Name: injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications
Uploaded: 2021-02-07T15:00:00
Duration: 9 min 39 s
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Esta pesquisa foi apoiada financeiramente pelo Center for Human Systems Imunology com a Fundação Bill & Melinda Gates (OPP1113682) e pela Fundação Bill & Melinda Gates (OPP1211043). C.M.M. foi apoiado pela Stanford Graduate Fellowship e pela Stanford Bio-X William e Lynda Steere Fellowship. A.K.G. é grato por uma Bolsa de Pesquisa de Pós-Graduação da National Science Foundation e pela Gabilan Fellowship da Stanford Graduate Fellowship in Science and Engineering. S.C. foi apoiado pelo Instituto Nacional de Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número F32CA247352. Os autores também gostariam de reconhecer calorosamente os membros do Laboratório Appel, incluindo o Dr. Gillie Roth, Dr. Anthony Yu, Dr. Lyndsay Stapleton, Dr. Hector Lopez Hernandez, Dr. Andrea d'Aquino, Dr. Julie Baillet, Celine Liong, Ben Ou, Emily Meany, Emily Gale e Dr. Anton Smith por seu esforço e tempo em ajudar o Laboratório Appel a desenvolver esses protocolos ao longo dos anos.

Esses autores não têm nada a revelar.

Os hidrogéis de polímero-nanopartícula (PNP) são facilmente fabricados e permitem a entrega local de células terapêuticas e medicamentos a longo prazo através de administração minimamente invasiva através de injeção direta ou entrega de cateter. Esses protocolos descrevem a formulação de hidrogéis PNP e os métodos de caracterização para garantir a qualidade dos materiais resultantes. Os hidrogéis PNP supramoleculares são escaláveis para fabricação e são formados através da simples mistura de polímeros de celulose modificadas e nanopartículas policricanas de concha-núcleo. Os métodos atuais descrevem procedimentos fáceis para formar géis pré-carregados em seringas através de protocolos simples de mistura de cotovelo. Através de métricas de controle de qualidade de cada uma das partes componentes, como dls para monitorar o tamanho e distribuição nP, pode-se reproduzir materiais de hidrogel PNP com propriedades reológicas consistentes. Através da variação da quantidade de HPMC-C12 ou NPs, pode-se modular o tamanho da malha e rigidez do hidrogel PNP resultante. Essas propriedades podem ser ajustadas para melhor se adequar a uma determinada aplicação biomédica, e com os métodos reológicos aqui detalhados, os pesquisadores podem caracterizar as propriedades de afinamento de tesoura e auto-cura dos hidrogéis PNP à medida que otimizam a plataforma para suas aplicações específicas. Métodos para estudos de liberação in vitro também são descritos; os pesquisadores podem usar esses estudos para caracterizar a escala de tempo relativa de liberação de medicamentos de interesse, informando futuros estudos in vivo. Usando estudos de estabilidade, os pesquisadores também podem avaliar a capacidade desses materiais de ajudar a preservar a estrutura biológica e a estabilidade da bioterapêutica sensível ao longo do tempo e temperaturas extremas, com aplicações potenciais convincentes para reduzir a dependência da cadeia fria da bioterapêutica. Finalmente, com ensaios simples de viabilidade celular, o crescimento celular e a migração dentro dos materiais PNP podem ser avaliados, com aplicações potenciais em terapias celulares e andaimes.
