Name: injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications
Uploaded: 2021-02-07T15:00:00
Duration: 9 min 39 s
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Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente dal Center for Human Systems Immunology con Bill & Melinda Gates Foundation (OPP1113682) e dalla Bill & Melinda Gates Foundation (OPP1211043). C.M.M. è stato supportato da una Stanford Graduate Fellowship e dalla Stanford Bio-X William and Lynda Steere Fellowship. A.K.G. è grata per una National Science Foundation Graduate Research Fellowship e la Gabilan Fellowship della Stanford Graduate Fellowship in Scienze e Ingegneria. S.C. è stato sostenuto dal National Cancer Institute of the National Institutes of Health con il numero di premio F32CA247352. Gli autori vorrebbero anche riconoscere calorosamente i membri dell'Appel Lab tra cui il Dr. Gillie Roth, il Dr. Anthony Yu, il Dr. Lyndsay Stapleton, il Dr. Hector Lopez Hernandez, il Dr. Andrea d'Aquino, la Dott.ssa Julie Baillet, Celine Liong, Ben Ou, Emily Meany, Emily Gale e il Dr. Anton Smith per il loro sforzo e il loro tempo nell'aiutare l'Appel Lab a sviluppare questi protocolli nel corso degli anni.

Questi autori non hanno nulla da rivelare.

Gli idrogel polimerico-nanoparticella (PNP) sono facilmente fabbricabili e consentono la somministrazione locale a lungo termine di cellule e farmaci terapeutici attraverso una somministrazione minimamente invasiva tramite iniezione diretta o consegna del catetere. Questi protocolli descrivono la formulazione degli idrogel PNP e i metodi di caratterizzazione per garantire la qualità dei materiali risultanti. Gli idrogel PNP supramolecolari sono scalabili da produrre e si formano attraverso la semplice miscelazione di polimeri di cellulosa modificati e nanoparticelle polimeriche a guscio di nucleo. I metodi attuali descrivono procedure facili per formare gel precaricati nelle siringhe attraverso semplici protocolli di miscelazione del gomito. Attraverso le metriche di controllo qualità di ciascuna delle parti componenti, come DLS per monitorare le dimensioni e la distribuzione NP, si possono formulare riproducibilmente materiali idrogel PNP con proprietà reologiche coerenti. Variando la quantità di HPMC-C12 o NP, si possono modulare le dimensioni delle maglie e la rigidità dell'idrogel PNP risultante. Queste proprietà possono essere sintonizzate per adattarsi al meglio a una particolare applicazione biomedica, e con i metodi reologici qui dettagliati i ricercatori possono caratterizzare le proprietà di diradamento del taglio e auto-guarigione degli idrogel PNP in quanto ottimizzano la piattaforma per le loro applicazioni specifiche. Vengono inoltre descritti i metodi per gli studi sul rilascio in vitro; i ricercatori possono utilizzare questi studi per caratterizzare la scala cronologica relativa del rilascio di farmaci di interesse, informando futuri studi in vivo. Utilizzando studi di stabilità, i ricercatori possono anche valutare la capacità di questi materiali di aiutare a preservare la struttura biologica e la stabilità della bioterapica sensibile nel tempo e temperature estreme, con applicazioni potenziali convincenti per ridurre la dipendenza della catena del freddo dalla bioterapia. Infine, con semplici test di vitalità cellulare, è possibile valutare la crescita cellulare e la migrazione all'interno dei materiali PNP, con potenziali applicazioni nelle terapie cellulari e nelle impalcature.
