Name: injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications
Uploaded: 2021-02-07T15:00:00
Duration: 9 min 39 s
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이 연구는 빌 & 멜린다 게이츠 재단 (OPP1113682)과 빌 & 멜린다 게이츠 재단 (OPP12111043)과 인간 시스템 면역학 센터에 의해 재정적으로 지원되었다. C.M.M. 스탠포드 대학원 펠로우십과 스탠포드 바이오-X 윌리엄과 린다 스티어 펠로우십의 지원을 받았습니다. A.K.G.는 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십과 스탠포드 대학원 과학 및 공학 펠로우십의 가빌란 펠로우십에 감사드립니다. S.C. 수상 번호 F32CA247352에서 건강의 국립 연구소의 국립 암 연구소에 의해 지원되었다. 저자는 또한 닥터 길리 로스, 닥터 앤서니 유, 린지 스테이플턴 박사, 헥터 로페즈 에르난데스 박사, 안드레아 다퀴노 박사, 줄리 베일렛, 셀린 라이온, 벤 우, 에밀리 메니, 에밀리 게일 박사, 안톤 스미스 박사를 포함한 Appel Lab 회원들이 이러한 프로토콜을 개발하는 데 도움을 준 노력과 시간을 따뜻하게 인정하고 싶습니다.

이 저자는 공개 할 것이 없습니다.

폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔은 직접 주입 또는 카테터 전달을 통해 최소 침습 적 투여를 통해 치료 세포 및 약물의 장기 국소 전달을 용이하게 제조하고 가능하게 한다. 이러한 프로토콜은 PNP 하이드로겔의 제형과 결과 물질의 품질을 보장하기 위한 특성화 방법을 설명합니다. 수퍼컬분자 PNP 하이드로겔은 제조할 수 있으며 변형된 셀룰로오스 폴리머 및 폴리머 코어 쉘 나노입자의 간단한 혼합을 통해 형성된다. 본 방법은 간단한 팔꿈치 혼합 프로토콜을 통해 주사기에 미리 로드된 젤을 형성하는 촉진 절차를 설명합니다. DLS와 같은 각 부품의 품질 관리 메트릭을 통해 NP 크기 및 분포를 모니터링할 수 있으며, 일관된 유변학적 특성으로 PNP 하이드로겔 재료를 재현가능하게 제조할 수 있습니다. HPMC-C12 또는 NP의 양을 다양하게 하여 결과 PNP 하이드로겔의 메쉬 크기와 강성을 조절할 수 있습니다. 이러한 특성은 특정 생체 의학 응용 분야에 가장 잘 맞게 조정할 수 있으며, 여기에 자세히 설명된 유변학적 방법으로 연구자들은 PNP 하이드로겔의 전단 숱이 및 자가 치유 특성을 특성화하여 특정 응용 분야에 대한 플랫폼을 최적화할 수 있습니다. 체외 방출 연구를 위한 방법 또한 설명 됩니다.; 연구원은 이러한 연구를 사용 하 여 관심 있는 약물의 출시의 상대적인 기간을 특성화 하는 데 사용할 수 있습니다., 생체 내 연구에서 미래를 알리는. 안정성 연구를 사용하여 연구원은 또한 생체 치료제의 콜드 체인 의존성을 줄이기 위한 강력한 잠재적 응용 프로그램과 함께, 시간이 지남에 따라 민감한 생물 치료제의 생물학적 구조와 안정성을 보존하는 데 도움이 이러한 물질의 능력을 평가할 수 있습니다. 마지막으로, 간단한 세포 생존 가능성 분석으로, 세포 성장 및 PNP 물질 내의 이주를 평가할 수 있습니다, 세포 치료 및 발판에 있는 잠재적인 응용으로.
우리 그룹은 PNP 하이드로겔 플랫폼27에대한 많은 강력한 응용 프로그램을 발견했다. PNP 하이드로겔은 아체유닛 백신의 느린 전달을 위해 사용되어, 항원 및 보조제의 매칭 된 운동 방출 프로파일을 가능하게하여 유머 면역 반응(31)의크기, 지속 시간 및 품질을 향상시킵니다. PNP 하이드로겔은 가장 일반적으로 사용되는 하이드로겔보다 메쉬 크기가 더 작은 것으로 나타났기 때문에 확산을 늦추고 분자 화물을 천천히 방출하는 데 효과적입니다. PNP 하이드로겔의 독특한 조직 부착 특성 및 기계적 특성은 수술 후 장기의 넓은 표면 영역에 하이드로겔을 분사하여 수술로 인한 접착을 방지하기 위해 물리적 장벽을 형성하는 데활용되었다(30) PNP 하이드로겔은 또한 효과적인 세포 전달 차량으로 나타났으며, 기계적 특성은 실제로 주입 시 주사기 바늘에서 발생하는 기계적 힘으로부터 세포를 보호하여 셀생존가능성을향상시키는 것으로 나타났다. NPs가 세포 접착제 펩티드와 결합될 때, 세포는 PNP 매트릭스를 부착하고 관여하여 실행 가능한 상태를 유지할 수 있다. 이러한 접근법을 이용하여, PNP 하이드로겔은 액체차량(28)을이용한 방법에 비해 주입된 줄기세포의 국소 보존을 개선하는 것으로 나타났다. 또한, PNP 하이드로겔은 가혹한 응력 노화 조건 하에서도 캡슐화된 인슐린의 열유도 응집을 방지하는 것으로 나타났으며, 이러한 물질이 온도에 민감한약물(38)을냉장할 필요성을 줄일 수 있음을 시사한다.
전반적으로, 여기에 설명된 방법론은 연구 그룹이 생물 재료로 PNP 하이드로겔을 제조하고 탐구할 수 있게 해 줄 것이다. 이러한 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 연구를 모두 추구하기에 충분한 하이드로겔 물질을 제조하기 위한 실험실 규모의 합성 기술을 제공합니다. 위에서 설명한 연구는 이러한 물질의 동적 교차링크가 분자 화물의 수동 확산을 제한하면서 갇힌 세포의 활성 운동성을 허용함으로써 다양한 생체 의학 응용 분야에 적합할 수 있음을 나타냅니다. 연구원은 PNP 플랫폼이 통제된 약 납품을 통해 임상 결과를 향상하고 세포 모집 및 기계생물학과 같은 기본적인 생물학 기계장치를 공부하기 위하여 접근가능하고 강력한 공구를 찾아냅니다.