Nosso grupo encontrou muitas aplicações convincentes para a plataforma de hidrogel PNP27. Hidrogéis PNP têm sido utilizados para a entrega lenta de vacinas subunidades, permitindo perfis de liberação cinética combinadas de antígenos e adjuvantes para aumentar a magnitude, duração e qualidade da resposta imune humoral31. Os hidrogéis PNP têm um tamanho de malha menor do que os hidrogéis mais comumente usados, por isso são eficazes na desaceleração da difusão e na liberação lenta de carga molecular. As propriedades únicas de adesão tecidual e as propriedades mecânicas dos hidrogéis PNP também foram utilizadas para formar barreiras físicas para evitar aderências decorrentes da cirurgia, pulverizando os hidrogéis sobre grandes áreas superficiais dos órgãos após a cirurgia30. Os hidrogéis PNP também têm se mostrado veículos eficazes de entrega de células, e as propriedades mecânicas realmente protegem as células das forças mecânicas que ocorrem na agulha da seringa durante a injeção, melhorando a viabilidade celular29. Quando os NPs são conjugados com um peptídeo adesivo celular, as células podem se conectar e se envolver com a matriz PNP para permanecer viável. Usando essa abordagem, os hidrogéis PNP têm sido mostrados para melhorar a retenção local de células-tronco injetadas em comparação com métodos que utilizam veículos líquidos28. Além disso, hidrogéis PNP têm sido mostrados para evitar a agregação termicamente induzida de insulina encapsulada, mesmo sob condições de envelhecimento severas e estressadas, sugerindo que esses materiais podem ser capazes de reduzir a necessidade de refrigerar drogas sensíveis à temperatura38.
No geral, as metodologias aqui descritas permitirão que grupos de pesquisa fabricassem e explorassem hidrogéis PNP como um bioma material. Esses protocolos fornecem as técnicas de síntese em escala de laboratório para fabricar material hidrogel suficiente para prosseguir tanto estudos in vitro quanto in vivo. Os estudos descritos acima indicam que os crosslinks dinâmicos desses materiais permitem que ele seja adequado para uma série de aplicações biomédicas, permitindo a motilidade ativa das células presas, restringindo a difusão passiva da carga molecular. Espera-se que os pesquisadores encontrem a plataforma PNP uma ferramenta acessível e poderosa para melhorar os resultados clínicos através da entrega controlada de medicamentos e estudar mecanismos biológicos básicos, como recrutamento celular e mecanobiologia.

Hidrogéis injetáveis são uma ferramenta emergente para fornecer células terapêuticas e drogas ao corpo de forma controlada1. Esses materiais podem ser carregados com drogas ou células e podem ser administrados de forma minimamente invasiva através de injeção direta a tecidos superficiais ou por entrega de cateteres a tecidos profundos. Em geral, os hidrogéis injetáveis são compostos por redes de polímeros inchados pela água que são interligadas por interações físicas transitórias. Em repouso, esses crosslinks fornecem uma estrutura sólida para os géis, mas após a aplicação de força mecânica suficiente esses crosslinks são temporariamente interrompidos, transformando o material em um estado líquido que pode facilmente fluir2. São essas propriedades reológicas que permitem que os hidrogéis físicos sefinam e fluam através de pequenos diâmetros de agulha durante a injeção3. Após a injeção, a rede de polímeros das reformas materiais, permitindo que se auto-cure e forme rapidamente um gel sólido em situ4,5. Essas estruturas podem atuar como depósitos de liberação lenta para drogas ou andaimes para regeneração tecidual6,7. Esses materiais têm sido utilizados em diversas aplicações que englobam a tecnologia de entrega de medicamentos, medicina regenerativa e imunoengenharia1,8,9,10,11,12.
Tanto materiais naturais (por exemplo, alginato e colágeno) quanto materiais sintéticos (por exemplo, poli (etileno glicol) (PEG) ou polímeros hidrofílicos similares) foram desenvolvidos como materiais hidrogel injetáveis biocompatíveis13,14,15. Muitos materiais naturais apresentam variação em lote afetando a reprodutibilidade4,16. Esses materiais são frequentemente sensíveis à temperatura, curando-se ao atingir temperaturas fisiológicas; assim, o manuseio desses materiais coloca desafios técnicos e logísticos adicionais17. Materiais sintéticos permitem um controle químico mais preciso e excelente reprodutibilidade, mas esses materiais às vezes podem estar sujeitos a respostas imunes adversas que limitam sua biocompatibilidade, característica crítica para aplicações terapêuticas in vivo6,18,19. Esforços recentes têm mostrado que existem muitos critérios complexos de projeto envolvidos na engenharia de um material hidrogel injetável, incluindo a otimização de propriedades mecânicas, tamanho da malha de rede de polímeros, pistas moleculares bioativas, biodegradabilidade e imunogenicidade do material20,21,22,23,24,25,26. Todos esses fatores devem ser considerados dependendo da aplicação de juros, o que significa que uma plataforma modular, quimicamente incapaz, é ideal para satisfazer uma ampla amplitude de aplicações.
