Name: injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications
Uploaded: 2021-02-07T15:00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications at JoVE.com

Diese Forschung wurde vom Center for Human Systems Immunology mit der Bill & Melinda Gates Foundation (OPP1113682) und der Bill & Melinda Gates Foundation (OPP1211043) finanziell unterstützt. C.M.M. wurde durch ein Stanford Graduate Fellowship und das Stanford Bio-X William and Lynda Steere Fellowship unterstützt. A.K.G. ist dankbar für ein National Science Foundation Graduate Research Fellowship und das Gabilan Fellowship des Stanford Graduate Fellowship in Science and Engineering. S.C. wurde vom National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Award-Nummer F32CA247352 unterstützt. Die Autoren möchten auch den Mitgliedern des Appel Lab, darunter Dr. Gillie Roth, Dr. Anthony Yu, Dr. Lyndsay Stapleton, Dr. Hector Lopez Hernandez, Dr. Andrea d'Aquino, Dr. Julie Baillet, Celine Liong, Ben Ou, Emily Meany, Emily Gale und Dr. Anton Smith, herzlich für ihre Bemühungen und Ihre Zeit danken, die sie dem Appel Lab bei der Entwicklung dieser Protokolle im Laufe der Jahre geholfen haben.

Diese Autoren haben nichts zu enthüllen.

Polymer-Nanopartikel-Hydrogele (PNP) sind leicht herzustellen und ermöglichen die langfristige lokale Abgabe therapeutischer Zellen und Medikamente durch minimalinvasive Verabreichung durch Direkteinspritzung oder Katheterabgabe. Diese Protokolle beschreiben die Formulierung von PNP-Hydrogelen und die Charakterisierungsmethoden zur Qualitätssicherung der resultierenden Materialien. Supramolekulare PNP-Hydrogele sind skalierbar und werden durch einfaches Mischen von modifizierten Cellulosepolymeren und polymeren Kern-Schalen-Nanopartikeln gebildet. Die vorliegenden Methoden beschreiben einfache Verfahren zur Bildung von Gelen, die in Spritzen durch einfache Ellenbogenmischprotokolle vorgeladen sind. Durch Qualitätskontrollmetriken jedes der Komponenten, wie DLS zur Überwachung der NP-Größe und -Verteilung, kann man PNP-Hydrogelmaterialien mit konsistenten rheologischen Eigenschaften reproduzierbar formulieren. Durch Variation der Menge an HPMC-C12 oder NPs kann man die Maschenweite und Steifigkeit des resultierenden PNP-Hydrogels modulieren. Diese Eigenschaften können optimal auf eine bestimmte biomedizinische Anwendung abgestimmt werden, und mit den hier beschriebenen rheologischen Methoden können die Forscher die scherverdünnenden und selbstheilenden Eigenschaften von PNP-Hydrogelen charakterisieren, da sie die Plattform für ihre spezifischen Anwendungen optimieren. Methoden für In-vitro-Freisetzungsstudien werden ebenfalls beschrieben; Forscher können diese Studien verwenden, um die relative Zeitskala der Freisetzung von Medikamenten von Interesse zu charakterisieren und zukünftige In-vivo-Studien zu informieren. Mithilfe von Stabilitätsstudien können Forscher auch die Fähigkeit dieser Materialien bewerten, die biologische Struktur und Stabilität empfindlicher Biotherapeutika über Zeit und extreme Temperaturen zu erhalten, mit überzeugenden potenziellen Anwendungen, um die Kühlkettenabhängigkeit von Biotherapeutika zu reduzieren. Schließlich können mit einfachen Zelllebensfähigkeitstests das Zellwachstum und die Migration innerhalb von PNP-Materialien bewertet werden, mit potenziellen Anwendungen in Zelltherapien und Gerüsten.
Unsere Gruppe hat viele überzeugende Anwendungen für die PNP-Hydrogel-Plattform27gefunden. PNP-Hydrogele wurden für die langsame Verabreichung von Untereinheitenimpfstoffen verwendet, die übereinstimmende kinetische Freisetzungsprofile von Antigenen und Adjuvantien ermöglichen, um das Ausmaß, die Dauer und die Qualität der humoralen Immunantwort zu steigern31. Es wurde festgestellt, dass PNP-Hydrogele eine kleinere Maschenweite haben als die am häufigsten verwendeten Hydrogele, so dass sie die Diffusion verlangsamen und molekulare Fracht langsam freisetzen. Die einzigartigen Gewebeadhärenzeigenschaften und mechanischen Eigenschaften von PNP-Hydrogelen wurden auch verwendet, um physikalische Barrieren zu bilden, um Adhäsionen zu verhindern, die durch operationale Entstehen, indem die Hydrogele nach der Operation über große Oberflächen von Organen gesprüht werden30. PNP-Hydrogele haben sich auch als effektive Zellabgabevehikel erwiesen, und die mechanischen Eigenschaften schützen die Zellen tatsächlich vor den mechanischen Kräften, die während der Injektion in der Spritzennadel auftreten, was die Zelllebensfähigkeit verbessert29. Wenn die NPs mit einem zelladhäsiven Peptid konjugiert werden, können sich Die Zellen an die PNP-Matrix anheften und mit ihr interagieren, um lebensfähig zu bleiben. Mit diesem Ansatz wurde gezeigt, dass PNP-Hydrogele die lokale Retention von injizierten Stammzellen im Vergleich zu Methoden mit flüssigen Vehikeln verbessern28. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass PNP-Hydrogele die thermisch induzierte Aggregation von verkapseltem Insulin auch unter harten stressbelasteten Alterungsbedingungen verhindern, was darauf hindeutet, dass diese Materialien in der Lage sein könnten, die Notwendigkeit zu reduzieren, temperaturempfindliche Medikamente zukühlen 38.
Insgesamt werden die hier beschriebenen Methoden es Forschungsgruppen ermöglichen, PNP-Hydrogele als Biomaterial herzustellen und zu erforschen. Diese Protokolle bieten die Synthesetechniken im Labormaßstab, um genügend Hydrogelmaterial herzustellen, um sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Studien durchzuführen. Die oben beschriebenen Studien deuten darauf hin, dass die dynamische Vernetzung dieser Materialien es ermöglicht, für eine Reihe von biomedizinischen Anwendungen geeignet zu sein, indem sie die aktive Motilität von eingefangenen Zellen ermöglichen und gleichzeitig die passive Diffusion molekularer Fracht einschränken. Es wird erwartet, dass die Forscher die PNP-Plattform als ein zugängliches und leistungsfähiges Werkzeug zur Verbesserung der klinischen Ergebnisse durch kontrollierte Medikamentenabgabe und zur Untersuchung grundlegender biologischer Mechanismen wie Zellrekrutierung und Mechanobiologie finden werden.

