Name: real-time intravital multiphoton microscopy to visualize focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability
Uploaded: 2022-02-05T13:00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability at JoVE.co

Die Unterbringung der Tiere erfolgte durch die Comparative Medicine Core Facility (CoMed, NTNU). Abbildung 3 wurde in BioRender.com erstellt. Die Videoaufzeichnung und -bearbeitung wurde von Per Henning, Webmaster an der Fakultät für Naturwissenschaften der NTNU, durchgeführt. Das Projekt wurde von der Norwegian University of Science and Technology (NTNU, Trondheim, Norwegen), dem Research Council of Norway (RCN 262228), den Canadian Institutes of Health Research (FDN 154272), dem National Institute of Health (R01 EB003268) und dem Temerty Chair in Focused Ultrasound Research am Sunnybrook Health Sciences Centre finanziert.

Alle folgenden experimentellen Verfahren wurden von der norwegischen Behörde für Lebensmittel- und Sicherheit, dem Animal Care Committee des Sunnybrook Research Institute und dem Canadian Council on Animal Care genehmigt und in Übereinstimmung mit diesen durchgeführt.
1. Materialaufbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die Materialien vor, die für die Schädelfensterchirurgie und Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen benötigt werden. Für chronische Schädelfenster sind sterilisierte Werkzeuge und Materialien, ein steriler Operationsraum sowie eine prä- und postoperative Arzneimittelverabreichung erforderlich23,24,25.</li>
	<li>Aufbereitung von Schallwandler und Deckgläsern<ol>
<li>Überprüfen Sie die physische Unversehrtheit des Schallkopfes: Achten Sie auf Risse und Dellen. Stellen Sie sicher, dass die Elektroden an der Oberseite und an der Seite des Schallkopfes intakt sind.</li>
		<li>Cyanacrylatkleber in eine kleine Schüssel geben. Verwenden Sie einen Applikator, um eine dünne Schicht Klebstoff auf die Oberfläche des Wandlers zu verteilen.</li>
		<li>Legen Sie den Schallkopf auf den Glasdecker. Drücken Sie fest für 20-30 s nach unten. HINWEIS: Eine 3D-gedruckte Form kann verwendet werden, um die Ausrichtung des Glasdeckglases mit dem Ringaufnehmer zu erleichtern und einen festen und gleichmäßigen Druck auf den Deckglas- und Ringaufnehmer zu gewährleisten (Abbildung 2).</li>
		<li>Überprüfen Sie auf Blasen zwischen dem Aufnehmer und dem Deckglas. Wenn Blasen vorhanden sind, nehmen Sie den Deckglas ab und wiederholen Sie ihn ab Schritt 1.2.3., da luft die Ultraschallausbreitung behindert. Über Nacht bei Raumtemperatur aushärten.</li>
		<li>Passen Sie nach dem Aufkleben an einem Glasdeckglas den Aufnehmer an (Abbildung 3). HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet einen im eigenen Haus hergestellten Blei-Zirkonat-Titanat-Ringaufnehmer (10 mm Außendurchmesser, 1,4 mm Dicke, 1,2 mm Höhe)35, der auf eine 50 Ω Impedanz und 0 ° -Phasenlast mit einer kundenspezifisch passenden Schaltung abgestimmt ist. Der Messumformer wird im Dickenmodus mit 0,82 MHz angetrieben und erzeugt einen kreisförmigen Brennfleck etwa 1 mm unter dem Deckglas. Ringaufnehmer ähnlicher Eigenschaften (10 mm Außendurchmesser, 1,5 mm Dicke, 1,1 mm Höhe) wurden charakterisiert26 und ausgiebig für Multiphotonenmikroskopie-Experimente verwendet27,28,29,31,32,36.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederverwendung von Schallköpfen und Austausch von Deckgläsern<ol>
<li>Ersetzen Sie das Deckglas, wenn es rissig ist oder Ablagerungen (z. B. Fell, Klebstoff) aus dem vorherigen Experiment aufweist. Um den Deckglas zu entfernen, lösen Sie den Kleber auf, indem Sie den Aufnehmer und den Deckglas für 20 min in Aceton tauchen. HINWEIS: Aceton kann die Integrität des Wandlers und/oder der Elektroden beeinträchtigen. Erkundigen Sie sich beim Hersteller, bevor Sie mit diesem Schritt fortfahren.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob das Aceton den Kleber aufgelöst hat, indem Sie vorsichtig mit einer Pinzette am Deckglas ziehen. Überprüfen Sie einmal alle 10 Minuten, um eine längere Acetonexposition zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tierpräparation
<ol><li>Betäuben Sie das Tier, indem Sie eine Mischung aus medizinischer Luft, Sauerstoff und Isofluran in einer Induktionskammer verwenden. HINWEIS: Es wurde berichtet, dass die Verwendung von Sauerstoff als Trägergas die Halbwertszeit von Mikrobläschen beeinflusst37,38 und das Ausmaß der durch Ultraschall-Mikrobläschen induzierten Erhöhungen der BHS-Permeabilität27 verringert, aber auch das Risiko von Hypoxie und Mortalität verringern kann39. Wählen Sie Trägergase basierend auf Projektzielen und tierärztlicher Beratung. Injizierbare Anästhetika wie ein Ketamin / Xylazin-Cocktail können ebenfalls verwendet werden; Es ist jedoch einfacher, die Anästhesieebene und den Blutsauerstoffgehalt zu kontrollieren, wenn inhalierbare Anästhetika verwendet werden.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob das Tier eine ausreichende Anästhesie erreicht hat, indem Sie eine Zehenzange durchführen. Wiegen Sie das Tier, um die Dosierung von Dextran, Mikrobläschen und Medikamenten zu bestimmen. Entfernen Sie das Fell vom Kopf des Tieres und legen Sie das Tier auf einen stereotaktischen Rahmen.</li>