Os métodos atuais descrevem a formulação e o uso de uma plataforma de hidrogéis polímero-nanopartícula injetável (PNP) que exibe propriedades mecânicas tíclicas, alto grau de biocompatibilidade e baixa imunogenicidade, e apresenta locais para conjugar sinais moleculares bioativos27,28,29,30,31,32,33. Estes hidrogéis PNP são compostos de polímeros de celulose hidrofobicamente modificados e nanopartículas de concha-núcleo auto-montadas que compreendem poli (etileno glicol)-bloco-poli (ácido láctico) (PEG-PLA)27,34 que interagem para produzir uma rede supramolecular. Mais especificamente, os polímeros de celulose hidroxipropiletila modificada dodecil (HPMC-C12) interagem dinamicamente com a superfície das nanopartículas PEG-PLA e fazem a ponte entre essas nanopartículas para formar esta rede de polímeros27,34. Essas interações dinâmicas e multivalentes permitem que os materiais se afinem durante a injeção e se auto-curem rapidamente após a administração. Os componentes do hidrogel PNP são facilmente fabricados através de reações simples de um pote e o hidrogel PNP é formado em condições leves por simples mistura dos dois componentes35. Devido à facilidade de fabricação, esta plataforma de hidrogel é altamente traduzível em escala. As propriedades mecânicas e o tamanho da malha dos hidrogéis PNP são controlados alterando a porcentagem de peso dos componentes de polímero e nanopartículas na formulação. Estudos anteriores com esta plataforma indicam que os hidrogéis PNP são altamente biocompatíveis, biodegradáveis e nãoimunogênicos 28,30,31. No geral, esses hidrogéis apresentam ampla utilidade em aplicações biomédicas que abrangem prevenção de adesão pós-operatória, engenharia e regeneração de tecidos, entrega sustentada de medicamentos e imunoengenharia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td>PNP hydrogel injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G, 4 in hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>N224</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates, black, clear bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3540</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, black</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-627</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, clear</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8729K66</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>NP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR759015-100EA</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DynaPro II Plate Reader</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>300007-392 (EA)</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>8300015027</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer elbow connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30800-12</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-456</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Spatula</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1229F13</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>TS-RT2-100</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11382II</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>DHR-2 Rheometer</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516-5G</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications

Estes métodos descrevem como formular hidrogéis de polímero-nanopartícula supramolecular injetável (PNP) para uso como biomateriais. Os hidrogéis PNP são compostos por dois componentes: celulose hidrofobicamente modificada como polímero de rede e nanopartículas de concha-núcleo auto-montadas que atuam como elos transversais não covalentes através de interações dinâmicas e multivalentes. Estes métodos descrevem tanto a formação dessas nanopartículas auto-montadas através da nanoprecipitação, bem como a formulação e mistura dos dois componentes para formar hidrogéis com propriedades mecânicas tunable. O uso de dispersão dinâmica de luz (DLS) e reologia para caracterizar a qualidade dos materiais sintetizados também é detalhado. Finalmente, a utilidade desses hidrogéis para entrega de medicamentos, estabilização biofarmacêutica e encapsulamento e entrega celular é demonstrada através de experimentos in vitro para caracterizar a liberação de drogas, estabilidade térmica e fixação celular e viabilidade. Devido à sua biocompatibilidade, injebilidade e condições leves de formação de gel, este sistema de hidrogel é uma plataforma prontamente incapaz adequada para uma série de aplicações biomédicas.

