Name: injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications
Uploaded: 2021-02-07T15:00:00
Duration: 9 min 39 s
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Esta investigación fue apoyada financieramente por el Centro de Inmunología de Sistemas Humanos con la Fundación Bill y Melinda Gates (OPP1113682) y la Fundación Bill y Melinda Gates (OPP1211043). C.M.M. fue apoyado por una Beca de Posgrado de Stanford y la Beca William y Lynda Steere de Stanford Bio-X. A.K.G. está agradecido por una beca de investigación de posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias y la beca Gabilan de la Beca de Posgrado de Stanford en Ciencias e Ingeniería. S.C. fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio F32CA247352. A los autores también les gustaría agradecer calurosamente a los miembros de Appel Lab, incluidos el Dr. Gillie Roth, el Dr. Anthony Yu, el Dr. Lyndsay Stapleton, el Dr. Héctor López Hernández, la Dra. Andrea d'Aquino, la Dra. Julie Baillet, Celine Liong, Ben Ou, Emily Meany, Emily Gale y el Dr. Anton Smith por su esfuerzo y tiempo para ayudar al Laboratorio Appel a desarrollar estos protocolos a lo largo de los años.

Estos autores no tienen nada que revelar.

Los hidrogeles de nanopartículas de polímero (PNP) se fabrican fácilmente y permiten la administración local a largo plazo de células terapéuticas y fármacos a través de la administración mínimamente invasiva a través de inyección directa o administración por catéter. Estos protocolos describen la formulación de hidrogeles PNP y los métodos de caracterización para asegurar la calidad de los materiales resultantes. Los hidrogeles PNP supramoleculares son escalables a la fabricación y se forman a través de la simple mezcla de polímeros de celulosa modificados y nanopartículas poliméricas de capa central. Los actuales métodos describen procedimientos fáciles para formar los geles precargados en jeringuillas con protocolos simples de la mezcla del codo. A través de métricas de control de calidad de cada uno de los componentes, como DLS para monitorear el tamaño y la distribución de NP, se pueden formular de forma reproducible materiales de hidrogel PNP con propiedades reológicas consistentes. Variando la cantidad de HPMC-C12 o NPs, se puede modular el tamaño de malla y la rigidez del hidrogel PNP resultante. Estas propiedades se pueden ajustar para adaptarse mejor a una aplicación biomédica en particular, y con los métodos reológicos detallados aquí, los investigadores pueden caracterizar las propiedades de cizalladura y autocuración de los hidrogeles PNP a medida que optimizan la plataforma para sus aplicaciones específicas. También se describen métodos para estudios de liberación in vitro; los investigadores pueden utilizar estos estudios para caracterizar la escala de tiempo relativa de liberación de fármacos de interés, informando futuros estudios in vivo. Utilizando estudios de estabilidad, los investigadores también pueden evaluar la capacidad de estos materiales para ayudar a preservar la estructura biológica y la estabilidad de la bioterapéutica sensible a lo largo del tiempo y las temperaturas extremas, con aplicaciones potenciales convincentes para reducir la dependencia de la cadena de frío de la bioterapéutica. Finalmente, con ensayos simples de viabilidad celular, se puede evaluar el crecimiento celular y la migración dentro de materiales PNP, con aplicaciones potenciales en terapias celulares y andamios.
Nuestro grupo ha encontrado muchas aplicaciones convincentes para la plataforma de hidrogel PNP27. Los hidrogeles de PNP se han utilizado para la administración lenta de vacunas de subunidades, lo que permite emparejar perfiles cinéticos de liberación de antígenos y adyuvantes para aumentar la magnitud, duración y calidad de la respuesta inmune humoral31. Se ha encontrado que los hidrogeles PNP tienen un tamaño de malla más pequeño que los hidrogeles más comúnmente utilizados, por lo que son efectivos para ralentizar la difusión y liberar lentamente la carga molecular. Las propiedades únicas de adherencia tisular y las propiedades mecánicas de los hidrogeles de PNP también se han utilizado para formar barreras físicas para prevenir las adherencias derivadas de la cirugía mediante la pulverización de los hidrogeles sobre grandes áreas superficiales de órganos después de la cirugía30. Los hidrogeles de PNP también han demostrado ser vehículos eficaces de administración celular, y las propiedades mecánicas realmente protegen a las células de las fuerzas mecánicas que ocurren en la aguja de la jeringa durante la inyección, mejorando la viabilidad celular29. Cuando los NPs se conjugan con un péptido adhesivo celular, las células pueden unirse y comprometerse con la matriz PNP para seguir siendo viables. Utilizando este enfoque, se ha demostrado que los hidrogeles de PNP mejoran la retención local de células madre inyectadas en comparación con los métodos que utilizan vehículos líquidos28. Además, se ha demostrado que los hidrogeles de PNP previenen la agregación inducida térmicamente de insulina encapsulada, incluso en condiciones de envejecimiento estresadas, lo que sugiere que estos materiales pueden ser capaces de reducir la necesidad de refrigerar medicamentos sensibles a la temperatura38.
