pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, mélanger les cellules avec 500 à 700 microlitres d’hydrogel comme démontré et utiliser une aiguille de calibre 21 pour injecter 100 à 200 microlitres de cellules contenant de l’hydrogel dans le fond d’au moins une cuvette par échantillon.Ensuite, imaginez les cuvettes à plat sur le côté sur la scène d’un microscope confocal immédiatement après l’injection et à une et quatre heures après l’ensemencement pour observer si les cellules se sont déposées dans l’hydrogel ou si elles sont restées en suspension. Les capacités d’amincissement par cisaillement et d’auto-guérison du gel peuvent être observées à l’aide de protocoles de balayage d’écoulement et de cisaillement par étapes, respectivement. La caractérisation des modules de stockage et de perte à l’aide d’une expérience de balayage de fréquence de cisaillement oscillatoire dans le régime viscoélastique linéaire à des gammes de fréquences de 0,1 à 100 radians par seconde révèle les propriétés solides.Il ne devrait généralement pas y avoir de croisement des modules de stockage et de perte de cisaillement observés à basse fréquence pour des formulations plus rigides, tandis que des événements de croisement peuvent être attendus pour des formulations d’hydrogel plus faibles. La variation de la teneur en polymère des hydrogels PNP peut avoir un impact direct sur la diffusion de la cargaison à travers le réseau polymère et le taux de libération des matériaux. Les hydrogels PNP peuvent également stabiliser les cargaisons sensibles à l’instabilité thermique, prolongeant considérablement la durée de conservation de la cargaison et réduisant la dépendance à l’égard du stockage et de la distribution de la chaîne du froid.L’inclusion de motifs d’intégrine peut être utile pour adapter des hydrogels de PNP pour des thérapies cellulaires. Les cellules encapsulées peuvent être étiquetées par fluorescence pour faciliter leur visualisation et leur quantification. Par exemple, les formulations dépourvues de sites d’adhésion auront une faible viabilité cellulaire car les cellules encapsulées ne prolifèrent pas par rapport aux cellules encapsulées et aux formulations avec des motifs d’adhésion, telles que RGD.Nous explorons toujours comment les changements dans la formulation affectent les caractéristiques rhéologiques et le maillage dynamique de la matrice polymère. Nous utilisons également le FRAP pour étudier la diffusion des molécules dans l’hydrogel. Ces documents peuvent être utilisés pour poser de nouvelles questions biologiques sur la façon dont l’administration prolongée pourrait affecter l’administration de médicaments, la mise au point de vaccins ou l’immunothérapie du cancer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Recherche

Bio-ingénierie

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modèles et méthodes pour évaluer le transport des Drug Delivery Systems à travers les barrières cellulaires

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Un supramoléculaire hydrogel injectable and Drug-chargé pour cathéter locale injection dans le Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

La Synthèse des RGD-fonctionnalisé hydrogels comme un outil pour les applications thérapeutiques

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Formation et Patterning Light-médiée hydrogels pour la culture cellulaire Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Fabrication and Drug Delivery Applications de soie Nanoparticules

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Mésenchymateuses stromales Culture cellulaire et livraison dans des conditions autologues: Une approche intelligente pour les applications orthopédiques

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues 3D pour thérapie régénérative Injectable et de dépistage des drogues de haut débit

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...