Il nostro gruppo ha trovato molte applicazioni interessanti per la piattaforma di idrogel PNP27. Gli idrogel PNP sono stati utilizzati per la consegna lenta di vaccini subunità, consentendo profili di rilascio cinetico abbinati di antigeni e coadiuvanti di aumentare la grandezza, la durata e la qualità della risposta immunitaria umorista31. Gli idrogel PNP hanno una dimensione delle maglie più piccola rispetto agli idrogel più comunemente usati, quindi sono efficaci nel rallentare la diffusione e rilasciare lentamente il carico molecolare. Le proprietà uniche di aderenza ai tessuti e le proprietà meccaniche degli idrogel PNP sono state utilizzate anche per formare barriere fisiche per prevenire le aderenze derivanti dalla chirurgia spruzzando gli idrogel su ampie aree superficiali degli organi dopo l'interventochirurgico 30. Gli idrogel PNP hanno anche dimostrato di essere efficaci veicoli per la somministrazione di cellule e le proprietà meccaniche proteggono effettivamente le cellule dalle forze meccaniche che si verificano nell'ago della siringa durante l'iniezione, migliorando la vitalitàcellulare 29. Quando gli NP sono coniugati con un peptide adesivo cellulare, le cellule possono attaccarsi e interagire con la matrice PNP per rimanere vitali. Utilizzando questo approccio, gli idrogel PNP hanno dimostrato di migliorare la ritenzione locale delle cellule staminali iniettate rispetto ai metodi che utilizzano veicoli liquidi28. Inoltre, gli idrogel PNP hanno dimostrato di prevenire l'aggregazione indotta termicamente di insulina incapsulata, anche in condizioni di invecchiamento stressato difficili, suggerendo che questi materiali potrebbero essere in grado di ridurre la necessità di refrigerare farmaci sensibili alla temperatura38.
Nel complesso, le metodologie qui descritte consentiranno ai gruppi di ricerca di fabbricare ed esplorare gli idrogel PNP come biomateriale. Questi protocolli forniscono le tecniche di sintesi su scala di laboratorio per fabbricare abbastanza materiale idrogel per perseguire studi sia in vitro che in vivo. Gli studi sopra descritti indicano che i collegamenti dinamici di questi materiali consentono di adattarlo a una serie di applicazioni biomediche consentendo la motilità attiva delle cellule intrappolate, limitando al contempo la diffusione passiva del carico molecolare. Si prevede che i ricercatori troveranno la piattaforma PNP uno strumento accessibile e potente per migliorare i risultati clinici attraverso la somministrazione controllata di farmaci e per studiare meccanismi biologici di base come il reclutamento cellulare e la meccanobiologia.

Gli idrogel iniettabili sono uno strumento emergente per fornire cellule e farmaci terapeutici al corpo in modo controllato1. Questi materiali possono essere caricati con farmaci o cellule e possono essere somministrati in modo minimamente invasivo attraverso l'iniezione diretta ai tessuti superficiali o mediante somministrazione di catetere ai tessuti profondi. In generale, gli idrogel iniettabili sono composti da reti polimeriche gonfie d'acqua che sono reti incrociate da interazioni fisiche transitorie. A riposo, questi collegamenti incrociati forniscono una struttura solida ai gel, ma all'applicazione di una forza meccanica sufficiente questi collegamenti incrociati vengono temporaneamente interrotti, trasformando il materiale in uno stato liquido che può facilmentefluire 2. Sono queste proprietà reologiche che permettono agli idrogel fisici di tranciare-sottile e fluire attraverso piccoli diametri dell'ago durantel'iniezione 3. Dopo l'iniezione, la rete polimerica del materiale si riforma, permettendogli di auto-guarire e formare rapidamente un gel solido in situ4,5. Queste strutture possono fungere da depositi a lento rilascio per farmaci o impalcature per la rigenerazione deitessuti 6,7. Questi materiali sono stati utilizzati in diverse applicazioni che comprendono la tecnologia di somministrazione dei farmaci, la medicina rigenerativa e l'immunoingegneria1,8,9,10,11,12.
Sia i materiali naturali (ad esempio, alginato e collagene) che i materiali sintetici (ad esempio, poli(glicole etilenico) (PEG) o polimeri idrofili simili) sono stati sviluppati come materiali idrogel iniettabili biocompatibili13,14,15. Molti materiali naturali presentano variazioni da lotto a lotto che influiscono sullariproducibilità 4,16. Questi materiali sono spesso sensibili alla temperatura, curando al raggiungimento delle temperature fisiologiche; pertanto, la movimentazione di questi materiali pone ulteriori sfide tecniche elogistiche 17. I materiali sintetici consentono un controllo chimico più preciso e un'eccellente riproducibilità, ma questi materiali possono talvolta essere soggetti a risposte immunitarie avverse che ne limitano la biocompatibilità, caratteristica critica per applicazioni terapeutiche in vivo6,18,19. Recenti sforzi hanno dimostrato che ci sono molti complessi criteri di progettazione coinvolti nell'ingegneria di un materiale idrogel iniettabile, tra cui l'ottimizzazione delle proprietà meccaniche, la dimensione delle maglie della rete polimerica, gli spunti molecolari bioattivi, la biodegradabilità e l'immunogenicitàdel materiale 20,21,22,23,24,25,26. Tutti questi fattori devono essere considerati a seconda dell'applicazione dell'interesse, il che significa che una piattaforma modulare chimicamente tonnibile è ideale per soddisfare un'ampia gamma di applicazioni.