En general, las metodologías descritas aquí permitirán a los grupos de investigación fabricar y explorar hidrogeles PNP como biomaterial. Estos protocolos proporcionan las técnicas de síntesis a escala de laboratorio para fabricar suficiente material de hidrogel para llevar a cabo estudios in vitro e in vivo. Los estudios descritos anteriormente indican que los reticulados dinámicos de estos materiales permiten que sea adecuado para una gama de aplicaciones biomédicas al permitir la motilidad activa de las células atrapadas al tiempo que restringe la difusión pasiva de la carga molecular. Se prevé que los investigadores encontrarán en la plataforma PNP una herramienta accesible y poderosa para mejorar los resultados clínicos a través de la administración controlada de fármacos y para estudiar mecanismos biológicos básicos como el reclutamiento celular y la mecanobiología.

Los hidrogeles inyectables son una herramienta emergente para entregar células terapéuticas y fármacos al cuerpo de forma controlada1. Estos materiales pueden ser cargados con fármacos o células y pueden ser administrados de una manera mínimamente invasiva a través de la inyección directa a los tejidos superficiales o por la entrega de catéter a los tejidos profundos. En general, los hidrogeles inyectables se componen de redes de polímeros hinchados por agua que están reticuladas entre sí por interacciones físicas transitorias. En reposo, estos reticulados proporcionan una estructura similar a la de un sólido a los geles, pero tras la aplicación de suficiente fuerza mecánica, estos reticulados se interrumpen temporalmente, transformando el material en un estado similar a un líquido que puede fluir fácilmente2. Son estas propiedades reológicas las que permiten que los hidrogeles físicos se adelgazan y fluyan a través de pequeños diámetros de aguja durante la inyección3. Después de la inyección, la red polimérica del material se reforma, lo que le permite auto-curarse y formar rápidamente un gel de tipo sólido in situ4,5. Estas estructuras pueden actuar como depósitos de liberación lenta de fármacos o andamios para la regeneración de tejidos6,7. Estos materiales se han utilizado en diversas aplicaciones que abarcan la tecnología de administración de fármacos, la medicina regenerativa y la inmunoingeniería1,8,9,10,11,12.
Tanto los materiales naturales (por ejemplo, alginato y colágeno) como los materiales sintéticos (por ejemplo, poli(etilenglicol) (PEG) o polímeros hidrofílicos similares) se han desarrollado como materiales de hidrogel inyectables biocompatibles13,14,15. Muchos materiales naturales exhiben variación de lote a lote que afecta la reproducibilidad4,16. Estos materiales son a menudo sensibles a la temperatura, curándose al alcanzar temperaturas fisiológicas; por lo tanto, la manipulación de estos materiales plantea desafíos técnicos y logísticosadicionales 17. Los materiales sintéticos permiten un control químico más preciso y una excelente reproducibilidad, pero estos materiales a veces pueden estar sujetos a respuestas inmunitarias adversas que limitan su biocompatibilidad, una característica crítica para aplicaciones terapéuticas in vivo6,18,19. Los esfuerzos recientes han demostrado que hay muchos criterios de diseño complejos involucrados en la ingeniería de un material de hidrogel inyectable, incluida la optimización de las propiedades mecánicas, el tamaño de la malla de la red de polímeros, las señales moleculares bioactivas, la biodegradabilidad y la inmunogenicidad del material20,21,22,23, 24,25,26. Todos estos factores deben considerarse en función de la aplicación de interés, lo que significa que una plataforma modular y químicamente sintonizable es ideal para satisfacer una amplia gama de aplicaciones.
