Name: injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications
Uploaded: 2021-02-07T15:00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications at JoVE.com

Denne forskningen ble økonomisk støttet av Center for Human Systems Immunology med Bill &Melinda Gates Foundation (OPP1113682) og Bill &Melinda Gates Foundation (OPP1211043). C.M.M. ble støttet av Stanford Graduate Fellowship og Stanford Bio-X William og Lynda Steere Fellowship. A.K.G. er takknemlig for et National Science Foundation Graduate Research Fellowship og Gabilan Fellowship of the Stanford Graduate Fellowship in Science and Engineering. S.C. ble støttet av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under prisnummer F32CA247352. Forfatterne vil også varmt anerkjenne Appel Lab-medlemmer, inkludert Dr. Gillie Roth, Dr. Anthony Yu, Dr. Lyndsay Stapleton, Dr. Hector Lopez Hernandez, Dr. Andrea d'Aquino, Dr. Julie Baillet, Celine Liong, Ben Ou, Emily Meany, Emily Gale og Dr. Anton Smith for deres innsats og tid i å hjelpe Appel Lab til å utvikle disse protokollene gjennom årene.

Før du begynner med denne protokollen, er det nødvendig å syntetisere HPMC-C12 og PEG-PLA ved hjelp av tidligere publiserte metoder27,28,29,30,31,36,37,38.
1. Nanopartikkelsyntese (NP) ved nanoprecipitation
MERK: Denne delen beskriver syntese av en enkelt gruppe NPer, som produserer 250 μL 20 wt% NPs i bufferløsning (50 mg tørr PEG-PLA polymer per batch). Merknader for oppskalering av antall bunker finner du på relevante trinn.
<ol><li>Mål 50 mg PEG-PLA polymer i et 8 ml hetteglass med glassskraintillasjon og tilsett 1 ml acetonitril. Virvel som skal oppløses helt. MERK: For å skalere opp antall partier, skalerer du lineært dette trinnet og legger til den totale mengden polymer og løsningsmiddel som trengs i et enkelt hetteglass.</li>
	<li>Tilsett 10 ml ultrarent vann i et 20 ml hetteglass med glassscullering med en liten rørestang. Sett på en røreplate satt til 600 rpm. MERK: Hvis trinn 1.1 er skalert, er det fortsatt nødvendig å ha et individuelt scintillasjonshette hetteglass å utfelle i for hver tilsvarende batch. For eksempel, for 200 mg polymer oppløst i 4 ml acetonitril, lag 4 x 20 ml scintillasjonsflasker.</li>
	<li>For å danne NPs ved nanoprecipitation, tilsett 1 ml polymerløsningsmiddeloppløsning dråpevis i vannet ved hjelp av en 200 μL pipette. Rør i 2 min. PLA-blokken på PEG-PLA er ikke løselig i vann, og som et resultat vil kjerneskall-NPs selvmontering med de hydrofobe PLA-blokkene som kjernen og de hydrofile PEG-blokkene som skallet.</li>
	<li>Kontroller partikkelstørrelsen ved dynamisk lysspredning (DLS). MERK: Denne prosedyren er spesielt skrevet for en kommersielt tilgjengelig plateleser med tilhørende programvarepakke (se Materialliste). For bruk av alternative instrumenter, se prøveforberedelsesmetodene beskrevet av instrumentets produsent.<ol>
<li>Fortynn 20 μL NP-oppløsning med 80 μL ultrarent vann (analysekonsentrasjon: 1 mg/ml PEG-PLA NPs). Tilsett 30 μL per brønn til en klar bunnsvart 384-brønnsplate (analyser i triplikat).</li>
		<li>Mål den hydrodynamiske radiusen og polydispersiteten til hver prøve med en DLS-plateleser ved hjelp av forhåndsinnstilte protokollalternativer i programvarepakken. Som et eksempel på en typisk protokoll, sett datainnsamlingsparametrene for å skaffe 5-10 DLS-målinger på 2-5 s varighet per oppkjøp, og rapporter deretter en gjennomsnittlig partikkelstørrelse og fordeling per brønn, beregnet fra kuleformet proteinmodell. For å danne hydrogeler med konsistente reologiske egenskaper, bør de resulterende partiklene være 30-50 nm i hydrodynamisk diameter med en polydispersitet (PD) < 0,2. MERK: Hvis NPs er mindre enn ønsket, bruk en oppløsning på 75% acetonitril / 25% dimetylsulfoksid (DMSO) i trinn 1.1. Økning av prosentandelen DMSO i løsningsmiddelløsningen vil generelt øke partikkelstørrelsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overfør NP-løsningen fra hetteglasset med 20 ml scintillasjon til en sentrifugalfilterenhet. Sentrifuge ved 4500 x g i 1 time for å konsentrere NP-løsningen til <250 μL.</li>
	<li>Resuspend i ønsket buffer, for eksempel fosfatbufret saltvann (PBS), til 20 wt% NPs. Pipette innholdet i sentrifugalfilterenheten inn i et tjære mikrocentrifugerør eller glassskrammasjonsflaske på en massebalanse. Bruk en liten mengde buffer (50-100 μL) for å skylle filteret og sikre innsamling av alle NPs. Legg til buffer for å nå en total masse på 250 mg. MERK: Partier kan samles under resuspension. NP lagerløsninger kan lagres ved 4 °C i ca. 1 måned. Skal ikke fryses. For lengre lagring må du kontrollere størrelsen og polydispersiteten til DLS før bruk.</li>
</ol>2. Hydrogelformulering og innkapsling av legemidler eller celler
MERK: Denne delen beskriver fremstilling av 1 ml 2:10 PNP hydrogelformulering, med 2:10 som betegner 2 wt% HPMC-C12 og 10 wt% NPs (12 wt% total fast polymer) og 88 wt% bufferløsning, legemiddellastløsning eller cellefjæring. Formuleringsprosentene kan varieres for å gi hydrogeler med en rekke mekaniske egenskaper. For eksempel ble 1:5 PNP hydrogeler brukt til celleoppgjør og levedyktighet eksperimentelle resultater vist.
<ol><li>Forbered lagerløsning på 6 wt% HPMC-C12 i PBS (eller annen buffer du velger). Løs opp i 48 timer for å sikre at polymeren er fullstendig dispergert. MERK: HPMC-C12-lagerløsningen er stabil i flere måneder ved romtemperatur. Lagring ved 4 °C anbefales imidlertid å hemme mikrobiell vekst.</li>
	<li>Tilsett 333 mg 6 wt% HPMC-C12 lageroppløsning i en 1 ml Luer-låsesprøyte.</li>
	<li>Tilsett 500 μL 20 wt% NP lagerløsning til et mikrosenterrør. Tilsett 167 μL PBS og pipette som skal blandes. Bruk en kanyle og fyll en ny 1 ml Luer-låsesprøyte med den fortynnede NP-oppløsningen. MERK: For å laste inn narkotikalast, beregn ønsket sluttkonsentrasjon av stoffet i hydrogelen og last riktig mengde inn i 167 μL PBS som blandes med NPs. Hvis en molekylær sonde er nødvendig for en in situ-analyse, for eksempel for å overvåke legemiddelstabilitet, laster du sonden på samme måte som beskrevet ovenfor for lasting av narkotikalast. For å laste celler, beregn ønsket sluttcellekonsentrasjon i hydrogelen og last riktig antall celler inn i 167 μL PBS som blandes med NPs.</li>
	<li>Bland de to hydrogelkomponentene (HPMC-C12 og NPs) ved hjelp av en albueblandingsmetode35.<ol>