I metodi attuali descrivono la formulazione e l'uso di una piattaforma idrogel polimero-nanoparticella iniettabile (PNP) che presenta proprietà meccaniche tonnibili, un alto grado di biocompatibilità e bassa immunogenicità, e presenta siti per coniugare segnali molecolari bioattivi27,28,29,30,31,32,33. Questi idrogel PNP sono composti da polimeri della cellulosa idrofobicamente modificati e nanoparticelle di guscio di nucleo auto-assemblate che comprendono poli(glicole etilenico)-blocco-poly(acido lattico) (PEG-PLA)27,34 che interagiscono per produrre una rete supramolecolare. Più specificamente, i polimeri di cellulosa idrossipropilmetil modificati dal dodecil (HPMC-C12)interagiscono dinamicamente con la superficie delle nanoparticelle PEG-PLA e ponte tra queste nanoparticelle per formare questa rete polimerica27,34. Queste interazioni dinamiche e multivalenti consentono ai materiali di essere sottili durante l'iniezione e di auto-guarire rapidamente dopo la somministrazione. I componenti dell'idrogel PNP sono facilmente fabbricati attraverso semplici reazioni un vaso e l'idrogel PNP si forma in condizioni miti mediante semplice miscelazione dei due componenti35. Grazie alla facilità di fabbricazione, questa piattaforma idrogel è altamente traducibile su larga scala. Le proprietà meccaniche e le dimensioni delle maglie degli idrogel PNP sono controllate alterando la percentuale di peso dei componenti del polimero e delle nanoparticelle nella formulazione. Studi precedenti con questa piattaforma indicano che gli idrogel PNP sono altamente biocompatibili, biodegradabili e non immunogenici28,30,31. Nel complesso, questi idrogel presentano un'ampia utilità nelle applicazioni biomediche che comprendono la prevenzione dell'adesione post-operatoria, l'ingegneria e la rigenerazione dei tessuti, l'erogazione sostenuta di farmaci e l'immunoingegneria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td>PNP hydrogel injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G, 4 in hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>N224</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates, black, clear bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3540</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, black</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-627</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, clear</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8729K66</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>NP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR759015-100EA</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DynaPro II Plate Reader</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>300007-392 (EA)</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>8300015027</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer elbow connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30800-12</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-456</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Spatula</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1229F13</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>TS-RT2-100</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11382II</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>DHR-2 Rheometer</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516-5G</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications

Questi metodi descrivono come formulare idrogel iniettabili, supramolecolari polimero-nanoparticella (PNP) da utilizzare come biomateriali. Gli idrogel PNP sono composti da due componenti: la cellulosa idrofobicamente modificata come polimero di rete e le nanoparticelle di guscio centrale auto-assemblate che agiscono come collegamenti trasversali non covalenti attraverso interazioni dinamiche e multivalenti. Questi metodi descrivono sia la formazione di queste nanoparticelle auto-assemblate attraverso la nanoprecipitazione, sia la formulazione e la miscelazione dei due componenti per formare idrogel con proprietà meccaniche tonnibili. Viene inoltre dettagliato l'uso dello scattering dinamico della luce (DLS) e della reologia per caratterizzare la qualità dei materiali sintetizzati. Infine, l'utilità di questi idrogel per la somministrazione di farmaci, la stabilizzazione biofarmaceutica e l'incapsulamento e la consegna delle cellule è dimostrata attraverso esperimenti in vitro per caratterizzare il rilascio di farmaci, la stabilità termica, la sedimentazione e la vitalità delle cellule. Grazie alla sua biocompatibilità, iniettabilità e condizioni di formazione di gel delicati, questo sistema idrogel è una piattaforma facilmente tonnibile adatta a una vasta gamma di applicazioni biomediche.