Los presentes métodos describen la formulación y el uso de una plataforma inyectable de hidrogel de polímero-nanopartícula (PNP) que exhibe propiedades mecánicas sintonizables, un alto grado de biocompatibilidad y baja inmunogenicidad, y presenta sitios para conjugar señales moleculares bioactivas27,28,29,30,31,32,33. Estos hidrogeles PNP están compuestos por polímeros de celulosa modificados hidrofóbicamente y nanopartículas de capa central autoensambladas que comprenden poli(etilenglicol)-bloque-poli(ácido láctico) (PEG-PLA)27,34 que interactúan para producir una red supramolecular. Más concretamente, los polímeros de hidroxipropilmetilcelulosa modificados por dodecil (HPMC-C12)interactúan dinámicamente con la superficie de las nanopartículas PEG-PLA y puentean entre estas nanopartículas para formar esta redpolimérica 27,34. Estas interacciones dinámicas y multivalentes permiten que los materiales se adelgacen durante la inyección y se auto-curen rápidamente después de la administración. Los componentes de hidrogel PNP se fabrican fácilmente a través de reacciones simples de una olla y el hidrogel PNP se forma en condiciones suaves mediante la simple mezcla de los dos componentes35. Debido a la facilidad de fabricación, esta plataforma de hidrogel es altamente traducible a escala. Las propiedades mecánicas y el tamaño de malla de los hidrogeles PNP se controlan alterando el porcentaje de peso de los componentes de polímeros y nanopartículas en la formulación. Estudios previos con esta plataforma indican que los hidrogeles PNP son altamente biocompatibles, biodegradables y no inmunogénicos28,30,31. En general, estos hidrogeles presentan una amplia utilidad en aplicaciones biomédicas que abarcan la prevención de la adhesión postoperatoria, la ingeniería y regeneración de tejidos, la administración sostenida de fármacos y la inmunoingeniería.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td>PNP hydrogel injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G, 4 in hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>N224</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates, black, clear bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3540</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, black</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-627</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, clear</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8729K66</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>NP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR759015-100EA</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DynaPro II Plate Reader</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>300007-392 (EA)</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>8300015027</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer elbow connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30800-12</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-456</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Spatula</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1229F13</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>TS-RT2-100</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11382II</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>DHR-2 Rheometer</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516-5G</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications

Estos métodos describen cómo formular hidrogeles de nanopartículas de polímero (PNP) supramoleculares inyectables para su uso como biomateriales. Los hidrogeles PNP se componen de dos componentes: celulosa modificada hidrofóbicamente como polímero de red y nanopartículas de núcleo-cáscara autoensambladas que actúan como reticuladores no covalentes a través de interacciones dinámicas y multivalentes. Estos métodos describen tanto la formación de estas nanopartículas autoensambladas a través de la nanoprecipitación como la formulación y mezcla de los dos componentes para formar hidrogeles con propiedades mecánicas sintonizables. También se detalla el uso de la dispersión dinámica de luz (DLS) y la reología para caracterizar la calidad de los materiales sintetizados. Finalmente, la utilidad de estos hidrogeles para la administración de fármacos, la estabilización biofarmacéutica y la encapsulación y administración celular se demuestra a través de experimentos in vitro para caracterizar la liberación de fármacos, la estabilidad térmica y el asentamiento y viabilidad celular. Debido a su biocompatibilidad, inyectabilidad y condiciones de formación de gel suaves, este sistema de hidrogel es una plataforma fácilmente sintonizable adecuada para una amplia gama de aplicaciones biomédicas.