Injizierbare Hydrogele sind ein aufstrebendes Werkzeug, um therapeutische Zellen und Medikamente kontrolliert an den Körper zu liefern1. Diese Materialien können mit Medikamenten oder Zellen beladen und minimalinvasiv durch direkte Injektion in oberflächliches Gewebe oder durch Katheterabgabe an tiefe Gewebe verabreicht werden. Im Allgemeinen bestehen injizierbare Hydrogele aus wassergeschwollenen Polymernetzwerken, die durch transiente, physikalische Wechselwirkungen miteinander vernetzt sind. Im Ruhezustand verleihen diese Vernetzungen den Gelen eine feststoffähnliche Struktur, aber bei Anwendung ausreichender mechanischer Kraft werden diese Vernetzungen vorübergehend gestört und das Material in einen flüssigkeitsähnlichen Zustand umgewandelt, der leicht fließen kann2. Es sind diese rheologischen Eigenschaften, die es physikalischen Hydrogelen ermöglichen, während der Injektion zu scheren und durch kleine Nadeldurchmesser zu fließen3. Nach der Injektion reformiert sich das Polymernetzwerk des Materials, so dass es sich selbst heilen und schnell ein feststoffähnliches Gel in situ4,5 bildenkann. Diese Strukturen können als langsam freisetzende Depots für Medikamente oder Gerüste zur Geweberegeneration fungieren6,7. Diese Materialien wurden in verschiedenen Anwendungen eingesetzt, darunter Drug Delivery Technology, regenerative Medizin und Immunoengineering1,8,9,10,11,12.
Sowohl natürliche Materialien (z. B. Alginat und Kollagen) als auch synthetische Materialien (z. B. Poly(ethylenglykol) (PEG) oder ähnliche hydrophile Polymere) wurden als biokompatible injizierbare Hydrogelmaterialien entwickelt13,14,15. Viele natürliche Materialien weisen Batch-to-Batch-Variationen auf, die die Reproduzierbarkeit beeinflussen4,16. Diese Materialien sind oft temperaturempfindlich und härten bei Erreichen physiologischer Temperaturen aus; Der Umgang mit diesen Materialien stellt daher zusätzliche technische und logistische Herausforderungendar 17. Synthetische Materialien ermöglichen eine präzisere chemische Kontrolle und eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit, aber diese Materialien können manchmal nachteiligen Immunantworten ausgesetzt sein, die ihre Biokompatibilität einschränken, ein kritisches Merkmal für in vivo therapeutische Anwendungen6,18,19. Jüngste Bemühungen haben gezeigt, dass es viele komplexe Designkriterien gibt, die an der Entwicklung eines injizierbaren Hydrogelmaterials beteiligt sind, einschließlich der Optimierung der mechanischen Eigenschaften, der Polymernetzwerkmaschengröße, der bioaktiven molekularen Hinweise, der biologischen Abbaubarkeit und der Immunogenität des Materials20,21,22 , 23,24,25,26. All diese Faktoren müssen je nach Anwendung berücksichtigt werden, was bedeutet, dass eine modulare, chemisch abstimmbare Plattform ideal ist, um eine breite Palette von Anwendungen zu erfüllen.
Die vorliegenden Verfahren beschreiben die Formulierung und die Verwendung einer injizierbaren Polymer-Nanopartikel (PNP) Hydrogel-Plattform, die abstimmbare mechanische Eigenschaften, ein hohes Maß an Biokompatibilität und eine geringe Immunogenität aufweist und Stellen für die Konjugation bioaktiver molekularer Hinweise27,28,29,30,31,32,33darstellt. Diese PNP-Hydrogele bestehen aus hydrophob modifizierten Cellulosepolymeren und selbstorganifizierten Kern-Schalen-Nanopartikeln, die Poly(ethylenglykol)-Block-Poly(milchsäure) (PEG-PLA)27,34 enthalten, die interagieren, um ein supramolekulares Netzwerk zu erzeugen. Genauer gesagt interagieren die Dodecyl-modifizierten Hydroxypropylmethylcellulosepolymere (HPMC-C12)dynamisch mit der Oberfläche von PEG-PLA-Nanopartikeln und überbrücken zwischen diesen Nanopartikeln, um dieses Polymernetzwerk zu bilden27,34. Diese dynamischen, multivalenten Wechselwirkungen ermöglichen es den Materialien, während der Injektion zu scheren und nach der Verabreichung schnell selbst zu heilen. Die PNP-Hydrogel-Komponenten werden leicht durch einfache Eintopfreaktionen hergestellt und das PNP-Hydrogel wird unter milden Bedingungen durch einfaches Mischen der beiden Komponentengebildet 35. Aufgrund der einfachen Herstellung ist diese Hydrogel-Plattform in hohem Maße übersetzbar. Die mechanischen Eigenschaften und die Maschenweite von PNP-Hydrogelen werden durch Veränderung des Gewichtsprozents der Polymer- und Nanopartikelkomponenten in der Formulierung gesteuert. Frühere Studien mit dieser Plattform deuten darauf hin, dass PNP-Hydrogele hochgradig biokompatibel, biologisch abbaubar und nicht immunogen sind28,30,31. Insgesamt bieten diese Hydrogele einen breiten Nutzen in biomedizinischen Anwendungen, die postoperative Adhäsionsprävention, Tissue Engineering und Regeneration, nachhaltige Arzneimittelabgabe und Immunengineering umfassen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td>PNP hydrogel injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G, 4 in hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>N224</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates, black, clear bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3540</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, black</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-627</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, clear</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8729K66</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>NP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR759015-100EA</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DynaPro II Plate Reader</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>300007-392 (EA)</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>8300015027</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer elbow connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30800-12</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-456</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Spatula</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1229F13</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>TS-RT2-100</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11382II</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>DHR-2 Rheometer</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516-5G</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications

Diese Methoden beschreiben, wie injizierbare, supramolekulare Polymer-Nanopartikel(PNP)-Hydrogele für die Verwendung als Biomaterialien formuliert werden. PNP-Hydrogele bestehen aus zwei Komponenten: hydrophob modifizierter Cellulose als Netzwerkpolymer und selbstorganisierenden Kern-Schalen-Nanopartikeln, die durch dynamische, multivalente Wechselwirkungen als nicht-kovalente Vernetzunger fungieren. Diese Methoden beschreiben sowohl die Bildung dieser selbst zusammengesetzten Nanopartikel durch Nanopräzipitation als auch die Formulierung und Mischung der beiden Komponenten zu Hydrogelen mit abstimmbaren mechanischen Eigenschaften. Die Verwendung von dynamischer Lichtstreuung (DLS) und Rheologie zur Charakterisierung der Qualität der synthetisierten Materialien wird ebenfalls detailliert beschrieben. Schließlich wird der Nutzen dieser Hydrogele für die Wirkstoffabgabe, die biopharmazeutische Stabilisierung sowie die Zellverkapselung und -abgabe durch In-vitro-Experimente zur Charakterisierung der Wirkstofffreisetzung, der thermischen Stabilität sowie der Zellabsetzung und -lebensfähigkeit nachgewiesen. Aufgrund seiner Biokompatibilität, Injizierbarkeit und milden Gelbildungsbedingungen ist dieses Hydrogelsystem eine leicht abstimmbare Plattform, die für eine Reihe von biomedizinischen Anwendungen geeignet ist.