Fabbricazione e caratterizzazione di idrogel PNP Gli idrogel PNP si formano attraverso la miscelazione dei due componenti primari: polimeri HPMC idrofobicamente modificati e nanoparticelle PEG-PLA (Figura 1a). Il carico terapeutico è più facilmente incorporato nel tampone aggiuntivo utilizzato per diluire il componente della nanoparticella prima della preparazione dell'idrogel. Per la caratterizzazione biomedica a valle, è conveniente utilizzare un metodo di miscelazione del gomito che consenta una miscelazione semplice e riproducibile dei due componenti (Figura 1b). Dopo un'adeguata miscelazione, l'idrogel deve sentirsi fermo nella siringa, ma cedere sotto pressione ed estrudere da un ago standard (21G mostrato)(Figura 1c). Dopo l'iniezione, l'idrogel dovrebbe rapidamente essere impostato in un materiale solido che resiste al flusso dalla gravità. Per caratterizzare completamente l'idrogel e garantire prodotti coerenti da lotto a lotto, i campioni devono essere analizzati utilizzando diversi esperimenti su un reometro. Le capacità di diradamento e autoguarigione del gel saranno facilmente osservabili utilizzando rispettivamente un protocollo di sweep di flusso e un protocollo step-shear (Figura 2a,b). Per gel più rigidi, come la formulazione 2:10, l'utente deve cercare la viscosità per diminuire almeno due ordini di grandezza durante lo sweep di flusso poiché la velocità di taglio viene aumentata da 0,1 a 100 s-1, che simula le condizioni meccaniche durante l'iniezione. Il protocollo step-shear dovrebbe rivelare una diminuzione degli ordini di grandezza della viscosità sotto i gradini ad alto taglio e un rapido ritorno (tempo di recupero di <5 s) alla viscosità di base durante le fasi di taglio basse. La caratterizzazione dei moduli di stoccaggio e perdita mediante un esperimento di sweep di frequenza di taglio oscillatorio nel regime viscoelastico lineare dovrebbe rivelare proprietà solide a intervalli di frequenza da 0,1-100 rad s-1 (Figura 2c). In particolare, in genere non dovrebbe esserci un crossover dei moduli di stoccaggio e perdita di taglio che è osservabile a basse frequenze per formulazioni più rigide come gli idrogel 2:10. Tale evento crossover può indicare problemi nella qualità delle materie prime, sia il polimero HPMC o PEG-PLA modificato, sia le dimensioni e la dispersione delle nanoparticelle PEG-PLA. Va notato che ci si può aspettare un evento crossover per formulazioni idrogel più deboli, come l'idrogel 1:5. Le sweep di ampiezza oscillatoria del taglio sugli idrogel PNP rivelano che i materiali non producono fino a quando non vengono applicati alti valori di sollecitazione, indicando che questi materiali possiedono una sollecitazione di snervamento, una quantità soglia di sollecitazione necessaria affinché il materiale fluisca.
Caratterizzazione della cinetica di rilascio dagli idrogel PNP Un passo essenziale nella progettazione di gel PNP per il rilascio di farmaci è la caratterizzazione della cinetica del rilascio di farmaci da una formulazione scelta. Esistono diverse tecniche a tal fine, ma una semplice metodologia in vitro fornisce dati utili durante lo sviluppo precoce della formulazione (Figura 3a). Variare il contenuto polimerico degli idrogel PNP modulando la quantità di HPMC-C12 o NPs è il modo più semplice per ottimizzare le proprietà meccaniche e le dimensioni delle maglie di questi idrogel, che possono avere un impatto diretto sulla diffusione del carico attraverso la rete polimerica e la velocità di rilascio dai materiali(Figura 3b). Per il carico che è più grande della dimensione dinamica delle maglie (cioè un elevato peso molecolare o un ampio raggio idrodinamico), i ricercatori dovrebbero aspettarsi un lento rilascio mediato dalla dissoluzione del carico dal deposito di idrogel. Formulazioni con maglie dinamiche maggiori o uguali alle dimensioni del carico consentiranno il rilascio mediato dalla diffusione che può essere descritto utilizzando modelli tradizionali di diffusione del caricoe rilascio 46,47,48,49. In base alla forma della curva di rilascio, i ricercatori possono riformulare l'idrogel per sintonizzarlo verso un rilascio più lento (ad esempio, aumentare il contenuto di polimeri) o più veloce (ad esempio, diminuire il contenuto di polimeri).