Fabricación y caracterización de hidrogel PNP Los hidrogeles PNP se forman a través de la mezcla de los dos componentes principales: polímeros HPMC modificados hidrofóbicamente y nanopartículas PEG-PLA (Figura 1a). La carga terapéutica se incorpora más fácilmente en el tampón adicional utilizado para diluir el componente de nanopartículas antes de la preparación del hidrogel. Para la caracterización biomédica aguas abajo, es conveniente utilizar un método de mezcla de codo que permita la mezcla simple y reproducible de los dos componentes (Figura 1b). Después de una mezcla adecuada, el hidrogel debe sentirse firme en la jeringa, pero rendir bajo presión y extruir de una aguja estándar (21G mostrado) (Figura 1c). Después de la inyección, el hidrogel debe establecerse rápidamente en un material similar a un sólido que resista el flujo de la gravedad. Para caracterizar completamente el hidrogel y garantizar productos consistentes de lote a lote, las muestras deben analizarse utilizando varios experimentos diferentes en un reómetro. Las capacidades de cizalladura y autocuración del gel se observarán fácilmente utilizando un protocolo de barrido de flujo y un protocolo de cizalladura escalonada, respectivamente (Figura 2a,b). Para geles más rígidos, como la formulación 2:10, el usuario debe buscar la viscosidad para disminuir al menos dos órdenes de magnitud durante el barrido de flujo a medida que la tasa de cizalladura se incrementa de 0.1 a 100 s-1,lo que simula las condiciones mecánicas durante la inyección. El protocolo de cizalladura paso a paso debe revelar una disminución de órdenes de magnitud de la viscosidad bajo los pasos de alto cizalladura, y un retorno rápido (< tiempo de recuperación de s) a la viscosidad basal durante los pasos de cizalladura baja. La caracterización de los módulos de almacenamiento y pérdida utilizando un experimento de barrido de frecuencia de cizalladura oscilatoria en el régimen viscoelástico lineal debe revelar propiedades similares a sólidos en rangos de frecuencia de 0.1-100 rad s-1 (Figura 2c). En particular, por lo general no debe haber un cruce de los módulos de almacenamiento y pérdida de cizalladura que es observable a bajas frecuencias para formulaciones más rígidas como los hidrogeles 2:10. Tal evento de cruce puede indicar problemas en la calidad de los materiales de partida, ya sea el polímero HPMC o PEG-PLA modificado, o el tamaño y la dispersión de las nanopartículas PEG-PLA. Cabe señalar que se puede esperar un evento cruzado para formulaciones de hidrogel más débiles, como el hidrogel 1:5. Los barridos de amplitud de cizalladura oscilatoria en hidrogeles PNP revelan que los materiales no rinden hasta que se aplican altos valores de tensión, lo que indica que estos materiales poseen una tensión de rendimiento, una cantidad umbral de tensión requerida para que el material fluya.
Caracterización de la cinética de liberación de hidrogeles PNP Un paso esencial en el diseño de geles PNP para la administración de fármacos es la caracterización de la cinética de liberación de fármacos a partir de una formulación elegida. Existen varias técnicas para ello, pero una metodología in vitro sencilla proporciona datos útiles durante el desarrollo temprano de la formulación(Figura 3a). Variar el contenido polimérico de los hidrogeles PNP mediante la modulación de la cantidad de HPMC-C12 o NPs es la forma más sencilla de ajustar las propiedades mecánicas y el tamaño de malla de estos hidrogeles, lo que puede tener un impacto directo en la difusión de la carga a través de la red de polímeros y la tasa de liberación de los materiales (Figura 3b). Para la carga que es mayor que el tamaño dinámico de la malla (es decir, alto peso molecular o gran radio hidrodinámico), los investigadores deben esperar una liberación lenta, mediada por disolución de la carga desde el depósito de hidrogel. Las formulaciones con tamaños de malla dinámicos mayores o iguales al tamaño de la carga permitirán una liberación mediada por difusión que se puede describir utilizando modelos tradicionales de difusión de carga y liberación46,47,48,49. Basándose en la forma de la curva de liberación, los investigadores pueden reformular el hidrogel para ajustarlo hacia una liberación más lenta (por ejemplo, aumentar el contenido de polímeros) o más rápida (por ejemplo, disminuir el contenido de polímero).