	<li>Für akute Experimente muss der Zugang zum systemischen Kreislauf für Dextran- und Mikroblaseninjektionen hergestellt werden. Um dies zu erreichen, führen Sie einen 27 g Katheter in eine Schwanzvene ein. HINWEIS: Während auch retroorbitale Injektionen möglich sind, werden Schwanzvenen aufgrund des begrenzten Arbeitsbereichs im Kopfbereich während der Multiphotonenbildgebung empfohlen.</li>
	<li>Übertragen Sie das Tier auf den stereotaktischen Rahmen und schalten Sie die Anästhesie auf den Nasenkegel. Halten Sie die Kerntemperatur des Tieres von 37 ° C mit einer Wärmequelle wie einem Heizkissen oder einem mit warmem Wasser gefüllten Handschuh aufrecht.</li>
	<li>Überwachen Sie die Tiertemperatur mit einer rektalen Sonde und die Tierphysiologie mit einem Pulsoximeter. Ophthalmologische Salbe auftragen. Injizieren Sie geeignete präoperative Analgetika und/oder entzündungshemmende Medikamente (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Bevor Sie mit der Schädelfensteroperation beginnen, überprüfen Sie die Anästhesieebene und die Herzfrequenz, die O2-Sättigung , die Atemfrequenz und die Temperatur des Tieres.</li>
	<li>Um die Schädelfensteroperation zu beginnen, entfernen Sie das Fell auf dem Kopf, indem Sie eine Enthaarungscreme auftragen und / oder Pelzscheren verwenden. Entfernen Sie das Fell zwischen den Augen bis zur vorderen Halshälfte (Abbildung 4A). HINWEIS: Längerer Kontakt mit der Enthaarungscreme verbrennt die Haut. Bei chronischen Schädelfensteroperationen waschen Sie die Kopfhaut nach der Fellentfernung abwechselnd mit Betadintüchern und 70% EtOH. Bereiten Sie den Operationsraum für die sterile Operation vor. Die Sterilität muss bis Schritt 2.15 aufrechterhalten werden.</li>
	<li>Um die Kopfhaut zu entfernen, heben Sie die Haut zwischen den Augen mit einer Pinzette an, die in der nicht dominanten Hand entlang der sagittalen Naht gehalten wird. Entfernen Sie die Haut mit einer gekrümmten Schere, um die Parietalknochen freizulegen (Abbildung 4B). Üben Sie festen Druck mit einem Wattestäbchen aus, wenn Blutungen aus dem Schädel oder der Kopfhaut auftreten. Blutungen müssen gestoppt werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. HINWEIS: Bei akuten Operationen kann die Haut mit flüssigem Cyanacrylatkleber oder Gewebekleber zurückgedrückt und am Schädel haften.</li>
	<li>Entfernen Sie das Periost, das die äußere Oberfläche des Schädels bedeckt, mit Wattestäbchen.</li>
	<li>Skizzieren Sie mit einem Operationsmikroskop (6-25x) und einem Zahnbohrer (0,5 mm Bohrgrat, mittlere Geschwindigkeit) einen Kreis auf den Parietalknochen, um die gewünschte Position des Schädelfensters auf dem Schädel zu markieren (Abbildung 5). Vermeiden Sie die sagittale Naht, Lambda und Bregma, da diese Bereiche dünner sind und große Blutgefäße überlagern. HINWEIS: Um das Bohren zu erleichtern, kann mit einem Marker und einer Schablone ein Umriss des Schädelfensters auf den Schädel gezeichnet werden (Abbildung 5A). Für Ratten kann es einfacher sein, ein rechteckiges anstelle eines kreisförmigen Schädelfensters zu bohren. Aufgrund der Dicke des Schädelknochens der Ratte verwenden Sie einen 0,7-mm-Bohrer, um das Schädelfenster im kompakten Knochen zu umreißen, bevor Sie einen 0,5-mm-Bohrer verwenden, um den Bohrvorgang abzuschließen.</li>
	<li>Üben Sie sanften Druck mit dem Bohrer aus; übermäßiger Druck erhöht das Risiko, Hirngewebe zu schädigen. Um zu verhindern, dass der Schädel während des Bohrens überhitzt, tropfen Sie Kochsalzlösung mit einer Spritze auf den Schädel oder tragen Sie ein Stück chirurgischen Schwamm auf, der in Kochsalzlösung getränkt ist.</li>
	<li>Wechseln Sie zwischen Bohren und Abkühlen des Schädels, bis sich die resultierende Knocheninsel vom Rest des Schädels trennt. Überprüfen Sie den Bohrfortschritt, indem Sie mit einer Pinzette oder dem Bohrer sanften Druck auf die Knocheninsel ausüben. Bohren Sie weiter, bis sich die Knocheninsel vom Rest des Schädels trennt. HINWEIS: Kleine Risse in den dünnsten Bereichen des Schädels sind ein guter Hinweis darauf, dass die Bohrungen fast abgeschlossen sind. Der Versuch, die Knocheninsel vorzeitig zu entfernen, kann dazu führen, dass Knochenstücke in das Hirngewebe eindringen, die Dura schädigen und Entzündungen und Blutungen verursachen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Knocheninsel, indem Sie mit einer feinen Pinzette die Kanten oder die obere kompakte Knochenschicht der Knocheninsel greifen (Abbildung 6A). Stellen Sie sicher, dass das Gehirn feucht gehalten wird, indem Sie ein Stück chirurgischen Schwamm auftragen, der in Kochsalzlösung vorgetränkt wurde. Wenn Blutungen beobachtet werden, legen Sie den chirurgischen Schwamm auf die Region, die blutet. Fahren Sie erst mit dem nächsten Schritt fort, wenn die Blutung aufgehört hat. HINWEIS: Wenn die Blutung nach 5 Minuten anhält, kann das Tier nicht für Multiphotonen-Bildgebungsexperimente verwendet werden. Bei Ratten kann es notwendig sein, die Dura zu entfernen, wenn sie dick ist. Um die Dura zu entfernen, verwenden Sie eine hohe Vergrößerung am Operationsmikroskop und eine feine Pinzette.</li>