Fabricação e caracterização de hidrogel PNP Os hidrogéis PNP são formados através da mistura dos dois componentes primários - polímeros HPMC hidrofobicamente modificados e nanopartículas PEG-PLA(Figura 1a). A carga terapêutica é mais facilmente incorporada ao tampão adicional usado para diluir o componente nanopartícula antes da preparação do hidrogel. Para caracterização biomédica a jusante, é conveniente usar um método de mistura de cotovelo que permita a mistura simples e reprodutível dos dois componentes(Figura 1b). Após a mistura adequada, o hidrogel deve se sentir firme na seringa, mas produzir sob pressão e extrusão a partir de uma agulha padrão (21G mostrada) (Figura 1c). Após a injeção, o hidrogel deve rapidamente se fixar em um material sólido que resiste ao fluxo da gravidade. Para caracterizar totalmente o hidrogel e garantir produtos consistentes em lote a lote, as amostras devem ser analisadas usando vários experimentos diferentes em um reômetro. As capacidades de afinamento e auto-recuperação do gel serão facilmente observadas usando um protocolo de varredura de fluxo e protocolo de cisalhamento,respectivamente (Figura 2a,b). Para géis mais rígidos, como a formulação 2:10, o usuário deve procurar viscosidade para diminuir pelo menos duas ordens de magnitude durante a varredura de fluxo à medida que a taxa de cisalhamento é aumentada de 0,1 para 100 s-1, o que simula as condições mecânicas durante a injeção. O protocolo de corte de passo deve revelar uma diminuição de ordens de magnitude na viscosidade sob os degraus de alta tesoura, e um retorno rápido (tempo de recuperação de <5) à viscosidade da linha de base durante os passos de corte baixos. A caracterização do moduli de armazenamento e perda usando um experimento de varredura de frequência de cisalhamento oscilatório no regime viscoelástico linear deve revelar propriedades sólidas em frequências de 0,1-100 rad s-1 (Figura 2c). Em particular, normalmente não deve haver um crossover do moduli de armazenamento e perda de tesoura que é observável em baixas frequências para formulações mais rígidas como os hidrogéis 2:10. Tal evento de crossover pode indicar problemas na qualidade dos materiais de partida, seja no polímero HPMC ou PEG-PLA modificados, ou no tamanho e dispersão das nanopartículas PEG-PLA. Deve-se notar que um evento crossover pode ser esperado para formulações de hidrogel mais fracas, como o hidrogel 1:5. As varreduras de amplitude de cisalhamento oscilatória nos hidrogéis PNP revelam que os materiais não rendem até que valores elevados de estresse sejam aplicados, indicando que esses materiais possuem um estresse de rendimento, uma quantidade limiar de estresse necessária para o material fluir.
Caracterizando cinética de liberação de hidrogéis PNP Um passo essencial na concepção de géis PNP para entrega de medicamentos é a caracterização da cinética de liberação de medicamentos a partir de uma formulação escolhida. Existem várias técnicas para isso, mas uma metodologia in vitro simples fornece dados úteis durante o desenvolvimento precoce da formulação(Figura 3a). Variar o teor de polímero dos hidrogéis PNP através da modulação da quantidade de HPMC-C12 ou NPs é a maneira mais simples de ajustar as propriedades mecânicas e o tamanho da malha desses hidrogéis, que podem ter um impacto direto na difusão da carga através da rede de polímeros e taxa de liberação dos materiais(Figura 3b). Para a carga maior do que o tamanho dinâmico da malha (ou seja, alto peso molecular ou grande raio hidrodinâmico), os pesquisadores devem esperar uma liberação lenta e mediada por dissolução da carga do depósito de hidrogel. Formulações com tamanhos dinâmicos de malha maiores ou iguais ao tamanho da carga permitirão a liberação mediada por difusão que pode ser descrita usando modelos tradicionais de difusão de carga e liberação46,47,48,49. Com base na forma da curva de liberação, os pesquisadores podem reformular o hidrogel para ajustá-lo em direção a uma versão mais lenta (por exemplo, aumentar o teor de polímero) ou mais rápido (por exemplo, diminuir o teor de polímero).