주사용 하이드로겔은 치료 세포와 약물을 대조된 방식으로 신체에 전달하는 새로운도구이다. 이러한 물질은 약물 이나 세포로 로드될 수 있으며 피상 조직에 직접 주입을 통해 또는 깊은 조직에 카테터 전달에 의해 최소 침습적 방식으로 투여 될 수있다. 일반적으로 주사용 하이드로겔은 일시적인 물리적 상호 작용에 의해 서로 연결되는 수분 부은 폴리머 네트워크로 구성됩니다. 나머지에서, 이러한 크로스 링크는 젤에 고체와 같은 구조를 제공하지만, 충분한 기계적 힘의 적용시 이러한 크로스 링크는 일시적으로 중단되어 물질을 쉽게2를흐를 수있는 액체와 같은 상태로 변환합니다. 이러한 유변학적 특성으로, 물루3시 작은 바늘 직경을 통해 물리적 하이드로겔이 얇게 전단되고 흐르는 것을 허용하는 것은 이러한 유변학적 특성이다. 주입 후, 재료 개혁의 중합체 네트워크는 자체 치유를 허용하고 신속하게 시투4,5에서고체와 같은 젤을 형성할 수 있게 한다. 이러한 구조는 조직재생6,7을위한 약물 또는 비계에 대한 느린 방출 창고역할을 할 수 있다. 이들 물질은 약물 전달 기술,재생 의학 및 면역공학1,8,9,10,11,12를포괄하는 다양한 응용 분야에서 사용되어 왔다.
천연 소재(예를 들어, 알기네이트 및 콜라겐) 및 합성 물질(예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 또는 이와 유사한 수성 중합체)는 생체 적합성 주사용 하이드로겔물질(13,14,15)으로개발되었다. 많은 천연 소재는 재현성4,16에영향을 미치는 배치 대 배치 변동을 나타낸다. 이러한 물질은 종종 온도에 민감한, 생리 온도에 도달 하 고 치료; 따라서 이러한 자료를 처리하는 것은 추가적인 기술적 및 물류 적 과제를야기한다(17). 합성 물질은 보다 정밀한 화학적 제어와 우수한 재현성을 허용하지만, 이러한 물질은 때때로 생체 적합성을 제한하는 불리한 면역 반응의 대상이 될 수 있으며, 생체 내 치료 응용 분야에서 중요한특징인 생체내 치료 응용6,18,19. 최근 연구에 따르면 기계적 특성 최적화, 폴리머 네트워크 메쉬 크기, 생리활성 분자 큐, 생분해성 및 물질의 면역원성을 포함한 주사용 하이드로겔 소재엔지니어링에 관여하는 많은 복잡한 설계 기준이 있는 것으로 나타났다(20,21,22,23,24,25, 26). 이러한 모든 요소는 관심의 적용에 따라 고려해야 하며, 이는 모듈식 화학적 튜닝 가능한 플랫폼이 광범위한 응용 프로그램을 만족시키는 데 이상적입니다.
본 방법은 튜닝 가능한 기계적 특성, 높은 생체 적합성 및 낮은 면역원성을 나타내는 주사용 폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔 플랫폼의 제형 및 사용을 설명하고, 생리활성 분자 큐27,28,29,30,31,32,33을결합하기 위한 부위를 제시한다. 이러한 PNP 수압겔은 수성 변형 셀룰로오스 폴리머및 폴리(에틸렌 글리콜)-블록 폴리(lacticacid) (PEG-PLA) (PEG-PLA)(27) 27,34로 구성된 자체 조립 코어 쉘 나노입자로 구성되어 있어 수분자 네트워크를 생성한다. 보다 구체적으로, 도데킬-변형 된 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스 폴리머(HPMC-C12)는이러한 나노입자 사이의 PEG-PLA 나노입자 및 교량의 표면과 동적으로 상호 작용하여 이 중합체네트워크(27,34)를형성한다. 이러한 동적, 다원 상호 작용을 통해 재료는 주입 중에 얇은 전단을 하고 투여 후 빠르게 자가 치유할 수 있습니다. PNP 하이드로겔 성분은 간단한 1냄비 반응을 통해 쉽게 제조되고 PNP 하이드로겔은 두성분(35)의간단한 혼합에 의해 온화한 조건하에서 형성된다. 제조의 용이성으로 인해 이 하이드로겔 플랫폼은 스케일에서 매우 확장성이 높습니다. PNP 하이드로겔의 기계적 특성 및 메쉬 크기는 제형에서 폴리머 및 나노입자 성분의 중량 퍼센트를 변경하여 제어됩니다. 이 플랫폼을 가진 사전 연구는 PNP 하이드로겔이 생체 적합성이 높고 생분해성 및 비면역원성28,30,31임을나타낸다. 전반적으로, 이 하이드로겔은 수술 후 접착 방지, 조직 공학 및 재생, 지속적인 약물 전달 및 면역 공학을 포괄하는 생물 의학 응용 분야에서 광범위한 유틸리티를 제시합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>21G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td>PNP hydrogel injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G, 4 in hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>N224</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates, black, clear bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3540</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, black</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-627</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, clear</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8729K66</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>NP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR759015-100EA</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DynaPro II Plate Reader</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>300007-392 (EA)</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>8300015027</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer elbow connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30800-12</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-456</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Spatula</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1229F13</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>TS-RT2-100</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11382II</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>DHR-2 Rheometer</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516-5G</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications

이러한 방법은 생체 재료로 사용하기 위해 주사용, 초분자 폴리머 나노 입자 (PNP) 하이드로겔을 공식화하는 방법을 설명합니다. PNP 하이드로겔은 동적, 다원적 상호 작용을 통해 비 공유 크로스 링커 역할을 하는 네트워크 폴리머및 자체 조립 코어 쉘 나노 입자로서 소수성 변형 셀룰로오스의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. 이러한 방법은 나노 침전을 통해 이러한 자체 조립 나노 입자의 형성뿐만 아니라 튜닝 가능한 기계적 특성으로 하이드로겔을 형성하기 위해 두 성분의 제형 및 혼합을 모두 설명합니다. 합성된 재료의 품질을 특성화하기 위해 다이나믹 광 산란(DLS) 및 유경학의 사용도 상세하다. 마지막으로, 약물 전달, 바이오 의약품 안정화 및 세포 캡슐화 및 전달을 위한 이러한 하이드로겔의 유용성은 약물 방출, 열 안정성 및 세포 정착 및 생존가능성을 특성화하기 위해 체외 실험을 통해 입증된다. 생체 적합성, 주사용 성 및 가벼운 젤 형성 조건으로 인해 이 하이드로겔 시스템은 다양한 생체 의학 응용 분야에 적합한 쉽게 튜닝할 수 있는 플랫폼입니다.