Herstellung und Charakterisierung von PNP-Hydrogel PNP-Hydrogele werden durch die Mischung der beiden Hauptkomponenten - hydrophob modifizierte HPMC-Polymere und PEG-PLA-Nanopartikel - gebildet (Abbildung 1a). Therapeutische Fracht wird am einfachsten in den zusätzlichen Puffer eingebaut, der verwendet wird, um die Nanopartikelkomponente vor der Hydrogelpräparation zu verdünnen. Für die nachgeschaltete biomedizinische Charakterisierung ist es zweckmäßig, ein Ellenbogenmischverfahren zu verwenden, das ein einfaches und reproduzierbares Mischen der beiden Komponenten ermöglicht (Abbildung 1b). Nach ausreichendem Mischen sollte sich das Hydrogel in der Spritze fest anfühlen, aber unter Druck nachgeben und aus einer Standardnadel extrudieren (21G gezeigt) (Abbildung 1c). Nach der Injektion sollte sich das Hydrogel schnell in ein feststoffähnliches Material feststellen, das dem Fluss der Schwerkraft widersteht. Um das Hydrogel vollständig zu charakterisieren und konsistente Batch-to-Batch-Produkte zu gewährleisten, sollten Proben mit verschiedenen Experimenten auf einem Rheometer analysiert werden. Die Scherverdünnungs- und Selbstheilungsfähigkeiten des Gels können leicht mit einem Flow-Sweep-Protokoll bzw. einem Step-Shear-Protokoll beobachtet werden (Abbildung 2a, b). Bei steiferen Gelen, wie der 2:10-Formulierung, sollte der Benutzer darauf achten, dass die Viskosität während des Strömungsfegens um mindestens zwei Größenordnungen abnimmt, da die Scherrate von 0,1 auf 100 s-1erhöht wird, was die mechanischen Bedingungen während der Injektion simuliert. Das Stufenscherprotokoll sollte eine Abnahme der Viskosität um Größenordnungen unter den Schritten mit hoher Scherung und eine schnelle Rückkehr (<5 s Erholungszeit) zur Ausgangsviskosität während der niedrigen Scherschritte zeigen. Die Charakterisierung der Speicher- und Verlustmodule mittels eines oszillatorischen Scherfrequenz-Sweep-Experiments im linearen viskoelastischen Regime sollte feststoffähnliche Eigenschaften in Frequenzbereichen von 0,1-100 rad s-1 aufdecken (Abbildung 2c). Insbesondere sollte es typischerweise keine Kreuzung der Scherspeicher- und Verlustmodule geben, die bei niedrigen Frequenzen für steifere Formulierungen wie die 2:10-Hydrogele beobachtbar ist. Ein solches Crossover-Ereignis kann auf Probleme in der Qualität der Ausgangsmaterialien hinweisen, entweder des modifizierten HPMC- oder PEG-PLA-Polymers oder der Größe und Dispergierfähigkeit der PEG-PLA-Nanopartikel. Es ist zu beachten, dass bei schwächeren Hydrogelformulierungen, wie dem 1:5 Hydrogel, ein Crossover-Ereignis zu erwarten ist. Oszillierende Scheramplituden-Sweeps auf PNP-Hydrogelen zeigen, dass die Materialien erst nachgeben, wenn hohe Spannungswerte angewendet werden, was darauf hindeutet, dass diese Materialien eine Streckgrenze aufweisen, eine Schwellenspannung, die für den Fluss des Materials erforderlich ist.
Charakterisierung der Freisetzungskinetik aus PNP-Hydrogelen Ein wesentlicher Schritt bei der Entwicklung von PNP-Gelen für die Wirkstoffabgabe ist die Charakterisierung der Arzneimittelfreisetzungskinetik aus einer ausgewählten Formulierung. Es gibt mehrere Techniken dafür, aber eine einfache In-vitro-Methodik liefert nützliche Daten während der frühen Formulierungsentwicklung (Abbildung 3a). Die Variation des Polymergehalts der PNP-Hydrogele durch Modulation der Menge an HPMC-C12 oder NPs ist der einfachste Weg, um die mechanischen Eigenschaften und die Maschenweite dieser Hydrogele abzustimmen, was sich direkt auf die Diffusion der Ladung durch das Polymernetzwerk und die Freisetzungsrate aus den Materialien auswirken kann (Abbildung 3b). Für Ladungen, die größer als die dynamische Maschenweite sind (d. H. Hohes Molekulargewicht oder großer hydrodynamischer Radius), sollten Forscher mit einer langsamen, auflösungsvermittelten Freisetzung von Fracht aus dem Hydrogeldepot rechnen. Formulierungen mit dynamischen Maschenöffnungen größer oder gleich der Größe der Ladung ermöglichen eine diffusionsvermittelte Freisetzung, die mit traditionellen Modellen der Ladungsdiffusion und Freisetzung46,47,48,49beschrieben werden kann. Basierend auf der Form der Freisetzungskurve können Forscher das Hydrogel neu formulieren, um es auf eine langsamere (z. B. Erhöhung des Polymergehalts) oder schnellere (z. B. Verringerung des Polymergehalts) Freisetzung abzustimmen.