	<li>Um ein Schädelfenster zu platzieren, nehmen Sie einen Glasdecker mit einer Pinzette auf, legen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf eine Seite und manövrieren Sie ihn über das Loch im Schädel. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen unter dem Deckglas befinden. HINWEIS: Verwenden Sie einen 5 mm Glasdeckglas für Mäuse und 8 mm für Ratten. Verwenden Sie bei Ratten aufgrund der Dicke des Schädelknochens eine Agaroselösung anstelle von Kochsalzlösung, um den Raum zwischen dem Deckglas und dem Gehirn zu füllen. Der Schallkopf und sein Deckglas können auch direkt auf den Schädel geklebt werden, anstatt einen separaten Deckglas für das Schädelfenster zu verwenden. Fahren Sie für diese Option mit Schritt 3.1 fort. Weitere Informationen finden Sie in Abbildung 1 .</li>
	<li>Verteilen Sie eine Schicht Cyanacrylatkleber um den Umfang des Deckglases (Abbildung 6B), um sie am Schädel zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass sich kein Klebstoff unter dem Deckglas befindet. Üben Sie Druck auf das Deckglas aus, um sicherzustellen, dass der Klebstoff nicht mit dem Gehirn in Berührung kommt.</li>
	<li>Sobald der Kleber vollständig trocken ist, gleichen Sie die Oberfläche des Klebstoffs mit dem Zahnbohrer aus. Stellen Sie sicher, dass alle Leimablagerungen aus dem Operationsbereich entfernt werden. HINWEIS: Für chronische Schädelfenster injizieren Sie die notwendigen postoperativen Medikamente (siehe Materialtabelle), stellen Sie Salbe für die Wundversorgung und weiche Lebensmittel zur Verfügung und erholen Sie das Tier unter einer Wärmelampe.</li>
</ol>3. Platzierung des Ringaufnehmers
<ol><li>Bereiten Sie die 1%ige (w/v) Agaroselösung vor. In einem kleinen Becher- oder Erlenmeyerkolben werden 0,1 g Agarose und 10 ml PBS (1x) oder Kochsalzlösung zugegeben. Kochen Sie die Lösung, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat, indem Sie das Becherglas auf eine Kochplatte stellen oder die Lösung in einem Mikrowellenherd erhitzen (30-45 s).</li>
	<li>Die Schritte 3.2-3.5 sind zeitkritisch, da die Agaroselösung schnell abkühlt. Ziehen Sie ~ 0,5 ml Agarose in eine 1 ml Spritze. HINWEIS: Um die Integrität des Gehirns zu schützen, stellen Sie sicher, dass die Temperatur der Agarose vor dem Gebrauch der Körpertemperatur entspricht.</li>
	<li>Deponieren Sie die Agarose großzügig auf dem Deckglas des Schädelfensters. HINWEIS: Wenn das Gewebe blanchiert, war die Temperatur der Agarose zu hoch; das Tier muss eingeschläfert werden. Wenn es keinen separaten Deckglas gibt, der das Gehirn bedeckt (d.h. der Schallkopf und sein Deckglas werden direkt auf das Gehirn gelegt, siehe Schritt 2.14), dann sollte Agarose in diesem Schritt auf der Oberfläche des Gehirns abgelagert werden.</li>
	<li>Platzieren Sie den Wandler über dem Schädelfenster (Abbildung 6C). Üben Sie festen Druck aus, so dass zwischen dem Schallkopf und dem Schädelfenster nur minimale Agarose vorhanden ist. Stellen Sie sicher, dass der Wandler zentriert (XY-Ebene) und parallel (Z-Ebene) zum Schädelfenster ist und dass sich keine Luftblasen in der Agarose befinden.</li>
	<li>Wenn die Agarose auf eine jelloartige Konsistenz abgekühlt ist, schneiden Sie überschüssige Agarose mit einem Spatel oder Skalpell aus dem Umfang des Deckglases des Schallkopfes weg. Stellen Sie sicher, dass sich unter dem Deckglas des Schallkopfes keine Luftblasen befinden.</li>
	<li>Verteilen Sie mit einem Spatel eine Schicht Cyanacrylatkleber über den Umfang des Deckglases des Schallkopfes, die sich bis zum Schädel erstreckt, so dass der Schallkopf fest am Schädel haftet.</li>
	<li>Halten Sie den Festdruck auf dem Aufnehmer aufrecht, bis der Kleber vollständig getrocknet ist (10-15 min).</li>
</ol>4. Multiphotonen-Mikroskopie-Bildgebung
<ol><li>Positionieren Sie das Tier unter der Objektivlinse (Abbildung 7A). Stellen Sie sicher, dass die Objektivlinse im Ringaufnehmer zentriert und parallel zum Messumformer ist (Abbildung 7B). Wenn eine Wasserimmersionsobjektivlinse verwendet wird, füllen Sie die Mitte des Ringaufnehmers mit entionisiertem und entgastem Wasser. HINWEIS: Entgastes Wasser ist wichtig für eine ordnungsgemäße Ultraschallausbreitung.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Objektivlinse in ihrer höchsten Position, und senken Sie dann langsam die Objektivlinse ab, bis sie sich im Ringaufnehmer befindet (Abbildung 7A, B). Stellen Sie sicher, dass die Objektivlinse nicht mit dem Messumformer oder Deckglas kollidiert. HINWEIS: Wechseln Sie zwischen dem Okular, um zu überprüfen, ob sich die Z-Position der Objektivlinse in der Ebene mit der Oberfläche des Gehirns befindet, und mit dem Auge, um sicherzustellen, dass die Objektivlinse nicht mit dem Schallkopf oder dem Deckglas kollidiert. Es kann einfacher sein, die Pialgefäße durch das Okular nach Injektion von fluoreszierendem Dextran durch die Schwanzvene zu visualisieren (Abbildung 7C).</li>