<li>Fest Luer albuekontakten til sprøyten som inneholder NP-oppløsning (eventuelt også inneholder narkotikalast eller celler). Skyv NP-løsningen gjennom albuen til menisken er synlig i den åpne enden. Trekk litt tilbake og koble til sprøyten som inneholder HPMC-C12-oppløsningen. MERK: Det er viktig å minimere luft i albueforbindelsen for å forhindre dannelse og spredning av bobler gjennom hydrogelen under blandingsprosessen. Når du blander celler med albueblanderen, må du passe på å blande mer forsiktig, da blanding for raskt kan utsette cellene for høye skjærkrefter, noe som fører til celledød.</li>
		<li>Pump de to løsningene frem og tilbake gjennom albueblanderen i ca. 60 sykluser til det har dannet seg et homogent, ugjennomsiktig hvitt hydrogelmateriale.</li>
		<li>Skyv hele volumet av hydrogel inn i en sprøyte. Fjern den tomme sprøyten og trekk stempelet tilbake på den gelbelastede sprøyten for å gjenopprette materiale fra albuekontakten. Hette med kanyle eller plugg. MERK: Det er nødvendig å gjøre rede for ~ 300 μL tapt hydrogelvolum på grunn av det døde rommet i blandingsprosessen. For eksempel, hvis 700 μL av endelig hydrogelvolum er ønsket, bør det utarbeides 1 ml hydrogel. Hydrogelformuleringsprosessen kan skaleres opp ved hjelp av større sprøyter. For stive hydrogelformuleringer, som 2:10, kan det imidlertid bli vanskelig å blande og injisere fra sprøyter større enn 3 ml i volum på grunn av det økende forholdet mellom sprøytefat og albue eller nåleediameter.</li>
		<li>Oppbevar hydrogelen i sprøyten ved romtemperatur. Men hvis legemidler er innkapslet, anbefales lagring ved 4 °C med mindre legemiddelprodusenten spesifiserer noe annet. Ikke frys materialet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Måling av reologiske egenskaper ved hydrogelformuleringer
MERK: Denne protokollen brukes spesielt med det kommersielle reometeret som er nevnt i materialtabellen med en 20 mm serrated plategeometri. For bruk av andre instrumenter, se produsentens instruksjoner for prøvepreparering.
<ol><li>Formuler minst 700 μL PNP hydrogel for reologisk karakterisering.</li>
	<li>Injiser materiale i midten av den taggeterte revometerplaten. Mengden vil variere avhengig av det valgte geometrigapet. For referanse krever et gap på 700 μm ~ 400-500 μL materiale.</li>
	<li>Senk reometeret til trimgapet (500-1000 μm) og drei sakte den øverste reometerplaten da den kommer i kontakt med PNP-hydrogelen for å sikre at gapet fylles jevnt og helt.</li>
	<li>Kontroller belastningen på PNP-hydrogelen slik at den dekker hele reometerplatens overflate. Bruk en spatel eller plasttrimmer for å forsiktig trimme og fjerne overflødig materiale, slik at det har en veldig liten bule ut av platen.</li>
	<li>Senk reometeret til det endelige geometrigapet og kontroller at prøven er rent lastet.</li>
	<li>Mål de mekaniske egenskapene til prøven ved hjelp av oscillatoriske tester, for eksempel amplitude eller frekvenssveiper, eller strømningstester, for eksempel strømningssveiper eller trinntester. MERK: I de representative dataene som vises, kjøres oscillatoriske amplitudetester med en konstant frekvens på 10 rad / s. Oscillatoriske frekvenssveiper kjøres med en konstant 1% stamme, innenfor det lineære viskoelastiske regimet til amplitude-feiringen. Flow sweeps ble kjørt fra høye skjærhastigheter til lave skjærhastigheter39. Alle tester fullføres med 10 poeng per tiår med innsamlede data og ved romtemperatur. Testparameterne må kanskje justeres avhengig av egenskapene til formuleringen. Hvis du utsetter stivere PNP-materialer som 2:10-formuleringer for høye skjærhastigheter, kan materialet kastes ut av reometerplatene, noe som resulterer i unøyaktig mekanisk karakterisering og krever omlasting av prøven mellom etterfølgende tester. Representative data vist nedenfor kan brukes til sammenligning under kvalitetskontrolltesting.</li>
</ol>4. Karakterisering av in vitro narkotika frigjøring
<ol><li>Forbered kapillærrør ved å kutte glasskapillære rør til ønsket lengde. Forsegle den ene enden av hvert rør ved å bruke en engangsspatel eller pipettespiss for å skyve en liten mengde epoksy inn i enden av røret for å danne en plugg. Tillat epoksy å stille inn per produsents anbefalte tid. MERK: Røret må være kortere enn lengden på injeksjonsnålen. Rør med 2-3 μm indre diameter anbefales slik at en lengde på 2,5 tommer vil inneholde minst 300 μL totalt volum.</li>
	<li>Formuler minst 500 μL av et PNP-hydrogelmateriale i en sprøyte som inneholder stoffet av interesse. Forbered hver prøvegruppe i en separat sprøyte.</li>
	<li>Injiser 100-200 μL PNP hydrogel på bunnen av hvert kapillærrør ved hjelp av en lang hypodermisk nål (22G, 4 tommer). Forbered minst tre rør (triplikat) per prøvegruppe.</li>
	<li>(Valgfritt) Plasser fylte kapillærrør i et konisk sentrifugerør og sentrifuge i 1 min ved 1000 x g for å sikre at overflaten på hydrogelen er jevn. Dette trinnet må kanskje gjentas, endre tid og hastighet etter behov for å glatte overflaten av materialet. FORSIKTIG: Sørg for at sentrifugen er godt balansert.</li>
	<li>Fyll forsiktig 200-300 μL PBS på toppen av hydrogelen i kapillærrøret ved hjelp av en sprøyte og nål eller pipette. Ikke kontakt eller forstyrr overflaten av hydrogelen. Forsegle røret med en hette eller plugg eller deksel med minst to lag parafinfilm.</li>
	<li>(Valgfritt) Inkuber prøver ved 37 °C for å simulere in vivo-forhold.</li>
	<li>Fjern PBS forsiktig fra hver kapillær, uten å forstyrre hydrogeloverflaten, ved hjelp av en sprøyte og nål på utvalgte tidspunkter, avhengig av forventet tidsskala for legemiddelfrigjøring. Skift ut volumet som er fjernet med fersk PBS. Oppbevar aliquots under passende forhold. MERK: De anbefalte volumene og tidspunktene i trinn 4.3, 4.5 og 4.7 kan optimaliseres for å fange in vitro narkotika frigjøring over en rekke tidsskalaer, avhengig av hvor mye stoff som er lastet i materialet og hvor raskt det frigjør inn i supernatant. Et utvalg av utvalgte tidspunkter kan være 6 timer, 1 dag, 3 dager, 1 uke og 2 uker for et langsomt frigjørende stoff. Aliquots kan også analyseres når de er anskaffet i stedet for lagret.</li>
	<li>Når studien er fullført, analyser aliquots med en passende metode som ELISA, HPLC eller fluorescensanalyse for å kvantifisere mengden stoff som frigjøres på hvert tidspunkt40,41,42. Riktig deteksjonsmetode vil variere avhengig av stoffet av interesse. MERK: In vitro-utgivelsesstudier er nyttige for å sammenligne frigjøring mellom ulike hydrogelformuleringer eller narkotikafrakt. In vitro release-tidsskalaen indikerer ikke ofte direkte en forventet tidsskala for frigjøring in vivo.</li>