Beurteilung der Stabilität therapeutischer Ladung Die Bestimmung der Stabilität der therapeutischen Ladung in einer Hydrogelformulierung ist entscheidend, bevor präklinische oder zelluläre Studien beginnt. Im Vergleich zu anderen synthetischen Methoden zur Verkapselung von Medikamenten integrieren PNP-Hydrogele Fracht auf sanfte Weise, indem sie sich in das Schüttgut mischen, und es ist unwahrscheinlich, dass die Verkapselung die Ladung beschädigt. Diese Studien deuten darauf hin, dass PNP-Hydrogele auch Ladung stabilisieren können, die anfällig für thermische Instabilität ist, wie Insulin, wodurch die Haltbarkeit erheblich verlängert und die Abhängigkeit von Kühllagerung und -verteilung verringert wird (Abbildung 4). Es ist wichtig, den Zustand der Ladung unmittelbar nach der Verkapselung in das Hydrogel sowie nach längerer Lagerung zu bewerten. Diese Daten zeigen, dass Insulin in Hydrogelen nach 28 Tagen Lagerung unter kontinuierlicher thermischer und mechanischer Belastung stabil bleibt, wobei ein einfacher Fluoreszenzassay zur Messung der Insulinaggregation verwendet wird. Eine alternative Technik für Fälle, in denen kein geeigneter Plattenassay verfügbar ist, wäre die Durchführung von zirkulären Dichroismusmessungen der Ladung, was besonders nützlich ist, um die Sekundärstruktur von Proteinarzneimitteln zu bestimmen.
Bestimmung der Zelllebensfähigkeit und -dispersion in PNP-Hydrogelen Viele therapeutische Zellen benötigen Adhäsionsmotive, um lebensfähig zu bleiben, und daher ist die Einbeziehung von Integrinmotiven wie Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) Peptiden ein wichtiger Schritt bei der Anpassung von PNP-Hydrogelen für Zelltherapien50. Das modularePEG-PLA-Polymer,bestehend aus den NPs, ermöglicht die chemische Funktionalisierung der PEG-Korona durch einfache "Klick"-Chemikalien28,51. In diesem Beispiel wurden zelladhäsive RGD-Peptide an das PEG-PLA-Polymer gebunden, um die Zellinteraktion mit der PNP-Hydrogelstruktur zu fördern. Formulierungen ohne Adhäsionsstellen weisen eine geringe Zelllebensfähigkeit auf, da sich verkapselte Zellen im Vergleich zu Zellen, die in Formulierungen mit diesen Adhäsionsmotiven verkapselt sind, nicht vermehren (Abbildung 5a, b). Verkapselte Zellen können mit Calcein AM oder einem anderen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff (z. B. CFSE) markiert werden, um das Zellzählen mit einem Fluoreszenzmikroskop zu erleichtern. Während der Optimierung sollte die Lebensfähigkeit mit unmodifizierten PNP-Hydrogelen verglichen werden, um sicherzustellen, dass integrinfunktionalisierte Formulierungen eine verbesserte Lebensfähigkeit und Proliferation bieten. Wenn integrinfunktionalisierte Formulierungen eine ähnliche Wirksamkeit wie unmodifizierte Hydrogele bieten, kann dies auf ein Versagen der Konjugationschemie hinweisen, die zur Aufnahme der Adhäsionsmotive verwendet wird.
Forscher sollten erwarten, dass verkapselte Zellen gleichmäßig durch das Hydrogelmedium verteilt werden, wenn sie eine geeignete Hydrogelformulierung verwenden. Dies ermöglicht eine konsistente und vorhersehbare Dosierung der Zellen während der Hydrogel-Verabreichung und sollte nach der Verabreichung zu einer lokalen Retention der Zellen im Hydrogel führen. Die Verteilung der Zellen kann leicht mit Fluoreszenzmikroskopie-Techniken bestimmt werden. Zellen können mit einem geeigneten Farbstoff markiert und dann mit konfokaler Mikroskopie abgebildet werden. Die Bilder können visuell (Abbildung 5c) und auch quantitativ (Abbildung 5d) mit der ImageJ-Software bewertet werden, um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität entlang der vertikalen Achse des Bildes (oder entlang der Achse, aufgrund der Schwerkraft zu erwarten ist) zu messen. Wenn die Hydrogelformulierung zu schwach ist, um die Zellen in Suspension über längere Zeiträume zu unterstützen, tritt eine Zellablagerung auf, wie in der 1:1-Formulierung in Abbildung 5beobachtet. Die Erhöhung des Polymergehalts kann Probleme mit inhomogener Zelldispersion aufgrund von Absetzungen lösen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig1v4.jpg"> Abbildung 1: Polymer-Nanopartikel (PNP)-Hydrogele werden leicht durch Mischen von zwei Komponenten gebildet. (a) Die erste Komponente ist eine Lösung von Dodecyl-modifizierter Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC-C12),und die zweite Komponente ist eine Lösung von Poly(ethylenglykol)-Block-Poly(milchsäure)(PEG-PLA)-Nanopartikeln zusammen mit jeder therapeutischen Ladung. Durch die schonende Mischung dieserbeiden Komponenten ergibt sich ein injizierbares Hydrogel, bei dem die HPMC-C12-Polymere durch dynamische, multivalente Wechselwirkungen mit den PEG-PLA-Nanopartikeln physikalisch vernetzt sind. b)Foto, das die Gelformulierung durch Mischen mit zwei Spritzen demonstriert, die jeweils eine Komponente des PNP-Hydrogels enthalten. Durch die Verbindung der beiden Spritzen mit einem Luer-Lock-Ellenbogenverbinder können die beiden Komponenten leicht unter sterilen Bedingungen