Avaliação da estabilidade da carga terapêutica Determinar a estabilidade da carga terapêutica em uma formulação de hidrogel é fundamental antes de iniciar estudos pré-clínicos ou celulares. Em comparação com outros métodos sintéticos para encapsular drogas, os hidrogéis PNP incorporam a carga de forma suave, misturando-se ao material a granel, e é improvável que o encapsulamento danifique a carga. Esses estudos indicam que os hidrogéis PNP também podem estabilizar a carga suscetível à instabilidade térmica, como a insulina, prolongando consideravelmente a vida útil e reduzindo a dependência do armazenamento e distribuição a frio(Figura 4). É importante avaliar a condição da carga imediatamente após o encapsulamento no hidrogel, bem como após longos períodos de armazenamento. Esses dados mostram que a insulina permanece estável em hidrogéis após 28 dias de armazenamento sob estresse térmico e mecânico contínuo, usando um simples ensaio de fluorescência para medir a agregação de insulina. Uma técnica alternativa para os casos em que um ensaio de placa apropriado não está disponível seria realizar medições circulares de dicromaísmo da carga, o que é particularmente útil para determinar a estrutura secundária de medicamentos proteicos.
Determinando viabilidade celular e dispersão em hidrogéis PNP Muitas células terapêuticas requerem motivos de adesão para permanecer viável, e, portanto, a inclusão de motivos integrin como peptídeos de ácido arginino-glicoscina-aspartic (RGD) é um passo importante na adaptação dos hidrogéis PNP para terapias celulares50. O polímero modular PEG-PLA que compreende os NPs permite a funcionalidade química da coroa PEG através de químicas simples de "clique"28,51. Neste exemplo, os peptídeos RGD adesivos de células foram anexados ao polímero PEG-PLA para promover o engajamento celular com a estrutura do hidrogel PNP. Formulações sem locais de adesão terão baixa viabilidade celular, pois as células encapsuladas não se proliferam em comparação com as células encapsuladas em formulações com esses motivos de adesão(Figura 5a,b). As células encapsuladas podem ser rotuladas com calcein AM ou outro corante fluorescente apropriado (por exemplo, CFSE) para facilitar a contagem de células com um microscópio de fluorescência. Durante a otimização, a viabilidade deve ser comparada com hidrogéis PNP não modificados para garantir que formulações não funcionais estão proporcionando maior viabilidade e proliferação. Se as formulações não funcionais de integrin estão fornecendo eficácia semelhante à de hidrogéis não modificados, isso pode indicar uma falha na química de conjugação usada para incorporar os motivos de adesão.
Os pesquisadores devem esperar que as células encapsuladas sejam uniformemente dispersas através do meio de hidrogel ao usar uma formulação de hidrogel apropriada. Isso permitirá uma dosagem consistente e previsível das células durante a administração do hidrogel e deve se traduzir na retenção local de células no hidrogel após a administração. A distribuição das células pode ser facilmente determinada usando técnicas de microscopia de fluorescência. As células podem ser rotuladas com um corante apropriado e depois imagens usando microscopia confocal. As imagens podem ser avaliadas visualmente (Figura 5c) e também quantitativamente(Figura 5d) usando o software ImageJ para medir a intensidade média da fluorescência ao longo do eixo vertical da imagem (ou ao longo do eixo de fixação celular devido à gravidade. Se a formulação de hidrogel for muito fraca para suportar as células em suspensão em prazos prolongados, ocorrerá a fixação celular, como observado na formulação 1:1 na Figura 5. O aumento do teor de polímeros pode resolver problemas com a dispersão celular inhomogênea devido à fixação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig1v4.jpg"> Figura 1: Os hidrogéis de nanopartículas de polímero (PNP) são facilmente formados pela mistura de dois componentes. (a) O primeiro componente é uma solução de celulose hidroxipropiletila modificada dodecil (HPMC-C12),e o segundo componente é uma solução de nanopartículas debloco-poli(ácido láctico) (PEG-PLA) junto com qualquer carga terapêutica. A mistura suave desses dois componentes produz um hidrogel injetável, onde os polímeros HPMC-C12 são fisicamente interligados por interações dinâmicas e multivalentes com as nanopartículas PEG-PLA. (b) Fotografia demonstrando formulação de gel misturando-se com duas seringas, cada uma contendo um componente do hidrogel PNP. Ao conectar as duas seringas com um conector de cotovelo luer-lock, os dois componentes podem ser facilmente misturados em condições estéreis para