</ol>5. Karakterisering av termisk stabilitet av gel-innkapslet insulin
<ol><li>Formuler minst 1,2 ml PNP hydrogel per prøvegruppe. Etter prosedyren beskrevet i pkt. 2.3, last både insulin (legemiddellast) og tioflavin T (ThT) (molekylær sonde) inn i PNP-hydrogelen. MERK: Den primære aggregasjonsmekanismen og derfor inaktivering av insulin er gjennom dannelsen av amyloidfibriler. ThT er en egnet molekylær sonde fordi den produserer et sterkt fluorescenssignal i nærvær av amyloidfibriler, noe som muliggjør in situ overvåking av insulinaggregering. Avhengig av stoffets last av interesse, kan aggregasjon overvåkes gjennom forskjellige metoder. For de viste representative dataene ble insulin lastet inn i en endelig konsentrasjon på 6,7 eller 10 mg/ml og ThT til en endelig konsentrasjon på 25 μM.</li>
	<li>Bruk en 21 G nål og injiser 200 μL PNP hydrogel per brønn i en svart 96-brønnsplate. Hver utvalgsgruppe skal måles i minst triplikat. Tetningsplate med optisk klar klebeplatetetning for å forhindre fordampning.</li>
	<li>Sett platen inn i en plateleser utstyrt med temperaturkontroll, risting og kinetisk leseprogrammering og begynn å lese protokollen. Representative data ble innhentet med en kommersielt tilgjengelig plateleser (se Materialfortegner) ved hjelp av følgende betingelser:<ol>
<li>Stressede aldringsforhold: kontinuerlig lineær risting (410 cpm, 5 mm) ved 37 °C.</li>
		<li>Datainnsamling: eksitasjon/utslipp 450 nm/482 nm med 20 min intervaller MERK: Hvis en plateleser med temperaturkontroll, shaker og kinetiske lesemuligheter ikke er tilgjengelig, kan platen plasseres på en shakerplate i en inkubator og leses manuelt over bølgelengder på utvalgte tidspunkter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plott data som gjennomsnittlig fluorescenssignal over tid for hver gruppe. Tid til aggregering kan kvantifiseres ved å definere en vilkårlig signalterskel43. MERK: For de representative dataene som er vist nedenfor, ble terskelen definert som 750 000 vilkårlige fluorescensenheter (AFU). Denne verdien ble valgt til å være over den målte grunnlinjen mens den fortsatt var tilstrekkelig fanget opp utbruddet av aggregering indikert av en kraftig fluorescerende signaløkning.</li>
	<li>Avslutt analysen når prøver aggregeres eller visuelt begynner å dehydrere.</li>
</ol>6. Vurdering av cellens levedyktighet
<ol><li>Formuler minst 2 ml PNP-hydrogel som inneholder ønsket cellekonsentrasjon etter protokoller ovenfor (normalt 1 - 5 x 106 celler/ml). Forbered hver prøvegruppe i en separat sprøyte.</li>
	<li>Bruk en 21G nål, injiser 150 μL PNP hydrogel i hver brønn i en klar bunn 96-brønns plate; hver brønn er en replikering. Hver eksempelgruppe må ha 3-5 replikeringer per tidspunkt. Sentrifuger platen på 50 x g i 2 min for å spre hydrogelen jevnt i brønnen.</li>
	<li>Tilsett 100 μL av de aktuelle cellemediene på toppen av hydrogelen. Fjern dette mediet hver dag og legg til 100 μL nye medier.</li>
	<li>På dag 1 fjerner du mediet på toppen av hydrogelen for de angitte replikeringene for det tidspunktet for hver utvalgsgruppe. Tilsett 50 μL 2 mM calcein AM-oppløsning på toppen av hydrogelene. Inkuber i 30 min. MERK: Calcein AM kan brukes til å identifisere og merke levende celler. I levende celler omdannes den ikke-fluorescerende calcein AM til en grønn-fluorescerende calcein, ved intracellulære esteraser etter acetoksymetylsterhydrolyse.</li>
	<li>Bilde midten av hver brønn i en 96-brønns plate ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Underlev et område på minst 300 μm2 med en z-stabel som spenner over minst 150 μm. Bruk konfokale bølgelengdeinnstillinger for å fange opp fluorescensen til calcein (eksitasjon/utslipp: 495 nm/515 nm).</li>
	<li>Gjenta trinn 6.4 og 6.5 for hvert etterfølgende tidspunkt etter ønske.</li>
	<li>Hvis du vil analysere hvert bilde, skjuler du alle z-stack-bilder til et enkelt plan med maksimal intensitetsbilde ved hjelp av FIJI eller lignende programvare. Kvantifisere antall fluorescerende celler i hvert bilde. Forholdet mellom antall fluorescerende celler ved hvert tidspunkt sammenlignet med antall fluorescerende celler på dag 1 er den relative celle levedyktigheten i PNP-hydrogelene.</li>
</ol>7. Vurdering av celleoppgjør
<ol><li>Beregn antall celler som kreves for å formulere 500-700 μL PNP hydrogel ved en endelig konsentrasjon på 5 x 106 celler / ml. Suspender celler i 1 ml PBS i en konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml. Flekkceller ved å tilsette 50 μL 2 mM calcein AM. Inkuber cellene med fargestoffet i 10 min.</li>
	<li>Sentrifuger celler ved passende forhold, fjern PBS og resuspend cellene i volumet av PBS som trengs for å danne 500-700 μL av ønsket PNP hydrogel. MERK: Anbefalt hastighet og varighet for å sentrifugere hver enkelt celletype er vanligvis oppgitt i produktdokumentasjonen.</li>
	<li>Formulere 500-700 μL PNP hydrogel med de fargede cellene (5 x 106 celler/ml) etter protokolldel 2.</li>
	<li>Bruk en 21G nål, injiser 100-200 μL PNP hydrogel som inneholder de fargede cellene i bunnen av en cuvette. Tre replikeringer bør utføres for hver prøve. Beveg nålen frem og tilbake i cuvette mens du injiserer for å forhindre bobledannelse.</li>
	<li>Umiddelbart (tid t = 0), bilde cuvettes ligger på deres side over hele flat cuvette rektangel området ved foten av cuvette. Bruk konfokal flisskanning til å avbilde hele brønnområdet og bilde en z-stakk i 3D over en 100 μm dybde. For senere visualisering kan du enten bruke den konfokale mikroskopprogramvaren til å sette sammen alle de enkelte flisene og utføre en maksimal intensitetsprojeksjon for å danne et enkelt bilde av det store området eller bruke FIJI-programvare på en personlig datamaskin44,45.</li>
	<li>Etter bildebehandling, stå cuvettes oppreist.</li>
	<li>Bilde ved 1 t og 4 timer for å observere om cellene har bosatt seg i hydrogelen eller om de forblir suspendert. MERK: Disse tidspunktene er forslag og kan endres etter ønske.</li>
	<li>Hvis du vil analysere hvert bilde, skjuler du alle z-stack-bilder til et bilde med maksimal intensitet i ett plan. Ved hjelp av FIJI eller lignende programvare kvantifiserer du cellefordelingen ved å måle fluorescensintensiteten nedover den midtre vertikale profilen til cuvette for å bestemme graden av sedimentering.</li>
</ol>