gemischt werden, um ein blasenfreies Hydrogel zu erhalten, das zur sofortigen Verwendung in eine Spritze vorgeladen ist. Die NP-Lösung wird zu Demonstrationszwecken blau gefärbt. c)Nachweis der Injektion von PNP-Hydrogelen und ihrer Wiedererstarrung. (i) PNP-Hydrogel in einer Spritze mit einer angebrachten 21G-Nadel. (ii) Die Injektion legt das Hydrogel unter eine Scherung, die die Wechselwirkungen zwischen Polymer und Nanopartikeln vorübergehend aufbricht und eine flüssigkeitsähnliche Konsistenz erzeugt. (iii) Nach der Injektion reformieren sich die dynamischen Polymer-Nanopartikel-Wechselwirkungen schnell, so dass sich das Hydrogel selbst zu einem Feststoff heilen kann. (iv) Das feste Hydrogel fließt nicht unter Kräften, die schwächer sind als seine Streckgrenze, wie z.B. Schwerkraft. Das PNP-Hydrogel wird zu Demonstrationszwecken blau gefärbt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig2v3.jpg"> Abbildung 2: Rheologische Charakterisierung von zwei PNP-Hydrogelformulierungen. Formulierungen werden als Polymer Gew.%: NP Gew.%bezeichnet. (a) Stetiger Scherstrom von niedriger bis hoher Scherrate von PNP-Hydrogelen. Die Viskosität in Abhängigkeit von der Scherrate charakterisiert die Scherverdünnungseigenschaften. (b) Viskosität in Abhängigkeit von oszillierenden Scherraten zwischen niedrigen Scherraten (weißer Hintergrund; 0,1 s−1) bis zu hohen Scherraten (roter Hintergrund; 10 s−1), die selbstheilende Eigenschaften von PNP-Hydrogelen zeigen. Scherraten werden für jeweils 30 s auferlegt. (c) Elastischer Speichermodul G′ und viskoser Verlustmodul G" als Funktion der Frequenz bei einer konstanten Dehnung von 1% für verschiedene PNP-Hydrogelformulierungen. (d) Amplitudenfeger mit einer konstanten Frequenz von 10 rad/s, um den elastischen Speichermodul G′und den viskosen Verlustmodul G"von PNP-Hydrogelen in Abhängigkeit von der Spannung zu charakterisieren. Diese rheologische Charakterisierung kann als Vergleich zur Qualitätskontrolle verwendet werden. Diese Abbildung wurde von Grosskopf et al.28adaptiert<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2.jpg"> Abbildung 3: In-vitro-Freisetzung von Rinderserumalbumin (BSA) aus PNP-Hydrogelen. Formulierungen werden als Polymer Gew.%: NP Gew.%bezeichnet. a)Schematisch zur Beschreibung des experimentellen In-vitro-Freisetzungsprotokolls. Aliquots werden im Laufe der Zeit aus PNP-Hydrogel-beladenen Kapillarrohren entfernt. b)Die In-vitro-Freisetzung von BSA aus 1:10 PNP, 2:5 PNP und 2:10 PNP wird als die um den angegebenen Zeitpunkt gesammelte Masse dividiert durch die während des Assays gesammelte Gesamtmasse angegeben (Daten, die als Mittelwert ± SD angegeben sind; n = 3). BSA wurde durch Absorptionsmessungen nachgewiesen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Thermische Stabilität von Insulin, das durch ThT-Assay in PNP-Hydrogelen verkapselt ist. Formulierungen werden als Polymer Gew.%: NP Gew.%bezeichnet. Insulin, das sowohl in 1:5- als auch in 2:10-PNP-Hydrogel eingekapselt war, blieb bei gestressten Alterungsbedingungen von 37 °C und ständiger Bewegung über 28 Tage lang unaggregiert. Die Aggregationszeit für Insulin, das in PBS formuliert wurde, betrug 20 ± 4 h (mittlere ± SD, Aggregationsschwelle 750.000 AFU). Die Daten werden als Mittelwert von n = 4 experimentellen Replikaten (AFU, beliebige Fluoreszenzeinheiten) dargestellt. Diese Abbildung wurde von Meis et al.38adaptiert<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2.jpg"> Abbildung 5: Zelllebensfähigkeit und Zellabsetzung in PNP-Hydrogelen. (a,b) Zelllebensfähigkeitsstudien in PNP-Hydrogelen mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs). (a) Repräsentative Bilder lebensfähiger hMSCs in 1:5 PNP-Hydrogelen mit und ohne das zelladhäsive Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD)-Motiv, das mit den PEG-PLA-NPs konjugiert ist. hMSCs wurden vor der konfokalen Bildgebung 30 Minuten lang mit Calcein gefärbt. Der Skalenbalken stellt 100 μm dar. (b) Zelllebensfähigkeit an Tag 6 definiert als Anzahl der fluoreszierenden Zellen im Bild relativ zur Anzahl der fluoreszierenden Zellen an Tag 1 (Daten als Mittelwert ± SD; n = 3). c,d) Zellverkapselungs- und Absetzexperimente mit hMSCs. (c) Bilder mit maximaler Intensität von Calcein AM-gefärbten hMSCs, die in 1:1 PNP-Hydrogel (obere Reihe) und 1:5 PNP-Hydrogel (untere Reihe) über 4 Stunden gekapselt sind, um die Zellablagerung zu quantifizieren. Der Maßstabsbalken stellt 1 mm dar. (d) Durchschnittliche horizontale Pixelintensität von hMSCs entlang des vertikalen Profils des Hydrogels. Diese Abbildung wurde von Grosskopf et al.28adaptiert<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications at JoVE.com