Evaluación de la estabilidad de la carga terapéutica Determinar la estabilidad de la carga terapéutica en una formulación de hidrogel es fundamental antes de que se coman los estudios preclínicos o celulares. En comparación con otros métodos sintéticos para encapsular drogas, los hidrogeles PNP incorporan la carga de una manera suave al mezclarse en el material a granel, y es poco probable que la encapsulación dañe la carga. Estos estudios indican que los hidrogeles PNP también pueden estabilizar la carga que es susceptible a la inestabilidad térmica, como la insulina, extendiendo considerablemente la vida útil y reduciendo la dependencia del almacenamiento y distribución en frío (Figura 4). Es importante evaluar el estado de la carga inmediatamente después de la encapsulación en el hidrogel, así como después de largos períodos de almacenamiento. Estos datos muestran que la insulina permanece estable en hidrogeles después de 28 días de almacenamiento bajo estrés térmico y mecánico continuo, utilizando un simple ensayo de fluorescencia para medir la agregación de insulina. Una técnica alternativa para los casos en que un ensayo de placa apropiado no está disponible sería realizar mediciones de dicroísmo circular de la carga, que es particularmente útil para determinar la estructura secundaria de los fármacos proteicos.
Determinación de la viabilidad celular y dispersión en hidrogeles PNP Muchas células terapéuticas requieren motivos de adhesión para seguir siendo viables, y por lo tanto la inclusión de motivos de integrina como los péptidos de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD) es un paso importante en la adaptación de hidrogeles de PNP para terapias celulares50. El polímero modular PEG-PLA que comprende los NPs permite la funcionalización química de la corona PEG a través de simples químicos de "clic"28,51. En este ejemplo, los péptidos RGD adhesivos celulares se unieron al polímero PEG-PLA para promover el compromiso celular con la estructura de hidrogel PNP. Las formulaciones que carecen de sitios de adhesión tendrán baja viabilidad celular ya que las células encapsuladas no proliferan en comparación con las células encapsuladas en formulaciones con estos motivos de adhesión (Figura 5a,b). Las células encapsuladas se pueden etiquetar con caleína AM u otro tinte fluorescente apropiado (por ejemplo, CFSE) para facilitar el conteo celular con un microscopio de fluorescencia. Durante la optimización, la viabilidad debe compararse con los hidrogeles de PNP no modificadas para asegurar que las formulaciones funcionalizadas con integrina proporcionen una mayor viabilidad y proliferación. Si las formulaciones funcionalizadas con integrina proporcionan una eficacia similar a la de los hidrogeles no modificadas, esto puede indicar un fallo en la química de conjugación utilizada para incorporar los motivos de adhesión.
Los investigadores deben esperar que las células encapsuladas se dispersen uniformemente a través del medio de hidrogel cuando se utiliza una formulación de hidrogel adecuada. Esto permitirá una dosificación consistente y predecible de las células durante la administración de hidrogel y debería traducirse en la retención local de células en el hidrogel después de la administración. La distribución de las células se puede determinar fácilmente utilizando técnicas de microscopía de fluorescencia. Las células se pueden etiquetar con un tinte apropiado y luego se pueden obtener imágenes usando microscopía confocal. Las imágenes se pueden evaluar visualmente (Figura 5c) y también cuantitativamente (Figura 5d) utilizando el software ImageJ para medir la intensidad media de fluorescencia a lo largo del eje vertical de la imagen (o a lo largo del eje que se espera que se produzca la sedimentación celular debido a la gravedad). Si la formulación de hidrogel es demasiado débil para soportar las células en suspensión durante períodos de tiempo prolongados, se producirá la sedimentación celular, como se observa en la formulación 1:1 de la Figura 5. El aumento del contenido de polímeros puede resolver problemas con la dispersión celular no homogénea debido a la sedimentación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig1v4.jpg"> Figura 1:Los hidrogeles de nanopartículas poliméricas (PNP) se forman fácilmente mezclando dos componentes. (a)El primer componente es una solución de hidroxipropilmetilcelulosa modificada por dodecil (HPMC-C12),y el segundo componente es una solución de nanopartículas de poli(etilenglicol)-bloque-poli(ácido láctico) (PEG-PLA) junto con cualquier carga terapéutica. La mezcla suave de estos dos componentes produce un hidrogel inyectable, donde los polímeros HPMC-C12 están reticulados físicamente por interacciones dinámicas y multivalentes con las nanopartículas PEG-PLA. b) Fotografía que demuestre la formulación de gel mezclando con dos jeringuillas, cada una de las cual contiene un componente del hidrogel PNP. Al conectar las dos jeringas con un conector de codo Luer-lock, los