PNP 하이드로겔 제작 및 특성화 PNP 수압겔은 2개의 1차 성분인 소수성 변형 HPMC 폴리머 및 PEG-PLA나노입자(도 1a)의혼합을 통해 형성된다. 치료화물은 하이드로겔 제조 전에 나노입자 성분을 희석하는 데 사용되는 추가 완충액에 가장 쉽게 통합된다. 다운스트림 생체 의학 특성화를 위해, 두 성분(도 1b)의 간단하고 재현 가능한 혼합을 가능하게 하는 팔꿈치 혼합 방법을 사용하는 것이편리하다. 적절한 혼합 후, 하이드로겔은 주사기에서 단단하게 느껴져야 하지만, 압력하에서 수율과 표준 바늘(21G 도시)으로부터 돌출하였다(도1c). 주입 후 하이드로겔은 중력에서 흐르는 것을 저항하는 고체와 같은 재료로 빠르게 설정해야합니다. 하이드로겔을 완전히 특성화하고 일관된 배치-배치 제품을 보장하기 위해 류미터에서 여러 가지 실험을 사용하여 샘플을 분석해야 합니다. 겔의 전단 숱이 나고 자가 치유 능력은 각각 유동 스윕 프로토콜 및 스텝 전단 프로토콜을 사용하여 쉽게 관찰될 것이다(도2a,b). 2:10 제제와 같은 딱딱한 젤의 경우, 전단 속도가 0.1에서 100s-1로증가함에 따라 유동 스윕 중에 적어도 두 배의 진도를 감소시키는 점도를 찾아야 하며, 이는 주입 중 기계적 조건을 시뮬레이션한다. 스텝 전단 프로토콜은 고전단 단계하에서 점도의 수주 감소와 낮은 전단 단계 동안 기준점도에 대한 빠른 반환(<5s 복구 시간)을 공개해야 합니다. 선형 점탄성 정권에서 진동 전단 주파수 스윕 실험을 이용한 저장 및 손실 계열의 특성화는 0.1-100 rads-1(도 2c)의주파수 범위에서 고체와 같은 특성을 드러내야 한다. 특히, 전형적으로 2:10 하이드로겔과 같은 단단한 제형에 대한 낮은 주파수에서 관찰할 수 있는 전단 저장 및 손실 계둘리의 크로스오버가 없어야 한다. 이러한 크로스오버 이벤트는 변형된 HPMC 또는 PEG-PLA 폴리머, 또는 PEG-PLA 나노입자의 크기 및 분산성 중 에서 시작 물질의 품질에 문제를 나타낼 수 있다. 1:5 하이드로겔과 같은 약한 하이드로겔 제형에 대해 크로스오버 이벤트가 예상될 수 있다는 점에 유의해야 한다. PNP 하이드로겔의 진동 전단 진폭스윕은 높은 응력 값이 적용될 때까지 재료가 굴복하지 않는다는 것을 나타내며, 이는 이러한 물질이 수율 응력을 가지고 있음을 나타내며, 이는 재료가 흐르는 데 필요한 응력의 임계값입니다.
PNP 하이드로겔의 방출 역학 특성화 약물 전달을 위한 PNP 젤을 설계하는 데 필수적인 단계는 선택한 제제로부터 의약 방출 운동제의 특성화입니다. 이를 위한 몇 가지 기술이 있지만, 간단한 체외 방법론은 조기 제형개발(도 3a)에서유용한 데이터를 제공한다. HPMC-C12 또는 NPs의 양을 조절하여 PNP 하이드로겔의 폴리머 함량을 다양화하는 것은 이러한 하이드로겔의 기계적 특성 및 메쉬 크기를 조정하는 가장 간단한 방법이며, 이는 폴리머 네트워크를 통한 화물의 확산및 재료로부터의 방출 속도에 직접적인 영향을 미칠 수있다(도 3b). 동적 메쉬 크기(예: 높은 분자량 또는 대형 유체 역학 반경)보다 큰 화물의 경우, 연구자들은 하이드로겔 창고에서 화물의 느리고 용해 매개 방출을 기대해야 합니다. 다이나믹 메쉬 크기를 화물의 크기보다 크거나 동일한 제형은 기존의 화물 확산 모델을 사용하여 설명할 수 있는 확산 매개 방출을 허용하고46,47,48,49를방출할 수 있다. 방출 곡선의 형상에 기초하여, 연구원은 하이드로겔을 재구성하여 더 느린(예를 들어, 폴리머 함량을 증가) 또는 더 빨리(예를 들어, 폴리머 함량을 감소) 방출쪽으로 조정할 수 있다.
치료화물의 안정성 평가 하이드로겔 제형에서 치료화물의 안정성을 결정하는 것은 전임상 또는 세포 연구를 시작하기 전에 매우 중요합니다. PNP 하이드로겔은 약물을 캡슐화하기 위한 다른 합성 방법에 비해 벌크 재료에 혼합하여 화물을 부드럽게 통합하며 캡슐화로 인해 화물이 손상될 가능성은 낮습니다. 이러한 연구는 PNP 하이드로겔이 인슐린과 같은 열 불안정에 취약한 화물을 안정화할 수 있으며, 유통 기한을 상당히 연장하고 냉장 보관 및 유통에 대한 의존도를 감소시킬 수 있음을나타낸다(그림 4). 하이드로겔에 캡슐화한 직후뿐만 아니라 장기간 보관한 후 화물의 상태를 평가하는 것이 중요합니다. 이러한 데이터는 인슐린 응집측정을 위한 간단한 형광 분석을 사용하여 지속적인 열 및 기계적 스트레스 하에서 28일간의 저장 후 하이드로겔에서 안정적으로 유지된다는 것을 보여줍니다. 적절한 판 분석이 불가능한 경우를 위한 대체 기술은 단백질 약물의 이차 구조를 결정하는 데 특히 유용한 화물의 원형 이차측정을 수행하는 것이다.