	<li>Bereiten Sie das Multiphotonenmikroskop für die Bildgebung vor. HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet ein aufrechtes Multiphotonenmikroskop und eine 20-25-fache Objektivlinse mit einem Arbeitsabstand von 2 mm, was ausreicht, um über die Deckgläser hinaus in das Hirnparenchym zu fokussieren.</li>
	<li>Bereiten Sie den Dextran vor. Geben Sie die entsprechende Menge PBS gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Durchstechflasche mit Dextran. Wirbeln Sie die Dextranlösung für 1-3 min, um sicherzustellen, dass das Dextranpulver vollständig gelöst ist. Injizieren Sie die Dextranlösung in die Schwanzvene.</li>
	<li>Einrichten eines Bildscans<ol>
<li>Stellen Sie mit den Okularen sicher, dass sich die Objektivlinse parallel zum Gehirn befindet. Kippen Sie das Tier, um XZ- und YZ-Fehlausrichtungen zu korrigieren.</li>
		<li>Wählen Sie ein Sichtfeld in einem Multiphotonenmikroskop aus. Richten Sie vor der Ultraschallexposition einen XYZ-Scan ein, um vor der Ultraschallexposition ein Basisbild des Gefäßsystems zu erhalten. HINWEIS: Typische Bildgebungsparameter sind wie folgt: 300-800 μm Tiefe, 2-5 μm Schrittweite und 10-20 Zeitstapel. Stellen Sie sicher, dass die Objektivlinse während der Bildgebungssequenz nicht mit dem Schallkopf oder Deckglas an ihrem tiefsten Punkt in Berührung kommt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Ultraschall-Exposition
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass alle BNC-Kabel ordnungsgemäß angeschlossen sind (Abbildung 3).</li>
	<li>Richten Sie einen XYZT-Bildscan ein, der lang genug ist, um Bildstapel vor, während und nach Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen zu erfassen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Mikroblasen vor, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen. Injizieren Sie die Mikrobläschen in die Schwanzvene und beginnen Sie mit der Bildgebung. HINWEIS: Mikroblaseninjektionen können mit einer Infusionspumpe durchgeführt werden, um eine konsistente Injektionsrate zu gewährleisten und eine gleichzeitige Mikroblaseninjektion und Bildgebung zu ermöglichen. Wenn während der Bildgebung Mikrobläschen injiziert werden sollen, stellen Sie sicher, dass die Schwanzvene leicht zugänglich ist, ohne die Detektoren Umgebungslicht auszusetzen.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Beschallung. HINWEIS: Typische Ultraschallparameter sind wie folgt: 10 ms Zyklen, mechanischer Index von 0,2-0,4 und Pulswiederholfrequenzen zwischen 1-4 Hz. Ultraschall- und Mikroblasenparameter, die in präklinischen Ultraschall-Mikroblasenstudien verwendet werden, wurden ausführlich untersucht und sind in der Literatur gut dokumentiert (z. B. siehe 40 für eine Überprüfung).</li>
	<li>Setzen Sie die Multiphotonen-Bildgebung während der gesamten Dauer der Beschallung und nach dem Ende der Beschallung fort. Achten Sie auf Dextran-Extravasation aus Blutgefäßen, da dies auf eine Erhöhung der BHS-Permeabilität hinweist. HINWEIS: Wenn Dextran im extravaskulären Raum, aber in der Peripherie des Sichtfeldes nachgewiesen wird, kann es zu betroffenen Blutgefäßen außerhalb des Sichtfeldes kommen. Dies kann aus einer Fehlausrichtung des Schallkopfes mit dem Fokus der Objektivlinse resultieren. In diesem Szenario ist es einfacher, das Sichtfeld durch Bewegen der Objektivlinse oder durch Neupositionieren des Tieres anzupassen, als den Wandler neu auszurichten.</li>
	<li>Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, euthanasieren Sie die zervikale Luxation des Tieres unter tiefer Anästhesie oder CO2-Erstickung. Für chronische Schädelfenster eine Schicht Zahnzement auf den freiliegenden Schädel verteilen. HINWEIS: Bei chronischen Schädelfenstern kann die das Fenster umgebende Haut vernäht werden, obwohl dies aufgrund der Entfernung der Kopfhaut in Schritt 2.8 nicht notwendig ist.</li>
</ol>6. Bildanalyse
<ol><li>Exportieren Sie Bildstapel.</li>
	<li>Analysieren Sie Bilder mit Bildanalysesoftware (z. B. Olympus Fluoview, ImageJ/FIJI, Bitplane Imaris, ThermoFisher Scientific Amira) und/oder Programmierwerkzeugen (z. B. Python, MATLAB).</li>
</ol>

Charissa Poon, Melina Mühlenpfordt, Marieke Olsman und Catharina de Lange Davies erklären keine finanziellen oder nichtfinanziellen konkurrierenden Interessenkonflikte. Spiros Kotopoulis ist Ein Vollzeitmitarbeiter und besitzt Anteile an EXACT Therapeutics AS, einem Unternehmen, das Ultraschall und Mikroblasen / Cluster-verstärkte Arzneimittelverabreichung entwickelt. Kullervo Hynynen ist der Gründer von FUS Instruments, von dem er nicht-forschungsbezogene Unterstützung erhält.