Disse forfatterne har ingenting å avsløre.

Polymer-Nanopartikkel (PNP) hydrogeler er lett fremstilt og muliggjør langsiktig lokal levering av terapeutiske celler og legemidler gjennom minimal invasiv administrering via direkte injeksjon eller kateter levering. Disse protokollene beskriver formuleringen av PNP-hydrogeler og karakteriseringsmetodene for å sikre kvaliteten på de resulterende materialene. Supramolecular PNP hydrogeler er skalerbare å produsere og dannes gjennom enkel blanding av modifiserte cellulosepolymerer og polymere kjerneskall nanopartikler. De nåværende metodene beskriver facile prosedyrer for å danne geler forhåndslastet i sprøyter gjennom enkle albueblandingsprotokoller. Gjennom kvalitetskontrollmålinger for hver av komponentdelene, for eksempel DLS for å overvåke NP-størrelsen og distribusjonen, kan man reprodusere PNP-hydrogelmaterialer med konsistente reologiske egenskaper. Gjennom å variere mengden HPMC-C12 eller NPs, kan man modulere maskestørrelsen og stivheten til den resulterende PNP-hydrogelen. Disse egenskapene kan justeres for best å passe til en bestemt biomedisinsk anvendelse, og med de reologiske metodene som er beskrevet her, kan forskere karakterisere skjærfortynnende og selvhelbredende egenskaper til PNP-hydrogeler når de optimaliserer plattformen for sine spesifikke applikasjoner. Metoder for in vitro release studier er også beskrevet; forskere kan bruke disse studiene til å karakterisere den relative tidsskalaen for frigjøring av medikamenter av interesse, og informere fremtidige in vivo-studier. Ved hjelp av stabilitetsstudier kan forskere også vurdere disse materialenes evne til å bidra til å bevare den biologiske strukturen og stabiliteten til sensitive bioterapeutiske stoffer over tid og ekstreme temperaturer, med overbevisende potensielle anvendelser for å redusere kaldkjedeavhengigheten av bioterapeutikk. Til slutt, med enkle celle levedyktighetsanalyser, kan cellevekst og migrasjon innen PNP-materialer evalueres, med potensielle anvendelser i celleterapier og stillaser.
Vår gruppe har funnet mange overbevisende applikasjoner for PNP hydrogel plattform27. PNP hydrogeler har blitt brukt til langsom levering av subenhetsvaksiner, noe som muliggjør matchede kinetiske frigjøringsprofiler av antigener og adjuvanser for å øke størrelsen, varigheten og kvaliteten på den humorale immunresponsen31. PNP hydrogeler har vist seg å ha en mindre maskestørrelse enn de fleste brukte hydrogeler, så de er effektive til å bremse diffusjon og sakte frigjøre molekylær last. De unike vevstilslutningsegenskapene og mekaniske egenskapene til PNP-hydrogeler har også blitt brukt til å danne fysiske barrierer for å forhindre vedheft som oppstår fra kirurgi ved å sprøyte hydrogelene over store overflateområder av organer etter kirurgi30. PNP hydrogeler har også vist seg å være effektive celleleveringskjøretøy, og de mekaniske egenskapene beskytter faktisk celler fra de mekaniske kreftene som oppstår i sprøytenålen under injeksjon, noe som forbedrer celle levedyktigheten29. Når NPs er konjugert med et celleklebende peptid, kan cellene feste og engasjere seg med PNP-matrisen for å forbli levedyktige. Ved hjelp av denne tilnærmingen har PNP hydrogeler vist seg å forbedre lokal oppbevaring av injiserte stamceller sammenlignet med metoder ved bruk av flytende kjøretøy28. I tillegg har PNP hydrogeler vist seg å forhindre termisk indusert aggregering av innkapslet insulin, selv under sterke stressede aldringsforhold, noe som tyder på at disse materialene kan være i stand til å redusere behovet for å kjøle temperaturfølsomme legemidler38.
Samlet sett vil metodene beskrevet her tillate forskningsgrupper å fremstille og utforske PNP-hydrogeler som biomateriale. Disse protokollene gir laboratorieskala synteseteknikker for å fremstille nok hydrogelmateriale til å forfølge både in vitro- og in vivo-studier. Studiene beskrevet ovenfor indikerer at de dynamiske krysskoblingene til disse materialene gjør det mulig å være egnet for en rekke biomedisinske applikasjoner ved å tillate aktiv motilitet av fangede celler samtidig som passiv diffusjon av molekylær last begrenses. Det forventes at forskere vil finne PNP-plattformen et tilgjengelig og kraftig verktøy for å forbedre kliniske resultater gjennom kontrollert legemiddellevering og for å studere grunnleggende biologiske mekanismer som cellerekruttering og mekanobiologi.