PNP 하이드로겔의 세포 생존 가능성 및 분산 결정 많은 치료 세포는 생존하기 위해 접착 모티프를 필요로하며, 따라서 아르기닌 글리신 -아스파르트산 (RGD) 펩티드와 같은 인테그린 모티프의 포함은 세포 요법을위한 PNP 하이드로겔을 적응시키는 중요한 단계이다50. 모듈식PEG-P를포함하는 PLA 폴리머는 간단한 "클릭"화학28,51을통해 PEG 코로나의 화학적 기능화를 가능하게 한다. 이 예에서, 세포-접착제 RGD 펩타이드는 PNP 하이드로겔 구조와의 세포 결합을 촉진하기 위해 PEG-PLA 폴리머에 부착되었다. 접착 부위가 부족한 제형은 캡슐화된 세포가 이러한 접착 모티프(도5a,b)를갖는 제형에 캡슐화된세포에 비해 증식하는 데 실패함에 따라 낮은 세포 생존율을 가질 것이다. 캡슐화된 세포는 형광 현미경으로 세포 계수를 용이하게 하기 위해 칼세인 AM 또는 다른 적절한 형광염(예를 들어, CFSE)으로 표지될 수 있다. 최적화 하는 동안, 생존력 은 통합 된 기능성 제형이 향상된 생존력과 확산을 제공하고 있는지 확인하기 위해 수정되지 않은 PNP 하이드로겔과 비교되어야합니다. 통합 기능성 제형이 수정되지 않은 하이드로겔과 유사한 효능을 제공하는 경우, 이는 유착 모티프를 통합하는 데 사용되는 유도 화학의 실패를 나타낼 수 있다.
연구원은 캡슐화된 세포가 적절한 하이드로겔 제형을 사용할 때 하이드로겔 배지를 통해 균등하게 분산될 것으로 예상해야 한다. 이것은 하이드로겔 투여 도중 세포의 일관되고 예측 가능한 투여를 허용할 것이고 행정 후에 하이드로겔에 있는 세포의 현지 보존으로 번역되어야 합니다. 세포의 분포는 형광 현미경 기술을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 세포는 적당한 염료로 표지되고 공초점 현미경 검사를 사용하여 심화될 수 있습니다. 이미지는영상(도 5c)과영상의 수직 축을 따라 평균 형광 강도를 측정하기 위해 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 시각적으로 평가할 수 있다(도 5c) 및 또한 정량적으로(도 5d)...또는 중력에 의한 축 세포 침전이 발생할 것으로 예상되는 축 세포 침전이 발생할 것으로 예상된다.] 하이드로겔 제형이 장기간 에 걸쳐 현탁액에서 세포를 지원하기에는 너무 약한 경우, 도 5에서1:1 제형에서 관찰된 바와 같이 세포 침전이 발생할 것이다. 폴리머 함량을 늘리면 침전으로 인한 불균일한 세포 분산 문제를 해결할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig1v4.jpg"> 도 1: 폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔은 두 가지 성분을 혼합하여 쉽게 형성된다. (a)제1 성분은 도데릴 변형 된 하이드록시 프로필메틸 셀룰로오스 (HPMC-C12)의용액이며, 두 번째 성분은 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록 폴리 (락티산) (PEG-나노 입자)의 용액이다. 이 두 성분의 부드러운 혼합은 주사용 하이드로겔을 생성하며, 여기서 HPMC-C12 폴리머는 PEG-PLA 나노 입자와의 동적다목적, 다자간 상호 작용으로 물리적으로 교차된다. (b)PNP 하이드로겔의 1성분을 함유한 각 주사기 2개와 혼합하여 겔 제형을 시연하는 사진. 두 주사기를 Luer-lock 팔꿈치 커넥터와 연결함으로써 두 성분을 멸균 조건하에서 쉽게 혼합하여 즉시 사용하기 위해 주사기에 미리 로드된 거품이 없는 하이드로겔을 생성할 수 있습니다. NP 용액은 데모를 위해 파란색으로 염색됩니다. (c)PNP 하이드로겔의 주입 및 재고화의 시연. (i) PNP 하이드로겔이 부착된 21G 바늘을 장착한 주사기에 부착된 다. (ii) 주사는 일시적으로 중합체와 나노 입자 사이의 상호 작용을 중단 전단 아래에 하이드로겔을 배치, 유체 와 같은 일관성을 생성. (iii) 후 사출, 동적 중합체 나노 입자 상호 작용은 빠르게 개혁되어 하이드로겔이 고체로 자가 치유할 수 있게 합니다. (iv) 고체 하이드로겔은 중력과 같은 수율 응력보다 약한 힘 하에서 흐르지 않습니다. PNP 하이드로겔은 데모를 위해 파란색으로 염색됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig2v3.jpg"> 도 2: 2개의 PNP 하이드로겔 제형의 유변학적 특성화. 