Die intravitale Multiphotonenmikroskopie-Überwachung des Gehirns ist ein wertvolles Werkzeug, um Gehirnreaktionen während der Ultraschallexposition zu untersuchen. Unseres Wissens ist das hier beschriebene Protokoll die einzige Methode zur Durchführung einer Multiphotonenmikroskopie-Bildgebung des Hirnparenchyms während Ultraschall-Mikrobläschen-Behandlungen. Die Schaffung von Schädelfenstern und die Verwendung von Ringwandlern ermöglichen die Echtzeitüberwachung von vaskulären, zellulären und anderen nachgeschalteten Reaktionen auf Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Andere Gruppen haben nach Abschluss von Ultraschall-Mikroblasen-Behandlungen Multiphotonenmikroskopie-Bildgebung durchgeführt, wodurch die Echtzeitreaktion des Gehirnparenchyms auf Behandlungen übersehen wurde19. Das beschriebene Verfahren bietet eine verbesserte zeitliche Kontrolle und ermöglicht die Erfassung von Daten, die dazu beitragen können, die akuten Mechanismen hinter Ultraschall-Mikroblasen-Behandlungen zu beleuchten. Aus den erfassten Bildstapeln können quantitative und qualitative Daten extrahiert und analysiert werden, wie z.B. Extravasationskinetik27,29,30, Veränderungen des β-Amyloid-Plaque-Volumens31 und Zelldynamik32.
Mehrere Schritte zur Fehlerbehebung wurden im gesamten Protokoll hervorgehoben. Zunächst wurden chirurgische Schritte hervorgehoben, die besonders anfällig für Bedienfehler sind, wie die Verwendung von Agarose während der Schädelfensterchirurgie und die Platzierung des Schallkopfes. Es wurden auch Schritte zur Verhinderung von Beschwerden und Tod bei Tieren bereitgestellt, einschließlich der Überwachung der Tierphysiologie während der Operation und der gründlichen Wirbelung des Dextrans vor der Injektion. Zweitens wurden auch die physikalischen Spezifikationen des Schallkopfes und die Ausrichtung der Objektivlinse, des Wandlers und des Schädelfensters hervorgehoben. Die Spezifikationen des Ringaufnehmers und seine akustischen Eigenschaften müssen unter Berücksichtigung der verwendeten Objektivlinse sowie des Tiermodells ermittelt werden. Insbesondere muss der Innendurchmesser des Ringaufnehmers groß genug sein, um die Objektivlinse zu umgeben, aber klein genug, um sicher am Schädel des Tieres montiert zu werden. Darüber hinaus muss der Fokusbereich des Schallkopfes mit dem Bereich der verwendeten Objektivlinse übereinstimmen.
Eine häufige Herausforderung besteht darin, dass das Schädelfenster und der Ringaufnehmer relativ zur Objektivlinse abgewinkelt sind. Die richtige Zentrierung (XY) und Ausrichtung (Z) der Objektivlinse mit dem Schädelfenster und dem Schallkopf stellt sicher, dass der Fokusbereich des Schallkopfes und damit die Region des behandelten Hirngewebes mit dem bildgebenden Gesichtsfeld übereinstimmt und das Risiko einer Kollision zwischen Objektivlinse und Schallkopf während der Bildgebung verringert. Die Ausrichtung kann durch Anpassen der Kopfposition des Tieres und/ oder durch Drehen des stereotaktischen Rahmens, in dem es befestigt ist, erreicht werden.
Mikroskopkomponenten (z. B. Detektoren, Strahlteiler) und Bildaufnahmeparameter sollten basierend auf dem Ziel der Studie ausgewählt werden. Hier wird eine Objektivlinse mit einer langen Brennweite (> 2 mm) verwendet, da sich die Deckgläser und der Ringaufnehmer zwischen der Objektivlinse und dem Gehirn befinden. Ein aufrecht stehendes Mikroskop wird ebenfalls empfohlen, da es mehr Platz zum Manövrieren des Tieres bietet, insbesondere für Gehirnexperimente. Um die Kinetik der Ultraschall-Mikroblasen-induzierten Leckage des intravaskulären Farbstoffs zu erfassen, ist eine hohe zeitliche Auflösung günstig, die durch die Verwendung eines Resonanz-Scanning-Systems erreicht werden kann. Die Kombination mit einem hochempfindlichen Detektionssystem wie Galliumarsenidphosphid (GaAsP) -Detektoren führt auch zu günstigeren Bildern.