Valutazione della stabilità del carico terapeutico Determinare la stabilità del carico terapeutico in una formulazione di idrogel è fondamentale prima di iniziare studi preclinici o cellulari. Rispetto ad altri metodi sintetici per l'incapsulamento dei farmaci, gli idrogel PNP incorporano il carico in modo delicato mescolando nel materiale sfuso ed è improbabile che l'incapsulamento danneggi il carico. Questi studi indicano che gli idrogel PNP possono anche stabilizzare il carico suscettibile all'instabilità termica, come l'insulina, prolungando notevolmente la durata di conservazione e riducendo la dipendenza dallo stoccaggio e dalla distribuzione a freddo (Figura 4). È importante valutare le condizioni del carico immediatamente dopo l'incapsulamento nell'idrogel e dopo lunghi periodi di stoccaggio. Questi dati mostrano che l'insulina rimane stabile negli idrogel dopo 28 giorni di conservazione sotto stress termico e meccanico continuo, utilizzando un semplice test di fluorescenza per misurare l'aggregazione dell'insulina. Una tecnica alternativa per i casi in cui non è disponibile un saggio appropriato sulle lastre consisterebbe nell'eseguire misurazioni circolari del dicroismo del carico, che è particolarmente utile per determinare la struttura secondaria dei farmaci proteici.
Determinazione della vitalità cellulare e della dispersione negli idrogel PNP Molte cellule terapeutiche richiedono motivi di adesione per rimanere vitali, e quindi l'inclusione di motivi integrina come i peptidi arginina-glicina-acido aspartico (RGD) è un passo importante nell'adattamento degli idrogel PNP per le terapie cellulari50. Il polimeromodularePEG - PLA composto dai NP consente la funzionalizzazione chimica della corona PEG attraverso semplici sostanze chimiche "click"28,51. In questo esempio, peptidi RGD adesivi per cellule sono stati attaccati al polimero PEG-PLA per promuovere l'innesto cellulare con la struttura idrogel PNP. Le formulazioni prive di siti di adesione avranno una bassa vitalità cellulare in quanto le cellule incapsulate non proliferano rispetto alle cellule incapsulate in formulazioni con questi motivi di adesione (Figura 5a, b). Le cellule incapsulate possono essere etichettate con calceina AM o un altro colorante fluorescente appropriato (ad esempio, CFSE) per facilitare il conteggio delle cellule con un microscopio a fluorescenza. Durante l'ottimizzazione, la vitalità dovrebbe essere paragonata agli idrogel PNP non modificati per garantire che le formulazioni funzionalizzate all'integrina forniscano una maggiore vitalità e proliferazione. Se le formulazioni funzionalizzate all'integrina stanno fornendo un'efficacia simile a idrogel non modificati, ciò può indicare un fallimento nella chimica coniugazione utilizzata per incorporare i motivi di adesione.
I ricercatori dovrebbero aspettarsi che le cellule incapsulate siano disperse uniformemente attraverso il mezzo idrogel quando utilizzano un'appropriata formulazione di idrogel. Ciò consentirà un dosamento coerente e prevedibile delle cellule durante la somministrazione di idrogel e dovrebbe tradursi nella ritenzione locale delle cellule nell'idrogel dopo la somministrazione. La distribuzione delle cellule può essere facilmente determinata utilizzando tecniche di microscopia a fluorescenza. Le cellule possono essere etichettate con un colorante appropriato e quindi immagini utilizzando la microscopia confocale. Le immagini possono essere valutate visivamente (Figura 5c) e anche quantitativamente (Figura 5d) utilizzando il software ImageJ per misurare l'intensità media della fluorescenza lungo l'asse verticale dell'immagine (o lungo qualsiasi asse di sedimentazione cellulare dovuto alla gravità). Se la formulazione dell'idrogel è troppo debole per sostenere le cellule in sospensione su tempi prolungati, si verificherà la sedimentazione cellulare, come osservato nella formulazione 1:1 nella figura 5. L'aumento del contenuto di polimeri può risolvere i problemi con la dispersione delle cellule disomogenee a causa della sedimentazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig1v4.jpg"> Figura 1: Gli idrogel polimerico-nanoparticella (PNP) si formano facilmente mescolando due componenti. (a) Il primo componente è una soluzione di idrossipropilmetilcellulosa modificata dal dodecil (HPMC-C12), e il secondo componente è una soluzione di nanoparticelle di poli(glicole etilenico)-blocco-poli(acido lattico) (PEG-PLA) insieme a qualsiasi carico terapeutico. La miscelazione delicata di questi due componenti produce un idrogel iniettabile, dove i polimeri HPMC-C12 sono fisicamente collegati da interazioni dinamiche e multivalenti con le nanoparticelle PEG-PLA. bFotografiache dimostra la formulazione del gel mescolando con due siringhe, ognuna contenente un componente dell'idrogel PNP. Collegando le due siringhe con un connettore a gomito Luer-lock, i due componenti possono essere