produzir um hidrogel sem bolhas pré-carregado em uma seringa para uso imediato. A solução NP é tingida de azul com o propósito de demonstração. (c) Demonstração da injeção de hidrogéis PNP e sua res solidificação. i Hidrogel PNP em uma seringa com agulha 21G anexada. (ii) A injeção coloca o hidrogel sob a tesoura que quebra temporariamente as interações entre polímeros e nanopartículas, criando uma consistência fluida. (iii) Pós-injeção, as interações dinâmicas polímero-nanopartículas se reformam rapidamente, permitindo que o hidrogel se auto-cure em um sólido. (iv) O hidrogel sólido não flui sob forças mais fracas do que seu estresse de rendimento, como a gravidade. O hidrogel PNP é tingido de azul para fins de demonstração. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig2v3.jpg"> Figura 2: Caracterização reológica de duas formulações de hidrogel PNP. As formulações são denotadas como polímeras wt.%: NP wt.%. aFluxo de cisalhamento constante varre de baixa a alta taxa de cisalhamento de hidrogéis PNP. A viscosidade em função da taxa de corte caracteriza propriedades de corte. (b) Viscosidade em função de oscilar taxas de tesoura entre baixas taxas de corte (fundo branco; 0,1 s−1) a altas taxas de corte (fundo vermelho; 10 s−1) demonstrando propriedades de auto-recuperação dos hidrogéis PNP. As taxas de tesoura são impostas para 30 s cada. (c) Módulo de armazenamento elástico G' e módulo de perda viscosa G" em função da frequência em uma tensão constante de 1% para várias formulações de hidrogel PNP. (d) Amplitude varre a uma frequência constante de 10 rad/s para caracterizar o módulo de armazenamento elástico G' e o módulo de perda viscoso G" dos hidrogéis PNP em função do estresse. Essa caracterização reológica pode ser usada como comparação para controle de qualidade. Este número foi adaptado de Grosskopf et al.28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig2v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2.jpg"> Figura 3: Lançamento in vitro de albumina de soro bovino (BSA) de hidrogéis PNP. As formulações são denotadas como polímeras wt.%: NP wt.%. aEsquema descrevendo o protocolo experimental de liberação in vitro. As alíquotas são removidas dos tubos capilares carregados por hidrogel PNP ao longo do tempo. (b) A liberação in vitro do BSA a partir de 1:10 PNP, 2:5 PNP e 2:10 PNP relatada como o ponto de tempo de massa coletado pelo ponto de tempo especificado dividido pela massa total coletada durante o ensaio (dados mostrados como média ± SD; n = 3). A BSA foi detectada através de medições de absorvência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2.jpg"> Figura 4: Estabilidade térmica da insulina encapsulada em hidrogéis PNP por ensaio tht. As formulações são denotadas como polímeras wt.%: NP wt.%. Insulina encapsulada em 1:5 e 2:10 PNP hidrogel permaneceu semagrecimento por mais de 28 dias em condições de envelhecimento estressada de 37 °C e agitação constante. O tempo de agregação de insulina formulada na PBS foi de 20 ± 4 h (± média SD, limiar de agregação 750.000 AFU). Dados apresentados como uma média de n = 4 réplicas experimentais (AFU, unidades de fluorescência arbitrária). Esta figura foi adaptada de Meis et al.38<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2.jpg"> Figura 5: Viabilidade celular e fixação celular em hidrogéis PNP. (a,b) Estudos de viabilidade celular em hidrogéis PNP com células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs). (a) Imagens representativas de hMSCs viáveis em hidrogéis PNP 1:5 com e sem o motivo arginina-glina-glicina-asparta (RGD) conjugado aos NPs PEG-PLA. hMSCs foram manchados por 30 min antes da imagem confocrática. Barra de escala representa 100 μm. (b) Viabilidade celular no dia 6 definida como número de células fluorescentes na imagem em relação ao número de células fluorescentes no dia 1 (dados mostrados como média ± SD; n = 3). (c,d) Encapsulamento celular e experimentos de assentamento com hMSCs. c Imagens de intensidade máxima de hMSCs manchados de calcein AM encapsulados em hidrogel PNP 1:1 (linha superior) e 1:5 PNP hidrogel (linha inferior) ao longo de 4 horas para quantificar a fixação celular. A barra de escala representa 1 mm. (d) Intensidade média de pixels horizontais de hMSCs ao longo do perfil vertical do hidrogel. Este número foi adaptado de Grosskopf et al.28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

Este protocolo descreve a síntese e formulação de biomateriais hidrogéis de polímero supramolecular injetável (PNP). As aplicações desses materiais para entrega de medicamentos, estabilização biofarmacêutica e encapsulamento e entrega celular são demonstradas.