Das vorgestellte experimentelle Verfahren weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens ist der chirurgische Eingriff ziemlich invasiv und es wurde berichtet, dass er eine Entzündung verursacht45, obwohl Entzündungen minimiert werden können46. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass Immunantworten, die durch Schädelfensteroperationen induziert wurden, 2-4 Wochen nach der Operation abklingen23,24,25. Darüber hinaus kann der Bohrprozess, insbesondere wenn er mit übermäßiger Kraft oder Geschwindigkeit durchgeführt wird, das darunter liegende Gewebe aufgrund der Erzeugung von Hitze, Vibration und Druck schädigen. Es wurde auch beobachtet, dass Schädelfensteroperationen und Multiphotonenbildgebung die Gehirntemperatur beeinflussen47. Diese Einschränkungen können bis zu einem gewissen Grad durch die sorgfältige Schaffung makelloser Schädelfenster, die richtige Erholung von Tieren mit chronischen Schädelfenstern und die Aufrechterhaltung der normothermen Körpertemperatur unter Verwendung einer Heizquelle mit Rückkopplungskontrolle reduziert werden. Zweitens ist die Abbildungstiefe durch das verwendete Mikroskop und die objektive Linse begrenzt. Beispielsweise kann die Wirkung der Ultraschall-Mikroblasenbehandlung in tieferen Hirnstrukturen wie dem Hippocampus nicht ohne invasivere Maßnahmen wie die Entfernung von darüber liegendem kortikalem Gewebe48 oder die Verwendung von Mikrolinsen in Verbindung mit kortikaler Penetration49 untersucht werden. Die Verwendung einer Objektivlinse mit einem langen Arbeitsabstand könnte dieses Problem bis zu einem gewissen Grad lösen, aber die Lichtdurchdringung ist auch in größeren Tiefen begrenzt.
Während die repräsentativen Bilder dieses Protokolls von Wildtyp-Nagetieren aufgenommen wurden, lässt sich das vorgestellte experimentelle Verfahren auch auf transgene Tiere und Krankheitsmodelle wie alzheimer31 anwenden. Ultraschallexperimente, die nichts mit der BBB-Modulation zu tun haben, wie z. B. ultraschallinduzierte Neuromodulation, können ebenfalls mit diesem Protokoll überwacht werden33,34. Andere mögliche Anwendungen können durch die Verwendung verschiedener Mikroskop- oder Detektoraufbauten erreicht werden, z. B. durch die Paarung eines konfokalen Mikroskops mit einer Ultrahochgeschwindigkeitskamera50. Während Photobleichen und Phototoxizität in konfokalen Mikroskopen aufgrund des großen Erregungsvolumens vergleichsweise schlechter sind, kann die Ultra-High-Speed-Bildgebung die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Kapillar-Endothelzellen und Mikroblasen des Gehirns mit hoher zeitlicher Auflösung ermöglichen, was die Mechanismen, die Ultraschall-Mikrobläschen-BBB-Behandlungen antreiben, weiter beleuchten könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das beschriebene Protokoll eine Methode zur Überwachung vaskulärer und zellulärer Effekte bietet, die durch Ultraschall-Mikroblasen-BBB-Experimente in Echtzeit induziert werden, und ein Werkzeug zur weiteren Bestimmung der Mechanismen bietet, die diese Behandlungen antreiben, sowie die nachgeschalteten Reaktionen des Hirnparenchyms auf Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen zu beleuchten.

Eine zentrale Herausforderung bei der Behandlung neurologischer Erkrankungen ist das Vorhandensein der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die BHS begrenzt den Eintritt hydrophiler, geladener, polarer und großer (> 400 Da) Moleküle in das Hirnparenchym1. Eine Methode, die derzeit verwendet wird, um Therapeutika über die BHS in das Hirnparenchym zu verabreichen, ist die Verwendung stereotaktischer intrakranieller Injektionen2. Andere weniger invasive Methoden, die untersucht werden, werden durch die Komplexität der verwendeten Techniken behindert, wie z. B. die Entwicklung von Medikamenten für die rezeptorvermittelte Verabreichung über die BHS3, oder sie sind in der räumlichen Präzision der Zielbereiche begrenzt, wie intranasale Injektionen4 oder Verabreichung hyperosmotischer Lösungen5.
Die Verwendung von Ultraschall in Verbindung mit systemisch injizierten Mikrobläschen, einem Ultraschallkontrastmittel, wurde als nichtinvasives Mittel entwickelt, um die Durchlässigkeit der BHS6 vorübergehend zu erhöhen. Durch die Verwendung eines fokussierten Wandlers7 oder einer steuerbaren phasenweisen Anordnung von Wandlern8,9 kann Ultraschall millimetergenau auf ausgewählte Bereiche des Gehirns ausgerichtet werden, wodurch Off-Target-Effekte minimiert werden. Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen können an die Anatomie des Gehirns jedes Probanden angepasst werden, indem Magnetresonanztomographie-Anleitung7,10,11,12,13,14 oder stereotaktische Rahmen15 verwendet werden. Darüber hinaus kann das Ausmaß der Erhöhung der BHS-Permeabilität in Echtzeit gesteuert werden, indem die akustischen Emissionen von Mikroblasen überwacht werden16,17,18. Klinische Studien, die die Sicherheit und Machbarkeit von Ultraschall-Mikroblasen-Behandlungen untersuchen, laufen derzeit weltweit (z. B. ClinicalTrials.gov-Kennung NCT04118764).