facilmente miscelati in condizioni sterili per produrre un idrogel privo di bolle precaricato in una siringa per un uso immediato. La soluzione NP è tinta di blu a scopo dimostrativo. cDimostrazionedell'iniezione di idrogel PNP e della loro ri-solidificazione. (i) Idrogel PNP in una siringa con un ago 21G attaccato. (ii) L'iniezione mette l'idrogel sotto taglio che rompe temporaneamente le interazioni tra polimero e nanoparticelle, creando una consistenza fluida. (iii) Dopo l'iniezione, le interazioni dinamico polimero-nanoparticella si riformano rapidamente, permettendo all'idrogel di auto-guarire in un solido. ( iv) L'idrogel solido non scorre sotto forze più deboli della sua sollecitazione di snervata, come la gravità. L'idrogel PNP è tinto di blu ai fini della dimostrazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig2v3.jpg"> Figura 2: Caratterizzazione reologica di due formulazioni di idrogel PNP. Le formulazioni sono denotati come wt polimerico.%: NP wt.%. (a) Il flusso di taglio costante spazza da bassa a alta velocità di taglio degli idrogel PNP. La viscosità in funzione della velocità di taglio caratterizza le proprietà di diradamento del taglio. (b) Viscosità in funzione delle oscillazioni delle velocità di taglio tra basse velocità di taglio (sfondo bianco; 0,1 s−1) a velocità di taglio elevate (sfondo rosso; 10 s−1)che dimostrano proprietà auto-curative degli idrogel PNP. Le velocità di taglio sono imposte per 30 s ciascuna. (c) Modulo di stoccaggio elastico G′ e modulo di perdita viscosa G" in funzione della frequenza ad un ceppo costante dell'1% per varie formulazioni di idrogel PNP. (d) Sweep di ampiezza ad una frequenza costante di 10 rad/s per caratterizzare il modulo di stoccaggio elastico G′ e il modulo di perdita viscosa G" degli idrogel PNP in funzione dello stress. Questa caratterizzazione reologica può essere utilizzata come confronto per il controllo di qualità. Questa cifra è stata adattata da Grosskopf etal.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig2v2large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2.jpg"> Figura 3: Rilascio in vitro di albumina siere bovina (BSA) da idrogel PNP. Le formulazioni sono denotati come wt polimerico.%: NP wt.%. (a) Schema che descrive il protocollo sperimentale di rilascio in vitro. Le aliquote vengono rimosse dai tubi capillari carichi di idrogel PNP nel tempo. b Ilrilascio in vitro di BSA da 1:10 PNP, 2:5 PNP e 2:10 PNP ha indicato come la massa raccolta dal punto di tempo specificato diviso per la massa totale raccolta durante il saggio (dati indicati come media ± SD; n = 3). La BSA è stata rilevata attraverso misurazioni di assorbanza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2.jpg"> Figura 4: Stabilità termica dell'insulina incapsulata negli idrogel PNP dal saggio ThT. Le formulazioni sono denotati come wt polimerico.%: NP wt.%. L'insulina incapsulata sia in idrogel PNP 1:5 che 2:10 è rimasta non disaggregata per oltre 28 giorni in condizioni di invecchiamento stressato di 37 °C e agitazione costante. Il tempo di aggregazione per l'insulina formulato in PBS era di 20 ± 4 ore (media ± SD, soglia di aggregazione 750.000 AFU). Dati presentati come media di n = 4 repliche sperimentali (AFU, unità di fluorescenza arbitrarie). Questa cifra è stata adattata da Meis etal.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2.jpg"> Figura 5: Vitalità cellulare e sedimentazione cellulare negli idrogel PNP. (a,b) Studi di vitalità cellulare in idrogel PNP con cellule staminali mesenchimali umane (hSPC). (a) Immagini rappresentative di hSPC vitali in idrogel PNP 1:5 con e senza il motivo dell'acido acido argoinina-glicina-aspartico (RGD) adesivo coniugato con i PNP PEG-PLA. La barra di scala rappresenta 100 μm. (b) Vitalità cellulare il giorno 6 definita come numero di celle fluorescenti nell'immagine rispetto al numero di celle fluorescenti il primo giorno (dati mostrati come ± SD medio; n = 3). (c,d) Esperimenti di incapsulamento e sedimentazione delle celle con hMSC. (c) Immagini di intensità massima degli HMSC macchiati di calceina AM incapsulati in idrogel PNP 1:1 (riga superiore) e idrogel PNP 1:5 (riga inferiore) su 4 ore per quantificare la sedimentazione cellulare. La barra di scala rappresenta 1 mm. (d) Intensità media orizzontale dei pixel degli HMSC lungo il profilo verticale dell'idrogel. Questa cifra è stata adattata da Grosskopf etal.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2large.jpg" target="_blank"></a>

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Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

Questo protocollo descrive la sintesi e la formulazione di biomateriali idrogel iniettabili, supramolecolari polimeri-nanoparticella (PNP). Vengono dimostrate le applicazioni di questi materiali per la somministrazione di farmaci, la stabilizzazione biofarmaceutica e l'incapsulamento e la consegna delle cellule.