제형은 폴리머 wt%로 표시됩니다.%: NP wt.%. (a)PNP 하이드로겔의 낮은 전단 속도에서 높은 전단 속도로 꾸준한 전단 흐름이 스윕됩니다. 전단 속도의 함수로서의 점도는 전단 숱이 특성을 특징으로합니다. (b)PNP 하이드로겔의 자가 치유특성을 입증하는 높은 전단 속도(빨간색 배경; 10s-1)에낮은 전단 속도(흰색 배경, 0.1s-1)사이의 진동 전단 속도를 진동시키는 기능으로서 점도. 전단 요금은 각각 30s에 부과됩니다. (c)탄성 스토리지 계달수 G+ 점성 손실 계수 G" 다양한 PNP 하이드로겔 제형에 대한 일정한 1 % 변형에서 주파수의 함수로. (d)진폭은 10 개의 rad /s의 일정한 주파수에서 스윕하여 탄력적 인 저장 modulus G′와 점성 손실 계수 G"의 응력의 함수로 스윕합니다. 이 유변학적 특성화는 품질 관리를 위한 비교로 사용될 수 있습니다. 이 그림은 Grosskopf 등에서적응되었습니다. 28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2.jpg"> 그림 3: PNP 하이드로겔에서 소 혈청 알부민 (BSA)의 체외 방출. 제형은 폴리머 wt%로 표시됩니다.%: NP wt.%. (a)실험체 방출 프로토콜을 설명하는 회로도. 알리쿼트는 시간이 지남에 따라 PNP 하이드로겔로 로드된 모세관 튜브에서 제거됩니다. (b)1:10 PNP, 2:5 PNP 및 2:10 PNP로부터 BSA의 체외 방출은 분석 시 수집된 총 질량으로 나눈 지정된 시점에 의해 수집된 질량으로 보고된다(평균 ± SD로 표시된 데이터; n = 3). BSA는 흡광도 측정을 통해 검출되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2.jpg"> 그림 4: ThT 분석에 의해 PNP 하이드로겔에 캡슐화된 인슐린의 열 안정성. 제형은 폴리머 wt%로 표시됩니다.%: NP wt.%. 인슐린은 1:5 와 2:10 PNP 하이드로겔에서 모두 37°C의 스트레스노화 조건과 지속적인 동요에서 28일 동안 집계되지 않은 채로 남아 있었다. PBS에서 공식화된 인슐린을 위한 집계 시간은 20 ± 4시간이었습니다 (평균 ± SD, 집계 임계값 750,000 AFU). 평균 n = 4개의 실험 복제(AFU, 임의형 형광 단위)로 제시된 데이터. 이 그림은 Meis 등에서적용되었습니다. 38<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2.jpg"> 그림 5: PNP 하이드로겔에 세포 생존가능성 및 세포 침전. (a,b)인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)를 가진 PNP 하이드로겔의 세포 생존성 연구. (a)1:5 PNP 하이드로겔의 대표적인 이미지는 PEG-PLA NP에 컨쥬어드된 세포-접착제 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 모티프를 유의하여 공초점 이미징에 30분 전에 칼신 염색하였다. 스케일 바는 1일째에 형광세포의 수에 비해 이미지내형세포의 수로 정의된 6일째100 μm.(b)세포 생존가능성을 나타낸다(평균 ± SD로 표시된 데이터; n = 3). (c,d) hMSC를 장착하고 정착실험. (c) 칼신 AM 염색 hMSC의 최대 강도 이미지는 1:1 PNP 하이드로겔(상단 행)과 1:5 PNP 하이드로겔(아래 줄)으로 캡슐화되어 세포 침전을 정량화한다. 스케일 바는 하이드로겔의 수직 프로파일을 따라 hMSC의 평균 수평 픽셀 강도 1mm를 나타낸다. 이 그림은 Grosskopf 등에서적응되었습니다. 28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