Injiserbare hydrogeler er et fremvoksende verktøy for å levere terapeutiske celler og legemidler til kroppen på en kontrollert måte1. Disse materialene kan lastes med legemidler eller celler og kan administreres på en minimalt invasiv måte gjennom direkte injeksjon til overfladiske vev eller ved kateterlevering til dypt vev. Generelt består injiserbare hydrogeler av vannhovne polymernettverk som krysskobles sammen av forbigående, fysiske interaksjoner. I ro gir disse krysskoblingene en solid struktur til gelene, men ved påføring av tilstrekkelig mekanisk kraft blir disse krysskoblingene midlertidig forstyrret, og forvandler materialet til en væskelignende tilstand som lett kan strømme2. Det er disse reologiske egenskapene som gjør det mulig for fysiske hydrogeler å skjære tynt og strømme gjennom små nåleediametre under injeksjon3. Etter injeksjon, polymernettverket av materialreformene, slik at det kan helbrede seg selv og raskt danne en solid gel in situ4,5. Disse strukturene kan fungere som langsomme depoter for narkotika eller stillaser for vevregenerering6,7. Disse materialene har blitt brukt i ulike anvendelser som omfatter legemiddelleveringsteknologi, regenerativ medisin og immunoengineering1,8,9,10,11,12.
Både naturlige materialer (f.eks. alginat og kollagen) og syntetiske materialer (f.eks. poly(etylenglykol) (PEG) eller lignende hydrofile polymerer) er utviklet som biokompatible injiserbare hydrogelmaterialer13,14,15. Mange naturlige materialer viser batch-til-batch variasjon som påvirker reproduserbarhet4,16. Disse materialene er ofte temperaturfølsomme, herding når de når fysiologiske temperaturer; Dermed utgjør håndtering av disse materialene ytterligere tekniske og logistiske utfordringer17. Syntetiske materialer gir mer presis kjemisk kontroll og utmerket reproduserbarhet, men disse materialene kan noen ganger bli utsatt for ugunstige immunresponser som begrenser deres biokompatibilitet, en kritisk funksjon for in vivo terapeutiske applikasjoner6,18,19. Nylige anstrengelser har vist at det er mange komplekse designkriterier involvert i å konstruere et injiserbart hydrogelmateriale, inkludert optimalisering av mekaniske egenskaper, polymernettverksnettnettstørrelse, bioaktive molekylære signaler, biologisk nedbrytbarhet og immunogenisitet av materialet20,21,22,23,24,25,26. Alle disse faktorene må vurderes avhengig av anvendelsen av interesse, noe som betyr at en modulær, kjemisk justerbar plattform er ideell for å tilfredsstille en bred bredde av applikasjoner.
De nåværende metodene beskriver formuleringen og bruken av en injiserbar polymer-nanopartikkel (PNP) hydrogelplattform som viser justerbare mekaniske egenskaper, en høy grad av biokompatibilitet og lav immunogenisitet, og presenterer steder for å konjugere bioaktive molekylære signaler27,28,29,30,31,32,33. Disse PNP hydrogelene består av hydrofobisk modifiserte cellulosepolymerer og selvmonterte kjerneskall nanopartikler som består av poly (etylenglykol)-blokk-poly (melkesyre) (PEG-PLA)27,34 som samhandler for å produsere et supramolecular nettverk. Mer spesifikt samhandler de dodecyl-modifiserte hydroksypropylmetylcellulosepolymerene (HPMC-C12) dynamisk med overflaten av PEG-PLA nanopartikler og bro mellom disse nanopartiklene for å danne dette polymernettverket27,34. Disse dynamiske, multivalente interaksjonene gjør at materialene kan skjære tynn under injeksjon og raskt selvhelbrede etter administrering. PNP hydrogelkomponenter fremstilles lett gjennom enkle en-pot reaksjoner og PNP hydrogel dannes under milde forhold ved enkel blanding av de to komponentene35. På grunn av enkel fabrikasjon er denne hydrogelplattformen svært oversettbar i stor skala. De mekaniske egenskapene og maskestørrelsen til PNP-hydrogeler styres ved å endre vektprosenten til polymer- og nanopartikkelkomponentene i formuleringen. Tidligere studier med denne plattformen indikerer at PNP hydrogeler er svært biokompatible, biologisk nedbrytbare og ikke-immunogene28,30,31. Samlet sett presenterer disse hydrogelene bred nytte i biomedisinske anvendelser som omfatter postoperativ adhesjonsforebygging, vevsteknikk og regenerering, vedvarende legemiddellevering og immunoengineering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td>PNP hydrogel injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G, 4 in hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>N224</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates, black, clear bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3540</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, black</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-627</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, clear</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8729K66</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>NP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR759015-100EA</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DynaPro II Plate Reader</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>300007-392 (EA)</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>8300015027</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer elbow connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30800-12</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-456</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Spatula</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1229F13</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>TS-RT2-100</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11382II</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>DHR-2 Rheometer</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516-5G</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications

Disse metodene beskriver hvordan man formulerer injiserbare, supramolecular polymer-nanopartikkel (PNP) hydrogeler for bruk som biomaterialer. PNP-hydrogeler består av to komponenter: hydrofobisk modifisert cellulose som nettverkspolymer og selvmonterte kjerneskall nanopartikler som fungerer som ikke-kovalente krysskoblinger gjennom dynamiske, multivalente interaksjoner. Disse metodene beskriver både dannelsen av disse selvmonterte nanopartiklene gjennom nanoprecipitation samt formulering og blanding av de to komponentene for å danne hydrogeler med justerbare mekaniske egenskaper. Bruken av dynamisk lysspredning (DLS) og reologi for å karakterisere kvaliteten på de syntetiserte materialene er også detaljert. Til slutt demonstreres nytten av disse hydrogelene for legemiddellevering, biofarmasøytisk stabilisering og celleinnkapsling og levering gjennom in vitro-eksperimenter for å karakterisere legemiddelfrigjøring, termisk stabilitet og celleoppgjør og levedyktighet. På grunn av sin biokompatibilitet, injiserbarhet og milde geldannelsesforhold, er dette hydrogelsystemet en lett justerbar plattform egnet for en rekke biomedisinske applikasjoner.