dos componentes se pueden mezclar fácilmente en condiciones estériles para producir un hidrogel sin burbujas precargado en una jeringa para uso inmediato. La solución de NP se tiñe de azul con el fin de demostración. c)Demostración de la inyección de hidrogeles de PNP y su re-solidificación. i) Hidrogel PNP en una jeringa con una aguja 21G adherida. ii) La inyección coloca el hidrogel bajo cizalladura, lo que rompe temporalmente las interacciones entre el polímero y las nanopartículas, creando una consistencia similar a la de un fluido. iii) Después de la inyección, las interacciones dinámicas polímero-nanopartícula se reforman rápidamente, permitiendo que el hidrogel se auto-cure en un sólido. iv) El hidrogel sólido no fluye por fuerzas más débiles que su tensión de rendimiento, como la gravedad. El hidrogel PNP se tiñe de azul con el propósito de demostración. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig2v3.jpg"> Figura 2: Caracterización reológica de dos formulaciones de hidrogel PNP. Las formulaciones se denotan como polímero wt.%: NP wt.%. (a)Barridos de flujo de cizalladura constante de baja a alta tasa de cizalladura de los hidrogeles PNP. La viscosidad en función de la velocidad de cizalladura caracteriza las propiedades de cizalladura-adelgazamiento. (b)Viscosidad en función de las tasas de cizallamiento oscilantes entre bajas tasas de cizallamiento (fondo blanco; 0,1 s−1)a altas tasas de cizallamiento (fondo rojo; 10 s−1)que demuestran las propiedades autorreparables de los hidrogeles PNP. Las tasas de cizalladura se imponen por 30 s cada una. (c) Módulo de almacenamiento elástico G′ y módulo de pérdida viscosa G" en función de la frecuencia a una tensión constante del 1% para diversas formulaciones de hidrogel PNP. (d)Barridos de amplitud a una frecuencia constante de 10 rad/s para caracterizar el módulo de almacenamiento elástico G′ y el módulo de pérdida viscosa G" de hidrogeles PNP en función de la tensión. Esta caracterización reológica se puede utilizar como comparación para el control de calidad. Esta cifra ha sido adaptada de Grosskopf et al.28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig2v2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2.jpg"> Figura 3: Liberación in vitro de albúmina sérica bovina (BSA) a partir de hidrogeles PNP. Las formulaciones se denotan como polímero wt.%: NP wt.%. (a) Esquema que describe el protocolo experimental de liberación in vitro. Las alícuotas se eliminan de los tubos capilares cargados de hidrogel de PNP con el tiempo. b)La liberación in vitro de BSA a partir de 1:10 PNP, 2:5 PNP y 2:10 PNP notificada como la masa recogida por el punto de tiempo especificado dividido por la masa total recogida durante el ensayo (datos mostrados como media ± DE; n = 3). BSA fue detectado con medidas de la absorbancia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2.jpg"> Figura 4: Estabilidad térmica de la insulina encapsulada en hidrogeles PNP por ensayo ThT. Las formulaciones se denotan como polímero wt.%: NP wt.%. La insulina encapsulada en hidrogel 1:5 y 2:10 PNP seguía siendo unaggregated por más de 28 días en las condiciones tensionadas del envejecimiento del °C 37 y de la agitación constante. El tiempo hasta la agregación para la insulina formulada en PBS era 20 ± 4 h (malo ± SD, umbral de la agregación 750.000 AFU). Datos presentados como un promedio de n = 4 réplicas experimentales (AFU, unidades arbitrarias de fluorescencia). Esta cifra ha sido adaptada de Meis et al.38<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2.jpg"> Figura 5:Viabilidad celular y sedimentación celular en hidrogeles PNP. (a,b)Estudios de viabilidad celular en hidrogeles PNP con células madre mesenquimales humanas (hMSCs). (a)Imágenes representativas de hMSCs viables en hidrogeles de 1:5 PNP con y sin el motivo de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD) adhesivo de células conjugado con los HMSCs de PEG-PLA. La barra de escala representa 100 μm.(b)Viabilidad celular en el día 6 definida como el número de células fluorescentes en la imagen en relación con el número de células fluorescentes en el día 1 (datos mostrados como media ± DE; n = 3). c,d) Experimentos de encapsulación celular y asentamiento con hMSCs. (c) Imágenes de máxima intensidad de calcina AM-teñidos hMSCs encapsulados en hidrogel 1:1 PNP (fila superior) y 1:5 PNP hidrogel (fila inferior) a través de 4 horas para cuantificar el asentamiento celular. La barra de escala representa 1 mm.(d)Intensidad media de píxeles horizontales de los hMSC a lo largo del perfil vertical del hidrogel. Esta cifra ha sido adaptada de Grosskopf et al.28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

Este protocolo describe la síntesis y formulación de biomateriales inyectables de hidrogel de polímeros y nanopartículas supramoleculares (PNP). Se demuestran las aplicaciones de estos materiales para la administración de fármacos, la estabilización biofarmacéutica y la encapsulación y administración celular.