이 프로토콜은 주사용, 초분자 폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔 생체 재료의 합성 및 제형을 설명합니다. 약물 전달, 바이오 의약품 안정화 및 세포 캡슐화 및 납품을 위한 이러한 물질의 적용이 입증된다.

세포 및 약물 전달 응용 을 위한 주사용 수급 분자 고분자 고분자 나노 입자 하이드로겔

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

당사의 프로토콜은 생체 재료로 사용하기 위해 폴리머 나노 입자 하이드로겔의 제형을 용이하게합니다. 우리는 연구원이 번역 응용 프로그램을 위해이 자료를 개발하고 기본적인 생물학적 질문을 탐구할 수 있기를 바랍니다. PNP 하이드로겔은 작은 직경의 바늘과 카테터를 통해 쉽게 주입되지만 주입 후 신속하게 자가 치유됩니다.이것은 오랜 기간 동안 약물과 세포의 비 침습적 제어 전달을 허용합니다. 이 기술은 국소화된 치료 및 확장된 약 방출을 위한 경계를 밀어내고, 암에서 조직 재생에 수동적인 예방 접종에 이르는 광범위한 격렬한 조건에 대한 의미와 함께. 나노 강수량에 의해 나노 입자를 합성하려면 8 밀리리터 유리 신자극 바이알에 50 밀리그램의 PEG-PLA 폴리머를 추가하고 유리에 아세토나이트 1 밀리리터를 추가합니다.소용돌이가 완전히 녹습니다. 다음으로 10밀리리터의 초순수수를 작은 교반바가 있는 20밀리리터 유리 신자극 바이알에 넣고, 분당 600회전으로 설정된 스티어 플레이트에 바이알을 놓습니다. 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 폴리머 용매 용액 1밀리리터를 물 바이알에 드롭방향으로 추가합니다.코어 쉘 나노 입자는 폴리머 용매 용액이 물 전체에 급속하게 분산됨에 따라 형성됩니다. 표준 프로토콜에 따라 동적 광 산란하여 파티클 크기를 확인합니다. 그런 다음 나노 입자 용액을 원심 필터 장치로 이송하여 용액을 250 마이크로리터 미만으로 농축하고 적절한 버퍼로 나노 입자를 재연합니다.하이드로겔을 준비하려면 333밀리그램의 6%HPMC-C12 스톡 솔루션을 1밀리리터 루어 잠금 주사기에 추가하고 20%나노입자 스톡 솔루션의 500마이크로리터와 8밀리리터 바이알에 PBS 167 마이크로리터를 추가합니다. 혼합 후 바늘을 사용하여 희석 된 나노 입자 용액으로 다른 1 밀리리터 루어 잠금 주사기를 채우고 두 주사기를 팔꿈치 믹서에 부착하십시오. 균일하고 불투명한 백색 하이드로겔 소재가 형성될 때까지 약 60사이클동안 두 가지 솔루션을 혼합합니다.제조된 하이드로겔의 유변학적 특성을 측정하기 위해, 엄선된 형상 갭에 따라 하이드로겔의 적절한 부피를 톱니모양 류미터 플레이트의 중심으로 주입하고 진동 및 유량 테스트를 사용하여 시료의 기계적 특성을 측정한다. 하이드로겔에서 약물 방출을 특성화하기 위해 먼저 에폭시를 사용하여 각 튜브의 한쪽 끝을 밀봉하여 유리 모세 혈관을 준비합니다. 에폭시가 설정되면 4인치 22게이지 피하 바늘을 사용하여 100~200마이크로리터의 하이드로겔을 샘플당 최소 3개의 튜브에 주입하고, 각 하이드로겔 부피에 200~300마이크로리터를 조심스럽게 추가합니다.적절한 시점에서, 약물 방출의 예상 된 기간에 따라, 조심스럽게 하이드로겔 표면을 방해하지 않고 각 모세관에서 PBS를 제거하고 PBS의 신선한 볼륨을 추가하는 바늘을 사용합니다. 연구가 완료되면 수집된 PBS 알리쿼트를 적절한 방법으로 분석하여 각 시점에서 방출되는 약물의 양을 정량화한다. 겔 캡슐화된 인슐린의 열 안정성을 특성화하기 위해 인슐린과 티오플라빈 T를 하이드로겔에 적재하고 21 게이지 바늘을 사용하여 200 마이크로리터의 화물을 주입하고 시료당 최소 3개의 블랙 96웰 플레이트에 하이드로겔을 장착한다.