PNP hydrogel fabrikasjon og karakterisering PNP-hydrogeler dannes gjennom blanding av de to primærkomponentene - hydrofobisk modifiserte HPMC-polymerer og PEG-PLA nanopartikler (figur 1a). Terapeutisk last er lettest innlemmet i tilleggsbufferen som brukes til å fortynne nanopartikkelkomponenten før hydrogelpreparat. For nedstrøms biomedisinsk karakterisering er det praktisk å bruke en albueblandingsmetode som muliggjør enkel og reproduserbar blanding av de to komponentene (Figur 1b). Etter tilstrekkelig blanding skal hydrogelen føles fast i sprøyten, men gi under trykk og ekstrudere fra en standard nål (21G vist) (Figur 1c). Etter injeksjon skal hydrogelen raskt settes inn i et fast materiale som motstår strømning fra tyngdekraften. For å karakterisere hydrogelen fullt ut og sikre konsistente batch-til-batch-produkter, bør prøver analyseres ved hjelp av flere forskjellige eksperimenter på et reometer. Gelens skjærfortynnende og selvhelbredende egenskaper vil lett bli observert ved hjelp av henholdsvis en flow sweep-protokoll og step-shear-protokoll (Figur 2a,b). For stivere geler, for eksempel 2:10-formuleringen, bør brukeren se etter viskositet for å redusere minst to størrelsesordener under strømningssveip når skjærhastigheten økes fra 0,1 til 100 s-1, som simulerer de mekaniske forholdene under injeksjon. Step-shear-protokollen bør avsløre en størrelsesordensreduksjon i viskositet under høyskjærtrinnene, og en rask retur (<5 s gjenopprettingstid) til baseline viskositet under de lave skjærtrinnene. Karakterisering av lagrings- og tapsmoduli ved hjelp av et oscillatorisk skjærfrekvenssveipeksperiment i det lineære viskoelastiske regimet bør avdekke faste egenskaper i frekvensområder fra 0,1-100 rad s-1 (figur 2c). Spesielt bør det vanligvis ikke være en crossover av skjærlagring og tap moduli som er observerbar ved lave frekvenser for stivere formuleringer som 2:10 hydrogeler. En slik crossover-hendelse kan indikere problemer i kvaliteten på startmaterialene, enten den modifiserte HPMC- eller PEG-PLA-polymeren, eller størrelsen og dispergeringen av PEG-PLA nanopartikler. Det skal bemerkes at en crossover-hendelse kan forventes for svakere hydrogelformuleringer, for eksempel 1:5 hydrogel. Oscillatorisk skjæramplitude feier på PNP-hydrogeler avslører at materialene ikke gir før høye spenningsverdier påføres, noe som indikerer at disse materialene har et utbyttestress, en terskel mengde stress som kreves for at materialet skal strømme.
Karakteriserende frigjøringskinetikk fra PNP-hydrogeler Et viktig skritt i utformingen av PNP geler for legemiddellevering er karakterisering av legemiddelfrigjøringskinetikk fra en valgt formulering. Det finnes flere teknikker for dette, men en enkel in vitro-metodikk gir nyttige data under tidlig formuleringsutvikling (Figur 3a). Varierende polymerinnhold i PNP-hydrogelene gjennom modulering av mengden HPMC-C12 eller NPs er den enkleste måten å justere de mekaniske egenskapene og maskestørrelsen på disse hydrogelene, noe som kan ha en direkte innvirkning på spredningen av last gjennom polymernettverket og frigjøringshastigheten fra materialene (Figur 3b). For last som er større enn den dynamiske maskestørrelsen (dvs. høy molekylvekt eller stor hydrodynamisk radius), bør forskerne forvente en langsom, oppløsningsmediert utslipp av last fra hydrogeldepotet. Formuleringer med dynamiske maskestørrelser større enn eller lik størrelsen på lasten vil tillate diffusjonsmediert utgivelse som kan beskrives ved hjelp av tradisjonelle modeller for lastdiffusjon og frigjøring46,47,48,49. Basert på formen på frigjøringskurven kan forskere reformulere hydrogelen for å justere den mot langsommere (f.eks. øke polymerinnholdet) eller raskere (f.eks. redusere polymerinnholdet) frigjøring.
Vurdering av stabilitet av terapeutisk last Å bestemme stabiliteten til den terapeutiske lasten i en hydrogelformulering er avgjørende før du begynner på prekliniske eller cellulære studier. Sammenlignet med andre syntetiske metoder for innkapsling av legemidler, inkorporerer PNP-hydrogeler last på en skånsom måte ved å blande seg inn i bulkmaterialet, og det er usannsynlig at innkapsling vil skade lasten. Disse studiene indikerer at PNP-hydrogeler også kan stabilisere last som er utsatt for termisk ustabilitet, for eksempel insulin, betydelig forlenger holdbarheten og reduserer avhengigheten av kald lagring og distribusjon (figur 4). Det er viktig å evaluere tilstanden til lasten umiddelbart etter innkapsling i hydrogelen så vel som etter lengre lagringsperioder. Disse dataene viser at insulin forblir stabilt i hydrogeler etter 28 dagers lagring under kontinuerlig termisk og mekanisk stress, ved hjelp av en enkel fluorescensanalyse for måling av insulinaggregering. En alternativ teknikk for tilfeller der en passende plateanalyse ikke er tilgjengelig, vil være å utføre sirkulære dikroismemålinger av lasten, noe som er spesielt nyttig for å bestemme sekundærstrukturen til proteinmedisiner.
Bestemme celle levedyktighet og dispersjon i PNP hydrogeler Mange terapeutiske celler krever at adhesjonsmotiver forblir levedyktige, og dermed inkludering av integrinske motiver som arginin-glycin-aspartinsyre (RGD) peptider er et viktig skritt i å tilpasse PNP hydrogeler for cellulære terapier50. Den modulære PEG- PLA-polymerensom består av NPs muliggjør kjemisk funksjonalisering av PEG-korona gjennom enkle "klikk" -kjemier28,51. I dette eksemplet ble celleklebende RGD-peptider festet til PEG-PLA-polymeren for å fremme celleengasjement med PNP-hydrogelstrukturen. Formuleringer som mangler adhesjonssteder vil ha lav celle levedyktighet da innkapslede celler ikke sprer seg sammenlignet med celler innkapslet i formuleringer med disse vedheftmotivene (Figur 5a,b). Innkapslede celler kan merkes med calcein AM eller et annet passende fluorescerende fargestoff (f.eks. CFSE) for å lette celletelling med et fluorescensmikroskop. Under optimalisering bør levedyktigheten sammenlignes med umodifiserte PNP-hydrogeler for å sikre at integrin-funksjonaliserte formuleringer gir økt levedyktighet og spredning. Hvis integrin-funksjonaliserte formuleringer gir lignende effekt som umodifiserte hydrogeler, kan dette tyde på en svikt i konjugeringskjemien som brukes til å inkorporere adhesjonsmotivene.