Hidrogeles de polímeros y nanopartículas supramoleculares inyectables para aplicaciones de administración de células y fármacos

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

Nuestro protocolo facilita la formulación de hidrogeles de polímeros-nanopartículas para su uso como biomateriales. Esperamos que los investigadores desarrollen este material para aplicaciones traslacionales y para explorar cuestiones biológicas básicas. Los hidrogeles de PNP se inyectan fácilmente a través de agujas y catéteres de pequeño diámetro, pero se auto-curan rápidamente después de la inyección.Esto permite la administración controlada no invasiva de fármacos y células en largas escalas de tiempo. Esta tecnología empuja los límites para la terapia localizada y el lanzamiento extendido de la droga, con implicaciones para las condiciones furiosas amplias del cáncer a la regeneración del tejido a la inmunización pasiva. Para sintetizar nanopartículas por nano precipitación, agregue 50 miligramos de polímero PEG-PLA a un vial de centelleo de vidrio de ocho mililitros y agregue un mililitro de acetonitrilo al vial.Vórtice para disolverse completamente. A continuación, agregue 10 mililitros de agua ultra pura a un vial de centelleo de vidrio de 20 mililitros con una pequeña barra de agitación y coloque el vial en una placa de agitación configurada a 600 revoluciones por minuto. Utilice una pipeta de 200 microlitros para añadir un mililitro de la solución de disolvente polimérico gota a gota al vial de agua.Las nanopartículas de la cáscara del núcleo se formarán a medida que la solución de disolvente polimérico se disperse rápidamente por toda el agua. Verifique el tamaño de partícula mediante dispersión de luz dinámica de acuerdo con los protocolos estándar. A continuación, transfiera la solución de nanopartículas a una unidad de filtro centrífuga para concentrar la solución en menos de 250 microlitros y resuspend las nanopartículas en un tampón apropiado.Para preparar el hidrogel, agregue 333 miligramos de solución madre 6% HPMC-C12 a una jeringa de bloqueo Luer de un mililitro y agregue 500 microlitros de la solución madre de nanopartículas al 20% y 167 microlitros de PBS a un vial de ocho mililitros. Después de mezclar, use una aguja para llenar otra jeringa de bloqueo Luer de un mililitro con la solución diluida de nanopartículas y conecte las dos jeringas a un mezclador de codo. Mezcle las dos soluciones durante aproximadamente 60 ciclos hasta que se haya formado un material de hidrogel blanco opaco homogéneo.Para medir las propiedades reológicas del hidrogel formulado, inyecte el volumen apropiado de hidrogel de acuerdo con el espacio de geometría seleccionado en el centro de una placa de reómetro dentada y utilice pruebas oscilatorias y de flujo para medir las propiedades mecánicas de la muestra. Para caracterizar la liberación de fármacos del hidrogel, primero, prepare un capilar de vidrio mediante el uso de epoxi para sellar un extremo de cada tubo. Cuando el epoxi se haya establecido, use una aguja hipodérmica de cuatro pulgadas de calibre 22 para inyectar de 100 a 200 microlitros de hidrogel en un mínimo de tres tubos por muestra, y agregue cuidadosamente de 200 a 300 microlitros de PBS en cada volumen de hidrogel.En los puntos de tiempo apropiados, de acuerdo con la escala de tiempo prevista de liberación de la droga, use una aguja para eliminar cuidadosamente el PBS de cada capilar sin perturbar la superficie del hidrogel y agregue un volumen fresco de PBS. Al finalizar el estudio, analizar las alícuotas de PBS recogidas con un método adecuado para cuantificar la cantidad de fármaco liberado en cada momento. Para caracterizar la estabilidad térmica de la insulina encapsulada en gel, cargue tanto la insulina como la tioflavina T en el hidrogel como se ha demostrado y use una aguja calibre 21 para inyectar 200 microlitros de la carga y el hidrogel cargado por sonda en al menos tres pozos de