Hidrogéis de polímero supramolecular injetável para aplicações de entrega de células e medicamentos

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Nosso protocolo facilita a formulação de hidrogéis de polímeros-nanopartículas para uso como biomateriais. Esperamos que os pesquisadores desenvolvam esse material para aplicações translacionais e explorem questões biológicas básicas. Hidrogéis PNP são facilmente injetados através de agulhas e cateteres de pequeno diâmetro, mas rapidamente se auto-curam após a injeção.Isso permite a entrega não invasiva controlada de drogas e células em longas escalas de tempo. Essa tecnologia ultrapassa os limites para a terapia localizada e a liberação prolongada de medicamentos, com implicações para condições amplas do câncer à regeneração tecidual à imunização passiva. Para sintetizar nanopartículas por nano precipitação, adicione 50 miligramas de polímero PEG-PLA a um frasco de cintilação de vidro de oito mililitros e adicione um mililitro de acetonitrilo ao frasco.Vórtice para dissolver completamente. Em seguida, adicione 10 mililitros de água ultra pura a um frasco de cintilação de vidro de 20 mililitros com uma pequena barra de agitação e coloque o frasco em uma placa de agitação definida para 600 revoluções por minuto. Use uma pipeta de 200 microliter para adicionar um mililitro da solução de solvente de polímero dropwise ao frasco de água.As nanopartículas de concha-núcleo se formarão à medida que a solução de solvente de polímero é rapidamente dispersada por toda a água. Verifique o tamanho das partículas por dispersão dinâmica de luz de acordo com os protocolos padrão. Em seguida, transfira a solução de nanopartículas para uma unidade de filtro centrífugo para concentrar a solução para menos de 250 microliters e resuspenque as nanopartículas em um buffer apropriado.Para preparar o hidrogel, adicione 333 miligramas de solução de estoque HPMC-C12 de 6%HPMC-C12 a uma seringa de bloqueio Luer de um mililitro e adicione 500 microliters da solução de estoque de nanopartículas de 20% e 167 microliters de PBS a um frasco de oito mililitros. Após a mistura, use uma agulha para encher outra seringa de bloqueio Luer mililitro com a solução diluída de nanopartículas e conecte as duas seringas a uma batedeira de cotovelo. Misture as duas soluções por aproximadamente 60 ciclos até que um material hidrogel branco homogêneo e opaco se forme.Para medir as propriedades reológicas do hidrogel formulado, injete o volume apropriado de hidrogel de acordo com a lacuna de geometria selecionada no centro de uma placa de reômetro serrilhada e utilize testes oscilatórios e de fluxo para medir as propriedades mecânicas da amostra. Para caracterizar a liberação de drogas do hidrogel, primeiro, prepare um capilar de vidro usando epóxi para selar uma extremidade de cada tubo. Quando o epóxi estiver definido, use uma agulha hipodérmica de 4 polegadas de 22 bitola para injetar de 100 a 200 microliters de hidrogel em um mínimo de três tubos por amostra, e adicione cuidadosamente 200 a 300 microliters de PBS em cada volume de hidrogel.Nos pontos de tempo apropriados, de acordo com a escala de tempo prevista de liberação de drogas, use uma agulha para remover cuidadosamente o PBS de cada capilar sem perturbar a superfície do hidrogel e adicionar um novo volume de PBS. Na conclusão do estudo, analise as alíquotas coletadas da PBS com um método adequado para quantificar a quantidade de droga liberada em cada ponto de tempo. Para caracterizar a estabilidade térmica da insulina encapsulada em gel, carregue tanto a insulina quanto a tia de táfala T no hidrogel como demonstrado e use uma agulha de calibre 21 para injetar 200 microliters da carga e sonda carregada de hidrogel em pelo menos três poços de uma placa preta de 96 