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Formulierung von injizierbaren, supramolekularen Polymer-Nanopartikel (PNP)-Hydrogel-Biomaterialien. Anwendungen dieser Materialien für die Wirkstoffabgabe, die biopharmazeutische Stabilisierung sowie die Zellverkapselung und -abgabe werden demonstriert.

Injizierbare supramolekulare Polymer-Nanopartikel-Hydrogele für Zell- und Arzneimittelverabreichungsanwendungen

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

Unser Protokoll erleichtert die Formulierung von Polymer-Nanopartikel-Hydrogelen für die Verwendung als Biomaterialien. Wir hoffen, dass die Forscher dieses Material für translationale Anwendungen und zur Erforschung grundlegender biologischer Fragen entwickeln werden. PNP-Hydrogele werden leicht durch Nadeln und Katheter mit kleinem Durchmesser injiziert, heilen sich aber nach der Injektion schnell selbst.Dies ermöglicht die nicht-invasive kontrollierte Abgabe von Medikamenten und Zellen über lange Zeiträume. Diese Technologie verschiebt die Grenzen für eine lokalisierte Therapie und eine verlängerte Wirkstofffreisetzung mit Auswirkungen auf weitreichende Erkrankungen von Krebs über Geweberegeneration bis hin zur passiven Immunisierung. Um Nanopartikel durch Nanofällung zu synthetisieren, fügen Sie 50 Milligramm PEG-PLA-Polymer zu einer acht Milliliter Glasszintillationsfläschchen hinzu und fügen Sie ein Milliliter Acetonitril in die Durchstechflasche hinzu.Wirbel vollständig aufzulösen. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter reinen Reinwassers zu einer 20-Milliliter-Glasszintillationsfläschchen mit einem kleinen Rührstab hinzu und legen Sie die Durchstechflasche auf eine Rührplatte, die auf 600 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um ein Milliliter der Polymerlösungslösung tropfenweise in die Durchstechflasche mit Wasser zu geben.Kern-Hüllen-Nanopartikel bilden sich, wenn die Polymerlösung schnell im Wasser dispergiert wird. Überprüfen Sie die Partikelgröße durch dynamische Lichtstreuung nach Standardprotokollen. Anschließend wird die Nanopartikellösung in eine Zentrifugalfiltereinheit gegeben, um die Lösung auf weniger als 250 Mikroliter zu konzentrieren und die Nanopartikel in einem geeigneten Puffer wieder aufzubeleben.Um das Hydrogel vorzubereiten, fügen Sie 333 Milligramm 6% HPMC-C12-Stammlösung zu einer Luer-Lock-Spritze mit einem Milliliter hinzu und fügen Sie 500 Mikroliter der 20% Nanopartikel-Stammlösung und 167 Mikroliter PBS zu einer Acht-Milliliter-Durchstechflasche hinzu. Nach dem Mischen mit einer Nadel eine weitere Milliliter Luer Lock Spritze mit der verdünnten Nanopartikellösung füllen und die beiden Spritzen an einem Ellenbogenmischer befestigen. Mischen Sie die beiden Lösungen für etwa 60 Zyklen, bis sich ein homogenes, undurchsichtiges weißes Hydrogelmaterial gebildet hat.Um die rheologischen Eigenschaften des formulierten Hydrogels zu messen, injizieren Sie das entsprechende Hydrogelvolumen entsprechend dem ausgewählten Geometriespalt in die Mitte einer gezackten Rheometerplatte und verwenden Sie Oszillations- und Strömungstests, um die mechanischen Eigenschaften der Probe zu messen. Um die Wirkstofffreisetzung aus dem Hydrogel zu charakterisieren, bereiten Sie zunächst eine Glaskapillaren vor, indem Sie Epoxidharz verwenden, um ein Ende jedes Röhrchens zu versiegeln. Wenn sich das Epoxidharz eingestellt hat, verwenden Sie eine vier Zoll große hypodermische Nadel mit 22 Gauge, um 100 bis 200 Mikroliter Hydrogel in mindestens drei Röhrchen pro Probe zu injizieren, und fügen Sie vorsichtig 200 bis 300 Mikroliter PBS auf jedes Volumen Hydrogel hinzu.Verwenden Sie zu den geeigneten Zeitpunkten entsprechend der erwarteten Zeitskala der Arzneimittelfreisetzung eine Nadel, um das PBS vorsichtig aus jeder Kapillare zu entfernen, ohne die Hydrogeloberfläche zu stören, und fügen Sie ein frisches PbS-Volumen hinzu. Analysieren Sie nach Abschluss der Studie die gesammelten PBS-Aliquoten mit einer geeigneten Methode, um die Menge des zu jedem Zeitpunkt freigesetzten Arzneimittels zu quantifizieren. Um die thermische Stabilität von gelverkapseltem Insulin zu charakterisieren, laden Sie sowohl Insulin als auch Thioflavin T wie gezeigt in das Hydrogel und verwenden Sie eine 21-Gauge-Nadel, um 200 Mikroliter der Ladung und des mit Sonden beladenen Hydrogels in mindestens drei Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte pro Probe zu