una placa negra de 96 pocillos por muestra.Luego selle la placa con un sello de placa adhesiva ópticamente transparente para evitar la evaporación e inserte la placa en un lector de placas equipado con control de temperatura, agitación y una programación de lectura cinética. Para evaluar la viabilidad de las células encapsuladas en hidrogel, utilice una aguja de calibre 21 para inyectar 150 microlitros de hidrogel que contengan la concentración adecuada de células en cada uno de los tres pocillos por muestra en una placa de 96 pocillos de fondo transparente y agregue 100 microlitros del medio celular apropiado en cada volumen de hidrogel. El primer día de cultivo, reemplace el sobrenadante en cada hidrogel en el punto de tiempo apropiado para cada grupo de muestra con 50 microlitros de dos milimomolares de calceína AM solución.Después de una incubación de 30 minutos, imagen del centro de cada pozo por microscopía confocal. Para evaluar la capacidad de las células encapsuladas para asentarse en una jeringa antes de la inyección, diluir las células de interés a un uno por 10 a las seis células por mililitro en la concentración de PBS y teñir las células con 50 microlitros de dos milimolares Calcein AM durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, mezcle las células con 500 a 700 microlitros de hidrogel como se ha demostrado y use una aguja de calibre 21 para inyectar de 100 a 200 microlitros de hidrogel que contienen células en el fondo de al menos una cubeta por muestra.A continuación, iría las cubetas tumbadas de lado en el escenario de un microscopio confocal inmediatamente después de la inyección y a las una y cuatro horas después de la siembra para observar si las células se han asentado en el hidrogel o si han permanecido suspendidas. El adelgazamiento de cizallamiento y las capacidades de autocuración del gel se pueden observar utilizando protocolos de barrido de flujo y cizallamiento escalonado, respectivamente. La caracterización de los módulos de almacenamiento y pérdida utilizando un experimento de barrido de frecuencia de cizalladura oscilatoria en el régimen viscoelástico lineal en rangos de frecuencia de 0,1 a 100 radianes por segundo revela las propiedades similares a los sólidos.Por lo general, no debe haber un cruce de los módulos de almacenamiento y pérdida de cizallamiento observados a bajas frecuencias para formulaciones más rígidas, mientras que los eventos de cruce se pueden esperar para formulaciones de hidrogel más débiles. Variar el contenido de polímeros de los hidrogeles PNP puede tener un impacto directo en la difusión de la carga a través de la red de polímeros y la tasa de liberación de los materiales. Los hidrogeles PNP también pueden estabilizar la carga que es susceptible a la inestabilidad térmica, extendiendo considerablemente la vida útil de la carga y reduciendo la dependencia del almacenamiento y la distribución de la cadena de frío.La inclusión de motivos de integrina puede ser útil para adaptar hidrogeles de PNP para terapias celulares. Las células encapsuladas se pueden etiquetar fluorescentemente para facilitar su visualización y cuantificación. Por ejemplo, las formulaciones que carecen de sitios de adhesión tendrán una baja viabilidad celular, ya que las células encapsuladas no proliferan en comparación con las células encapsuladas y las formulaciones con motivos de adhesión, como la RGD.Todavía estamos explorando cómo los cambios en la formulación afectan las características reológicas y la malla dinámica de la matriz polimérica. También utilizamos FRAP para estudiar la difusión de moléculas dentro del hidrogel. Estos materiales se pueden utilizar para hacer nuevas preguntas biológicas sobre cómo la administración sostenida podría afectar la administración de fármacos, el desarrollo de vacunas o la inmunoterapia contra el cáncer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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