Idrogel supramolecolari supramolecolari iniettabili per applicazioni di somministrazione di cellule e farmaci

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

Il nostro protocollo facilita la formulazione di idrogel polimerico-nanoparticelle per l'uso come biomateriali. Speriamo che i ricercatori sviluppino questo materiale per applicazioni trasizionali ed esploreranno le questioni biologiche di base. Gli idrogel PNP vengono facilmente iniettati attraverso aghi e cateteri di piccolo diametro, ma si auto-guariscono rapidamente dopo l'iniezione.Ciò consente la somministrazione controllata non invasiva di farmaci e cellule su lunghi tempi. Questa tecnologia spinge i confini per la terapia localizzata e l'esteso rilascio di farmaci, con implicazioni per ampie condizioni di rabbia dal cancro alla rigenerazione tissutale fino all'immunizzazione passiva. Per sintetizzare le nanoparticelle mediante nano precipitazione, aggiungere 50 milligrammi di polimero PEG-PLA a un flaconcino a scintillazione di vetro da otto millilitri e aggiungere un millilitro di acetonitrile al flaconcino.Vortice da sciogliere completamente. Aggiungere quindi 10 millilitri di acqua ultra pura a una fiala a scintillazione in vetro da 20 millilitri con una piccola barra di agitazione e posizionare il flaconcino su una piastra di agitazione impostata su 600 giri al minuto. Utilizzare una pipetta da 200 microlitri per aggiungere un millilitro della soluzione di solvente polimerico dropwise al flaconcino dell'acqua.Le nanoparticelle del guscio centrale si formeranno poiché la soluzione di solvente polimerico viene rapidamente dispersa in tutta l'acqua. Verificare la dimensione delle particelle mediante scattering dinamico della luce secondo protocolli standard. Quindi trasferire la soluzione di nanoparticelle in un'unità filtrante centrifuga per concentrare la soluzione a meno di 250 microlitri e rimorsire le nanoparticelle in un buffer appropriato.Per preparare l'idrogel, aggiungere 333 milligrammi di soluzione stock HPMC-C12 al 6%HPMC-C12 a una siringa di blocco Luer millilitro e aggiungere 500 microlitri della soluzione di stock di nanoparticelle del 20% e 167 microlitri di PBS a un flaconcino da otto millilitri. Dopo la miscelazione, utilizzare un ago per riempire un'altra siringa di blocco Luer millilitro con la soluzione di nanoparticelle diluita e attaccare le due siringhe a un mixer a gomito. Mescolare le due soluzioni per circa 60 cicli fino a formare un materiale idrogel bianco omogeneo e opaco.Per misurare le proprietà reologiche dell'idrogel formulato, iniettare il volume appropriato di idrogel in base allo spazio geometrico selezionato al centro di una piastra reometrica seghettata e utilizzare prove oscillatorie e di flusso per misurare le proprietà meccaniche del campione. Per caratterizzare il rilascio di farmaci dall'idrogel, in primo luogo, preparare un capillare di vetro utilizzando epossidico per sigillare un'estremità di ogni tubo. Quando l'epossidico si è impostato, utilizzare un ago ipodermico da 22 pollici da quattro pollici per iniettare da 100 a 200 microlitri di idrogel in un minimo di tre tubi per campione e aggiungere con cura da 200 a 300 microlitri di PBS su ogni volume di idrogel.Nei punti di tempo appropriati, in base alla tempistica prevista per il rilascio del farmaco, utilizzare un ago per rimuovere con cura il PBS da ogni capillare senza disturbare la superficie dell'idrogel e aggiungere un nuovo volume di PBS. Al termine dello studio, analizzare le aliquote PBS raccolte con un metodo appropriato per quantificare la quantità di farmaco rilasciato in ogni momento. Per caratterizzare la stabilità termica dell'insulina incapsulata in gel, caricare sia l'insulina che la tioflavina T nell'idrogel come dimostrato e utilizzare un ago calibro 21 per iniettare 200 microlitri del carico e sondare l'idrogel caricato in