그런 다음 광학적으로 명확한 접착판 씰로 플레이트를 밀봉하여 증발을 방지하고 온도 제어, 흔들림 및 운동 읽기 프로그래밍이 장착된 플레이트 판독기에 플레이트를 삽입합니다. 하이드로겔 캡슐화된 세포 생존가능성을 평가하기 위해 21게이지 바늘을 사용하여 150마이크로리터의 하이드로겔을 샘플당 3개의 우물에 적절한 농도를 포함하는 하이드로겔을 투명 하 고 96웰 플레이트에 넣고 하이드로겔의 각 부피에 적합한 세포 배지 의 100 마이크로리터를 추가한다. 문화의 첫날, 각 샘플 그룹에 대한 적절한 시점에서 각 하이드로겔의 상체를 2 밀리머 칼세인 AM 용액의 50 마이크로리터로 교체하십시오.30 분 잠복 후, 공초점 현미경 검사법에 의해 각 우물의 중심을 이미지. 캡슐화된 세포의 능력을 평가하여 주사 전에 주사기에 정착하기 위해, PBS 농도에서 밀리리터당 6개의 세포로 10번으로 관심 있는 세포를 희석시키고 실온에서 10분 동안 50마이크로리터의 마이크로리터로 세포를 얼룩지게 한다. 인큐베이션의 끝에서, 하이드로겔의 500 ~ 700 마이크로리터와 세포를 혼합하고 21 게이지 바늘을 사용하여 샘플 당 적어도 하나의 큐벳의 바닥에 하이드로겔을 함유하는 세포의 100~200 마이크로리터를 주입한다.그런 다음 주입 직후와 시드 후 1~ 4시간 후에 공초점 현미경의 단계에 평평하게 누워 있는 큐벳을 이미지하여 세포가 하이드로겔에 정착했는지 또는 중단된 상태를 관찰합니다. 겔의 전단 숱이 나고 자가 치유 능력은 각각 유동 스윕 및 스텝 전단 프로토콜을 사용하여 관찰될 수 있다. 초당 0.1에서 100라디안 범위의 선형 점탄성 정권에서 진동 전단 주파수 스윕 실험을 이용한 저장 및 손실 계수의 특성화가 고체와 같은 특성을 나타낸다.전형적으로 경직제에 대한 낮은 주파수에서 관찰된 전단 저장 및 손실 계둘리의 크로스오버가 없어야 하며, 크로스오버 이벤트는 약한 하이드로겔 제형에 대해 예상될 수 있다. PNP 하이드로겔의 폴리머 함량을 다양화하면 폴리머 네트워크를 통한 화물의 확산과 재료로부터의 방출 속도에 직접적인 영향을 미칠 수 있다. PNP 하이드로겔은 열 불안정에 취약한 화물을 안정화하여 화물 유통 기한을 상당히 연장하고 콜드 체인 저장 및 유통에 대한 의존도를 줄일 수 있습니다.인테그린 모티프의 포함은 세포 요법을 위한 PNP 하이드로겔을 적응시키는 데 유용할 수 있습니다. 캡슐화된 세포는 시각화 및 정량화를 용이하게 하기 위해 형광으로 표지될 수 있다. 예를 들어, 접착 부위가 부족한 제형은 캡슐화된 세포에 비해 증식하는 데 실패하고 RGD와 같은 접착 모티프를 갖는 제형에 비해 증식하는 데 실패하기 때문에 낮은 세포 생존력을 가질 것이다.우리는 여전히 제형의 변화가 폴리머 매트릭스의 유변학적 특성과 동적 메쉬에 어떤 영향을 미치는지 탐구하고 있습니다. 우리는 또한 HYDROgel 내의 분자의 확산을 연구하기 위하여 FRAP를 이용합니다. 이 물질은 지속적인 납품이 약 납품, 백신 발달 또는 암 면역 요법에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 관하여 새로운 생물학 질문을 하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

연구

생체공학

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

돼지 심장에 현지 카테터 주입 용 주사 및 약물로드 초분자 히드로 겔

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

실크 나노 입자의 제조 및 약물 전달 응용 프로그램

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

중간 엽 기질자가 조건에서 세포 배양 배송 : 정형 외과 응용 프로그램에 대한 스마트 접근

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...