Ultraschall-Mikrobläschen-BBB-Behandlungen werden typischerweise bewertet, indem behandlungsinduzierte Erhöhungen der BHS-Permeabilität bestätigt, in kontrastverstärkter Magnetresonanztomographie visualisiert, oder durch Farbstoffextravasation in der In-vivo-Bildgebung oder Ex-vivo-Histologie visualisiert werden. Die meisten mikroskopischen Analysen wurden jedoch ex vivo nach Abschluss der Ultraschall-Mikroblasen-Behandlungen durchgeführt11,19, wodurch die dynamischen biologischen Reaktionen während und unmittelbar nach der Ultraschallexposition übersehen wurden. Echtzeit-Bildgebung, die während der Ultraschallexposition durchgeführt wird, kann helfen, die Mechanismen zu verstehen, die Ultraschall-Mikroblasen-BHS-Behandlungen sowie nachgelagerte Reaktionen antreiben, was unser Verständnis ihrer therapeutischen Anwendungen verbessern kann. Darüber hinaus würde die Verwendung chronischer Schädelfenster mit in vivo bildgebenden Verfahren Längsschnittstudien ermöglichen, um zeitliche Aspekte von Ultraschall-Mikroblasen-Behandlungen zu bewerten.
Ziel dieses Protokolls ist es, die chirurgischen und technischen Verfahren zu beschreiben, die für die Durchführung der Echtzeit-Multiphotonen-Bildgebung von Ultraschall-Mikroblasen-Behandlungen für akute und chronische Studien an Nagetieren erforderlich sind (Abbildung 1). Dies wird in zwei Teilen erreicht: erstens, um ein Schädelfenster zu schaffen, um in vivo Bildgebung zu ermöglichen, und zweitens, um einen Ringaufnehmer auf der Oberseite zu montieren, um gleichzeitige Beschallung und Bildgebung zu ermöglichen. Schädelfenster wurden von Neurowissenschaftlern in großem Umfang für die In-vivo-Bildgebung der neurovaskulären Kopplung20, der β-Amyloid-Pathogenese21 und der Neuroimmunologie22 verwendet. In diesem Protokoll werden chirurgische Verfahren zur Schaffung akuter (Nicht-Genesung) und chronischer (Genesung) Schädelfenster im Schädel von Maus und Ratte beschrieben. Schädelfenstermethoden, insbesondere für chronische Experimente, sind gut dokumentiert23,24,25. Um mit der vorhandenen Literatur in Einklang zu stehen, werden in diesem Protokoll die Begriffe "akut" und "chronisch" verwendet. Auch das Design von Ringaufnehmern für die In-vivo-Bildgebung wurde bereits beschrieben26. Trotz der Verfügbarkeit dieser Techniken und der Erkenntnisse, die aus der Echtzeit-Bildgebung von Ultraschall-Mikroblasen-Behandlungen gewonnen werden können, gibt es nur sehr wenige Forschungslabors, die erfolgreich Literatur mit dieser Technik veröffentlicht haben26,27,28,29,30,31,32 . Daher werden in diesem Protokoll die chirurgischen und technischen Details der Durchführung dieser Echtzeit-Ultraschall-Mikroblasen-Experimente beschrieben. Während die spezifizierten Ultraschall- und Bildgebungsparameter für BBB-Experimente optimiert wurden, können mit dieser Technik auch andere Effekte der Ultraschallexposition auf das Gehirn, wie Neuromodulation33,34, β-Amyloid-Plaque-Monitoring31 und Immunzellantworten32, untersucht werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ring transducer placement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>213-0462 or 214-1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (gel)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (13 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CB00130RA120MNT0</td>
			<td>Coverslip for ring transducer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate or microwave</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-400D</td>
			<td>To heat agarose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring transducer</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>217-0867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal preparation and drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine*A</td>
			<td>Aspen</td>
			<td>169912</td>
			<td>Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine*A</td>
			<td>Indivior</td>
			<td>521634</td>
			<td>Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine*A</td>
			<td>Indivior</td>
			<td>521634</td>
			<td>Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c..</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen*C</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>DIN 02255693</td>
			<td>Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For complete fur removal after trimming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone*C</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td>DIN 00664227, 2301</td>
			<td>Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin*C</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>DIN: 02249243</td>
			<td>Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fur clippers</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>90200714</td>
			<td>Exacta/Isis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Physitemp Instruments INC</td>
			<td>HP-1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ESDG9623C</td>
			<td>Dose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam*A</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td>25388</td>
			<td>Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam*A</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td>25388</td>
			<td>Dose rat: 1 mg/kg, s.c.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse oximeter</td>
			<td>STARR Life Sciences Corp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MouseOx.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Kopf 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile ophthalmic ointment</td>
			<td>Th&#233;a</td>
			<td>597562</td>
			<td>Viscotears.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail vein catheter (24 G)</td>
			<td>BD Neoflon</td>
			<td>391350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material and equipment for cranial window placement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton or fibreless swabs</td>
			<td>Chemtronics</td>
			<td>CX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (gel)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1594457 (gel), 230992 (liquid)</td>
			<td>If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>Jet Set-4 Denture Repair Package</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental micromotor hand drill</td>
			<td>FOREDOM</td>
			<td>K.1070-2</td>
			<td>High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10, 11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CB00050RA120MNT0 (5 mm)</td>
			<td>Mouse cranial windows.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CB00080RA120MNT0 (8 mm)</td>
			<td>Rat cranial windows.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill burrs (0.5 mm)</td>
			<td>Meisinger</td>
			<td>HM71005 (0.5 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill burrs (0.7 mm)</td>
			<td>Meisinger</td>
			<td>HM71007 (0.7 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gelatin sponge</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats / trays</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10803-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Numerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46945</td>
			<td>Recommended 10 kDa-2 MDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillator</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SliceScope microscope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 dB RF Amplifier</td>
			<td>E&#38;I</td>
			<td>2100L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matching circuit</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco Imaging</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Lantheus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Definity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>33500B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time intravital multiphoton microscopy to visualize focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine zentrale Herausforderung für die erfolgreiche Abgabe von Medikamenten an das Gehirn. Die Ultraschallexposition in Gegenwart von Mikrobläschen hat sich als wirksame Methode erwiesen, um die Permeabilität der BHS vorübergehend und lokal zu erhöhen und den para- und transzellulären Transport von Arzneimitteln über die BHS zu erleichtern. Die Abbildung des Gefäßsystems während der Ultraschall-Mikroblasenbehandlung wird wertvolle und neuartige Erkenntnisse über die Mechanismen und die Dynamik von Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen im Gehirn liefern.