almeno tre pozzi di una piastra nera da 96 pozzetti per campione.Quindi sigillare la piastra con una guarnizione della piastra adesiva otticamente chiara per evitare l'evaporazione e inserire la piastra in un lettore di piastre dotato di controllo della temperatura, agitazione e una programmazione di lettura cinetica. Per valutare la vitalità delle cellule incapsulate da idrogel, utilizzare un ago calibro 21 per iniettare 150 microlitri di idrogel contenenti l'appropriata concentrazione di cellule in ciascuno dei tre pozzali per campione in una piastra chiara inferiore di 96 porci e aggiungere 100 microlitri del mezzo cellulare appropriato in ogni volume di idrogel. Il primo giorno di coltura, sostituire il supernatante su ogni idrogel nel momento appropriato per ogni gruppo campione con 50 microlitri di due millimolare calcein AM soluzione.Dopo un'incubazione di 30 minuti, immagini il centro di ogni pozzo con microscopia confocale. Per valutare la capacità delle cellule incapsulate di depositarsi in una siringa prima dell'iniezione, diluire le cellule di interesse a una volta 10 per le sei cellule per millilitro nella concentrazione di PBS e macchiare le cellule con 50 microlitri di due millimolare Calcein AM per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, mescolare le cellule con da 500 a 700 microlitri di idrogel come dimostrato e utilizzare un ago calibro 21 per iniettare da 100 a 200 microlitri di cellule contenenti idrogel nel fondo di almeno una cuvetta per campione.Quindi immagini le cuvette sdraiate piatte sui loro lati sul palco di un microscopio confocale immediatamente dopo l'iniezione e a una e quattro ore dalla semina per osservare se le cellule si sono depositate nell'idrogel o se sono rimaste sospese. Le capacità di assottigliamento a taglio e auto-guarigione del gel possono essere osservate utilizzando rispettivamente protocolli di sweep di flusso e step-shear. La caratterizzazione dei moduli di stoccaggio e perdita utilizzando un esperimento di sweep di frequenza di taglio oscillatorio nel regime viscoelastico lineare a frequenza varia da 0,1 a 100 radianti al secondo rivela le proprietà solide.In genere non dovrebbe esserci un crossover dei moduli di stoccaggio e perdita di taglio osservati a basse frequenze per formulazioni più rigide, mentre ci si può aspettare eventi crossover per formulazioni idrogel più deboli. Variare il contenuto polimerico degli idrogel PNP può avere un impatto diretto sulla diffusione del carico attraverso la rete polimerica e sulla velocità di rilascio dai materiali. Gli idrogel PNP possono anche stabilizzare il carico suscettibile all'instabilità termica, prolungando notevolmente la durata di conservazione del carico e riducendo la dipendenza dallo stoccaggio e dalla distribuzione della catena del freddo.L'inclusione di motivi integrina può essere utile per adattare idrogel PNP per terapie cellulari. Le celle incapsulate possono essere etichettate fluorescentmente per facilitarne la visualizzazione e la quantificazione. Ad esempio, le formulazioni prive di siti di adesione avranno una bassa vitalità cellulare in quanto le cellule incapsulate non riescono a proliferare rispetto alle cellule incapsulate e alle formulazioni con motivi di adesione, come RGD.Stiamo ancora esplorando come i cambiamenti nella formulazione influenzino le caratteristiche reologiche e la mesh dinamica della matrice polimerica. Usiamo anche FRAP per studiare la diffusione delle molecole all'interno dell'idrogel. Questi materiali possono essere utilizzati per porre nuove domande biologiche su come il parto prolungato potrebbe influenzare il parto dei farmaci, lo sviluppo di vaccini o l'immunoterapia del cancro.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

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Ricerca

Bioingegneria

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