Forskere bør forvente at innkapslede celler skal fordeles jevnt gjennom hydrogelmediet ved bruk av en passende hydrogelformulering. Dette vil muliggjøre konsistent og forutsigbar dosering av celler under hydrogeladministrasjon og bør oversettes til lokal oppbevaring av celler i hydrogelen etter administrering. Fordelingen av celler kan enkelt bestemmes ved hjelp av fluorescensmikroskopiteknikker. Celler kan merkes med et passende fargestoff og deretter avbildes ved hjelp av konfikal mikroskopi. Bildene kan vurderes visuelt (figur 5c) og også kvantitativt (figur 5d) ved hjelp av ImageJ-programvare for å måle gjennomsnittlig fluorescensintensitet langs den vertikale aksen i bildet (eller langs hvilken aksecelleoppgjør på grunn av tyngdekraften forventes å oppstå). Hvis hydrogelformuleringen er for svak til å støtte cellene i suspensjon over lengre tidsrammer, vil det oppstå celleoppgjør, som observert i 1:1-formuleringen i figur 5. Økning av polymerinnholdet kan løse problemer med inhomogen celledispersjon på grunn av sedimentering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig1v4.jpg"> Figur 1: Polymer-nanopartikkel (PNP) hydrogeler dannes lett ved å blande to komponenter. (a) Den første komponenten er en løsning av dodecylmodifisert hydroksypropylmetylcellulose (HPMC-C12), og den andre komponenten er en løsning av poly(etylenglykol)-blokk-poly(melkesyre) (PEG-PLA) nanopartikler sammen med terapeutisk last. Skånsom blanding av disse to komponentene gir en injiserbar hydrogel, der HPMC-C12-polymerene er fysisk krysskoblet av dynamiske, multivalente interaksjoner med PEG-PLA nanopartikler. (b) Fotografi som demonstrerer gelformulering ved å blande med to sprøyter, som hver inneholder en komponent i PNP-hydrogelen. Ved å koble de to sprøytene med en Luer-lock albuekontakt, kan de to komponentene enkelt blandes under sterile forhold for å gi en boblefri hydrogel forhåndslastet i en sprøyte for umiddelbar bruk. NP-løsningen er farget blå med det formål å demonstrere. (c) Demonstrasjon av injeksjon av PNP hydrogeler og deres re-størkning. (i) PNP hydrogel i en sprøyte med en vedlagt 21G nål. (ii) Injeksjon plasserer hydrogelen under skjær som midlertidig bryter interaksjonene mellom polymer og nanopartikler, noe som skaper en væskelignende konsistens. (iii) Etter injeksjon reformerer de dynamiske polymer-nanopartikkelinteraksjonene raskt, slik at hydrogelen kan helbrede seg selv til et fast stoff. (iv) Den faste hydrogelen strømmer ikke under krefter som er svakere enn utbyttestresset, for eksempel tyngdekraften. PNP-hydrogelen er farget blå med det formål å demonstrere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig2v3.jpg"> Figur 2: Reologisk karakterisering av to PNP hydrogelformuleringer. Formuleringer er betegnet som polymer wt.%: NP wt.%. (a) Jevn skjærstrøm feier fra lav til høy skjærhastighet på PNP-hydrogeler. Viskositet som en funksjon av skjærhastighet karakteriserer skjærfortynnende egenskaper. (b) Viskositet som en funksjon av oscillerende skjærhastigheter mellom lave skjærhastigheter (hvit bakgrunn; 0,1 s−1) til høye skjærhastigheter (rød bakgrunn; 10 s−1) som demonstrerer selvhelbredende egenskaper til PNP-hydrogeler. Skjærsatser pålegges for 30 s hver. (c) Elastisk oppbevaring modulus G′ og viskøs tap modulus G" som en funksjon av frekvens ved en konstant 1% belastning for ulike PNP hydrogel formuleringer. (d) Amplitude feier med en konstant frekvens på 10 rad/s for å karakterisere elastisk lagring modulus G′ og viskøs tap modulus G" av PNP hydrogeler som en funksjon av stress. Denne reologiske karakteriseringen kan brukes som sammenligning for kvalitetskontroll. Dette tallet er tilpasset fra Grosskopf et al.28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig2v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2.jpg"> Figur 3: In vitro-utgivelse av bovint serumalbumin (BSA) fra PNP-hydrogeler. Formuleringer er betegnet som polymer wt.%: NP wt.%. (a) Skjematisk som beskriver den eksperimentelle in vitro release-protokollen. Aliquots fjernes fra PNP hydrogelbelastede kapillærrør over tid. (b) In vitro-utgivelsen av BSA fra 1:10 PNP, 2:5 PNP og 2:10 PNP rapportert som massen samlet inn av det angitte tidspunktet delt på den totale massen samlet inn under analysen (data vist som gjennomsnittlig ± SD; n = 3). BSA ble oppdaget gjennom absorbansmålinger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2.jpg"> Figur 4: Termisk stabilitet av insulin innkapslet i PNP-hydrogeler ved ThT-analyse. Formuleringer er betegnet som polymer wt.%: NP wt.%. Insulin innkapslet i både 1:5 og 2:10 PNP hydrogel forble unaggregated i over 28 dager ved stressede aldringsforhold på 37 °C og konstant agitasjon. Tid til aggregering av insulin formulert i PBS var 20 ± 4 timer (gjennomsnittlig ± SD, aggregasjonsterskel 750.000 AFU). Data presentert som et gjennomsnitt på n = 4 eksperimentelle replikeringer (AFU, vilkårlige fluorescensenheter). Dette tallet er tilpasset fra Meis et al.38<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2.jpg"> Figur 5: Celle levedyktighet og celleoppgjør i PNP hydrogeler. (a,b) Celle levedyktighetsstudier i PNP hydrogeler med humane mesenchymale stamceller (hMSCer). (a) Representative bilder av levedyktige hMSCer i 1:5 PNP hydrogeler med og uten celleklebende arginin-glycin-aspartinsyre (RGD) motiv konjugert til PEG-PLA NPs. hMSCs ble calcein-farget i 30 minutter før konfokal avbildning. Skalalinjen representerer 100 μm. (b) Celle levedyktighet på dag 6 definert som antall fluorescerende celler i bildet i forhold til antall fluorescerende celler på dag 1 (data vist som gjennomsnittlig ± SD; n = 3). (c,d) Celleinnkapsling og sedimentering av eksperimenter med hMSCer. (c) Bilder med maksimal intensitet av calcein AM-farget hMSC innkapslet i 1:1 PNP hydrogel (øverste rad) og 1:5 PNP hydrogel (nederste rad) over 4 timer for å kvantifisere celleoppgjør. Skalalinjen representerer 1 mm. (d) Gjennomsnittlig vannrett pikselintensitet for hMSCer langs hydrogelens vertikale profil. Dette tallet er tilpasset fra Grosskopf et al.28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications at JoVE.com