poços por amostra.Em seguida, sele a placa com uma vedação de placa adesiva opticamente clara para evitar a evaporação e insira a placa em um leitor de placa equipado com controle de temperatura, agitação e uma programação de leitura cinética. Para avaliar a viabilidade celular encapsulada por hidrogel, use uma agulha de calibre 21 para injetar 150 microliters de hidrogel contendo a concentração adequada de células em cada um dos três poços por amostra em uma placa de fundo claro de 96 poços e adicione 100 microliters do meio celular apropriado em cada volume de hidrogel. No primeiro dia de cultura, substitua o supernascer em cada hidrogel no ponto de tempo apropriado para cada grupo amostral por 50 microliters de duas soluçãos de Calcein AM mililitro.Após uma incubação de 30 minutos, imagem o centro de cada poço por microscopia confocal. Para avaliar a capacidade das células encapsuladas de se instalarem em uma seringa antes da injeção, diluir as células de interesse para uma única vez 10 para as seis células por mililitro na concentração de PBS e manchar as células com 50 microlitradores de dois mililitros Calcein AM por 10 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, misture as células com 500 a 700 microliters de hidrogel como demonstrado e use uma agulha de calibre 21 para injetar de 100 a 200 microliters de células contendo hidrogel no fundo de pelo menos um cuvette por amostra.Em seguida, imagem as cuvetas deitadas planas em seus lados no palco de um microscópio confocal imediatamente após a injeção e em uma e quatro horas após a semeadura para observar se as células se estabeleceram no hidrogel ou se permaneceram suspensas. As capacidades de afinamento e auto-cura do gel podem ser observadas usando protocolos de varredura de fluxo e cisalhamento, respectivamente. A caracterização do moduli de armazenamento e perda usando um experimento de varredura de frequência de cisalhamento oscilatório no regime viscoelástico linear na frequência varia de 0,1 a 100 radianos por segundo revela as propriedades sólidas.Normalmente não deve haver um crossover do armazenamento de tesoura e moduli de perda observado em baixas frequências para formulações mais rígidas, enquanto eventos crossover podem ser esperados para formulações de hidrogel mais fracas. A variação do teor de polímeros dos hidrogéis PNP pode ter um impacto direto na difusão da carga através da rede de polímeros e na taxa de liberação dos materiais. Os hidrogéis PNP também podem estabilizar a carga suscetível à instabilidade térmica, ampliando consideravelmente a vida útil da carga e reduzindo a dependência do armazenamento e distribuição da cadeia fria.A inclusão de motivos integrin pode ser útil para a adaptação de hidrogéis PNP para terapias celulares. As células encapsuladas podem ser rotuladas fluorescentemente para facilitar sua visualização e quantificação. Por exemplo, formulações sem locais de adesão terão uma baixa viabilidade celular, pois as células encapsuladas não se proliferam em comparação com células encapsuladas e formulações com motivos de adesão, como RGD.Ainda estamos explorando como as mudanças na formulação afetam as características reológicas e a malha dinâmica da matriz do polímero. Também usamos FRAP para estudar a difusão de moléculas dentro do hidrogel. Esses materiais podem ser usados para fazer novas perguntas biológicas sobre como o parto sustentado pode afetar o fornecimento de medicamentos, o desenvolvimento de vacinas ou a imunoterapia contra o câncer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

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Bioengenharia

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An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

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