injizieren.Dann versiegeln Sie die Platte mit einer optisch klaren Klebeplattendichtung, um Verdunstung zu verhindern, und führen Sie die Platte in einen Plattenleser ein, der mit Temperaturregelung, Schütteln und einer kinetischen Leseprogrammierung ausgestattet ist. Um die Lebensfähigkeit der hydrogelverkapselten Zellen zu beurteilen, verwenden Sie eine 21-Gauge-Nadel, um 150 Mikroliter Hydrogel mit der entsprechenden Zellkonzentration in jede der drei Vertiefungen pro Probe in einer klaren unteren 96-Well-Platte zu injizieren und 100 Mikroliter des entsprechenden Zellmediums in jedes Hydrogelvolumen zu geben. Ersetzen Sie am ersten Tag der Kultur den Überstand auf jedem Hydrogel zum richtigen Zeitpunkt für jede Probengruppe durch 50 Mikroliter zwei millimollarer Calcein AM-Lösung.Nach einer 30-minütigen Inkubation stellen Sie das Zentrum jedes Brunnens durch konfokale Mikroskopie ab. Um die Fähigkeit der verkapselten Zellen zu bewerten, sich vor der Injektion in einer Spritze absetzen, verdünnen Sie die interessierenden Zellen auf einmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in PBS-Konzentration und färben Die Zellen mit 50 Mikrolitern von zwei Millimolaren Calcein AM für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation mischen Sie die Zellen mit 500 bis 700 Mikrolitern Hydrogel, wie gezeigt, und verwenden Sie eine 21-Gauge-Nadel, um 100 bis 200 Mikroliter Zell, die Hydrogel enthält, in den Boden von mindestens einer Küvette pro Probe zu injizieren.Stellen Sie sich dann die Kuseten ab, die unmittelbar nach der Injektion und einein vier Stunden nach der Aussaat flach auf ihren Seiten auf der Stufe eines konfokalen Mikroskops liegen, um zu beobachten, ob sich die Zellen im Hydrogel angesiedelt haben oder ob sie suspendiert geblieben sind. Die Scherausdünnungs- und Selbstheilungskräfte des Gels können mit Flow-Sweep- bzw. Step-Shear-Protokollen beobachtet werden. Die Charakterisierung der Speicher- und Verlustmodule mittels eines oszillatorischen Scherfrequenz-Sweep-Experiments im linearen viskoelastischen Regime bei Frequenzbereichen von 0,1 bis 100 Bogenmaß pro Sekunde zeigt die feststoffähnlichen Eigenschaften.Bei steiferen Formulierungen sollte typischerweise keine Kreuzung der Scherspeicher- und Verlustmodule beobachtet werden, während bei schwächeren Hydrogelformulierungen Crossover-Ereignisse zu erwarten sind. Die Variation des Polymergehalts der PNP-Hydrogele kann sich direkt auf die Diffusion der Ladung durch das Polymernetzwerk und die Freisetzungsrate aus den Materialien auswirken. PNP-Hydrogele können auch Ladung stabilisieren, die anfällig für thermische Instabilität ist, wodurch die Haltbarkeit der Ladung erheblich verlängert und die Abhängigkeit von kühlkettigen Lagerung und Verteilung verringert wird.Die Einbeziehung von Integrinmotiven kann nützlich sein, um PNP-Hydrogele für Zelltherapien anzupassen. Verkapselte Zellen können fluoreszierend markiert werden, um ihre Visualisierung und Quantifizierung zu erleichtern. Zum Beispiel haben Formulierungen ohne Adhäsionsstellen eine geringe Zelllebensfähigkeit, da sich verkapselte Zellen im Vergleich zu verkapselten Zellen und Formulierungen mit Adhäsionsmotiven wie RGD nicht vermehren.Wir untersuchen noch, wie sich Änderungen in der Formulierung auf die rheologischen Eigenschaften und das dynamische Netz der Polymermatrix auswirken. Wir verwenden FRAP auch, um die Diffusion von Molekülen im Hydrogel zu untersuchen. Diese Materialien können verwendet werden, um neue biologische Fragen darüber zu stellen, wie sich eine nachhaltige Verabreichung auf die Medikamentenabgabe, die Impfstoffentwicklung oder die Krebsimmuntherapie auswirken könnte.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Forschung

Biotechnik

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Eine injizierbare and Drug belasteten supramolekulares Hydrogel für Lokale Catheter Injection in die Pig Herz

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

Die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele als Werkzeug für therapeutische Anwendungen

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Herstellung und Drug-Delivery-Anwendungen von Silk Nanopartikel

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Mesenchymale Stromazellen Zellkultur und Lieferung in Autologe Bedingungen: Ein intelligenter Ansatz für orthopädische Anwendungen

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...