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

Denne protokollen beskriver syntesen og formuleringen av injiserbare, supramolecular polymer-nanopartikkel (PNP) hydrogelbiomaterialer. Anvendelser av disse materialene for legemiddellevering, biofarmasøytisk stabilisering og celleinnkapsling og levering er demonstrert.

Injiserbare supramolecular polymer-nanopartikkel hydrogeler for celle- og legemiddelleveringsapplikasjoner

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

Vår protokoll letter formuleringen av polymer-nanopartikkelhydrogeler for bruk som biomaterialer. Vi håper forskere vil utvikle dette materialet for translasjonelle anvendelser og utforske grunnleggende biologiske spørsmål. PNP hydrogeler injiseres lett gjennom nåler og katetre med liten diameter, men helbreder raskt etter injeksjon.Dette muliggjør ikke-invasiv kontrollert levering av narkotika og celler over lange tidsskalaer. Denne teknologien skyver grensene for lokalisert terapi og utvidet legemiddelfrigjøring, med implikasjoner for brede rasende forhold fra kreft til vevregenerering til passiv immunisering. For å syntetisere nanopartikler ved nanoutfelling, tilsett 50 milligram PEG-PLA polymer til et åtte milliliter glassskraintillasjonsflaske og tilsett en milliliter acetonitril til hetteglasset.Virvel som skal oppløses helt. Deretter tilsetter du 10 milliliter ultra rent vann til et 20 milliliter hetteglass med en liten rørestang og legg hetteglasset på en røreplate satt til 600 omdreininger per minutt. Bruk en 200 mikroliter pipette for å legge til en milliliter polymerløsningsmiddelløsning dråpevis til hetteglasset med vann.Kjerneskall nanopartikler vil dannes etter hvert som polymerløsningsmiddelløsningen raskt spres gjennom vannet. Kontroller partikkelstørrelsen ved dynamisk lysspredning i henhold til standardprotokoller. Overfør deretter nanopartikkelløsningen til en sentrifugalfilterenhet for å konsentrere løsningen til mindre enn 250 mikroliter og resuspender nanopartiklene i en passende buffer.For å forberede hydrogelen, tilsett 333 milligram 6% HPMC-C12 lagerløsning til en en milliliter Luer-låsesprøyte og tilsett 500 mikroliter av 20% nanopartikkelbestandsløsning og 167 mikroliter PBS til et åtte milliliter hetteglass. Etter blanding, bruk en nål til å fylle en annen milliliter Luer låsesprøyte med fortynnet nanopartikkeloppløsning og fest de to sprøytene til en albueblander. Bland de to løsningene i ca. 60 sykluser til et homogent, ugjennomsiktig hvitt hydrogelmateriale har dannet seg.For å måle de reologiske egenskapene til den formulerte hydrogelen, injiser riktig volum hydrogel i henhold til det valgte geometrigapet i midten av en serrated revometerplate og bruk oscillatoriske og strømningstester for å måle de mekaniske egenskapene til prøven. For å karakterisere legemiddelfrigjøring fra hydrogelen, lag først en glasskapillær ved å bruke epoksy for å forsegle den ene enden av hvert rør. Når epoksyen er satt, bruk en firetommers 22 gauge hypodermisk nål for å injisere 100 til 200 mikroliter hydrogel i minst tre rør per prøve, og tilsett forsiktig 200 til 300 mikroliter PBS på hvert volum hydrogel.På riktig tidspunkt, i henhold til forventet tidsskala for legemiddelfrigjøring, bruk en nål for å forsiktig fjerne PBS fra hver kapillær uten å forstyrre hydrogeloverflaten og legge til et nytt volum PBS. Når studien er fullført, analyser de innsamlede PBS-aliquots med en passende metode for å kvantifisere mengden stoff som frigjøres til hvert tidspunkt. For å karakterisere den termiske stabiliteten til gelinnkapslet insulin, last både insulin og tioflavin T inn i hydrogelen som demonstrert, og bruk en 21 gauge nål til å injisere 200 mikroliter av lasten og sonde lastet hydrogel i minst tre brønner av en svart 96-brønns plate per prøve.Forsegle deretter platen med en optisk klar klebeplatetetning for å forhindre fordampning og sett platen inn i en plateleser utstyrt med temperaturkontroll, risting og en kinetisk leseprogrammering. For å vurdere hydrogelinnkapslet celle levedyktighet, bruk en 21 gauge nål til å injisere 150 mikroliter hydrogel som inneholder riktig konsentrasjon av celler i hver av tre brønner per prøve i en klar bunn 96-brønns plate og tilsett 100 mikroliter av riktig cellemedium i hvert volum hydrogel. På dag én av kulturen erstatter du supernatanten på hver hydrogel på riktig tidspunkt for hver prøvegruppe med 50 mikroliter to millimolar Calcein AM-løsning.Etter en 30 minutters inkubasjon, bilde midten av hver brønn ved konfokal mikroskopi. For å evaluere evnen til de innkapslede cellene til å bosette seg i en sprøyte før injeksjon, fortynn cellene av interesse til en en ganger 10 til de seks cellene per milliliter i PBS-konsentrasjon og flekk cellene med 50 mikroliter av to millimolar Calcein AM i 10 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen blander du cellene med 500 til 700 mikroliter hydrogel som demonstrert og bruker en 21 gauge nål til å injisere 100 til 200 mikroliter celle som inneholder hydrogel i bunnen av minst en cuvette per prøve.Deretter kan du se for deg cuvettene som ligger flatt på sidene på scenen til et konfokalt mikroskop umiddelbart etter injeksjon og på en og fire timer etter sådd for å observere om cellene har bosatt seg i hydrogelen eller om de har forblitt suspendert. Gelens skjærfortynnende og selvhelbredende evner kan observeres ved hjelp av henholdsvis strømningssveip og trinnskjærprotokoller. Karakterisering av lagrings- og tapsmoduli ved hjelp av et oscillatorisk skjærfrekvenssveipeksperiment i det lineære viskoelastiske regimet i frekvensområder fra 0,1 til 100 radianer per sekund avslører de faste egenskapene.Det bør vanligvis ikke være en crossover av skjær lagring og tap moduli observert ved lave frekvenser for stivere formuleringer, mens crossover hendelser kan forventes for en svakere hydrogel formuleringer. Varierende polymerinnhold i PNP-hydrogelene kan ha en direkte innvirkning på spredningen av last gjennom polymernettverket og frigjøringshastigheten fra materialene. PNP-hydrogeler kan også stabilisere last som er utsatt for termisk ustabilitet, noe som forlenger lastehyllen betydelig og reduserer avhengigheten av lagring og distribusjon av kjølekjeder.Inkludering av integrinske motiver kan være nyttig for å tilpasse PNP-hydrogeler for cellulære terapier. Innkapslede celler kan merkes fluorescerende for å lette visualisering og kvantifisering. For eksempel vil formuleringer som mangler adhesjonssteder ha lav celle levedyktighet, da innkapslede celler ikke sprer seg sammenlignet med celler innkapslet og formuleringer med adhesjonsmotiver, for eksempel RGD.Vi undersøker fortsatt hvordan endringer i formuleringen påvirker de reologiske egenskapene og det dynamiske nettet til polymermatrisen. Vi bruker også FRAP til å studere diffusjon av molekyler i hydrogelen. Disse materialene kan brukes til å stille nye biologiske spørsmål om hvordan vedvarende levering kan påvirke legemiddellevering, vaksineutvikling eller kreftimmunoterapi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Egenrapportering Stillaser for 3-dimensjonal Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller og metoder for å vurdere transport av Drug Delivery Systems Across Cellular Barrierer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injeksjon and Drug lastet Supramolecular hydrogel for Lokal kateter Injeksjon i Pig Hjerte

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

Syntesen av RGD-funksjon Hydrogeler som et verktøy for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Lys-mediert Dannelse og fordelingen av Hydrogeler for cellekultur Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Produksjon og levering av legemidler Anvendelser av Silk Nanopartikler

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Mesenchymale stromal cellekultur og levering autolog Betingelser: En smart tilnærming for Ortopedisk Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Fleksibel Hydrogeler fra Lunge ekstracellulær matriks for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues for injiserbare regenerativ Therapy og høy gjennomstrømming narkotikarelaterte Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forbereder proteinproduserende syntetiske celler ved hjelp av cellefrie bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsjonsoverføring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...