Hier stellen wir ein experimentelles Verfahren für die intravitale Multiphotonenmikroskopie unter Verwendung eines Schädelfensters vor, das mit einem Ringwandler und einer 20-fachen Objektivlinse ausgerichtet ist. Dieser Aufbau ermöglicht eine Bildgebung des Gehirns mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung während Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen. Der optische Zugang zum Gehirn erfolgt über ein Schädelfenster mit offenem Schädel. Kurz gesagt, ein Stück des Schädels mit einem Durchmesser von 3-4 mm wird entfernt und der freiliegende Bereich des Gehirns mit einem Glasdeckglas versiegelt. Oben ist ein 0,82 MHz Ringaufnehmer montiert, der an einem zweiten Glasdeckglas befestigt ist. Agarose (1% w/v) wird zwischen dem Deckglas des Schallkopfes und dem Deckglas, das das Schädelfenster bedeckt, verwendet, um Luftblasen zu verhindern, die die Ultraschallausbreitung behindern. Wenn sterile chirurgische Eingriffe und entzündungshemmende Maßnahmen durchgeführt werden, können Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen und Bildgebungssitzungen wiederholt über mehrere Wochen durchgeführt werden. Fluoreszierende Dextrankonjugate werden intravenös injiziert, um das Gefäßsystem zu visualisieren und Ultraschall-Mikrobläschen-induzierte Effekte (z. B. Leckagekinetik, vaskuläre Veränderungen) zu quantifizieren. Dieses Dokument beschreibt die Platzierung des Schädelfensters, die Platzierung des Ringwandlers, das Bildgebungsverfahren, häufige Schritte zur Fehlerbehebung sowie die Vorteile und Einschränkungen der Methode.

Erfolgreiche Ultraschall-Mikroblasen-Behandlungen können durch die Extravasation von fluoreszierendem Dextran aus dem intravaskulären in den extravaskulären Raum nachgewiesen werden (Abbildung 8), was auf eine Erhöhung der BHS-Permeabilität hinweist. Je nach Druckfeld des Ringaufnehmers werden Pialgefäße und/oder Kapillaren betroffen sein.
Um die durch Ultraschall-Mikrobläschen-Behandlungen induzierten Gefäßveränderungen zu bewerten, kann der Durchmesser des interessierenden Gefäßes vor, während und nach der Ultraschall-Mikroblasenbehandlung gemessen werden (Abbildung 9). Dies kann manuell in einer kommerziell erhältlichen Software (z. B. Olympus Fluoview-Software) erfolgen. Während der Bildaufnahme können auch Bolus-Dextran-Injektionen und Zeilenscans zur Beurteilung des Blutflusses verwendet werden30,41. Um die Kinetik der Dextranleckage als repräsentatives Modell für die Wirkstoffabgabe zu bewerten, kann die Signalintensität zwischen dem intra- und extravaskulären Raum mit Werkzeugen wie MATLAB26,27,29,41 (Abbildung 10) bewertet werden.
Eine weitere Bildverarbeitung kann mit ImageJ/FIJI erreicht werden. ImageJ/FIJI ist eine Open-Source-Software, die mit MATLAB kompatibel ist und sich gut für gängige Analysen in der biologischen Bildanalyse eignet, wie z.B. die Messung von Gefäßveränderungen oder die Länge oder Entfernung zwischen fluoreszierenden Objekten (z. B. β-Amyloid-Plaques zu Blutgefäßen). In ImageJ/FIJI erstellte Bildverarbeitungspipelines können durch das Schreiben benutzerdefinierter Makros automatisiert werden.
Komplexere Analysen wie die 3D-Segmentierung von Blutgefäßen und die Zellverfolgung können mit fortschrittlicherer, halbautomatisierter Software durchgeführt werden (Abbildung 11). Nach der Segmentierung können spezifischere Analysen durchgeführt werden, z. B. die Klassifizierung von Blutgefäßen als Arteriolen, Venolen oder Kapillaren, basierend auf Durchmesser, Verzweigung, Tortuositätsmustern und Strömungsrichtung42,43. Maschinelle Lernalgorithmen wurden auch entwickelt, um die Segmentierung von Blutgefäßen zu automatisieren22,44.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4.jpg"> Abbildung 1: Allgemeiner Arbeitsablauf intravitaler Multiphotonen-Ultraschall-Mikroblasen-Hirnexperimente. Ein allgemeiner Arbeitsablauf der intravitalen Multiphotonen-Ultraschall-Mikroblasen-Hirnexperimente, die in diesem Protokoll beschrieben sind, wird gezeigt. Es gibt 6 Schritte: (A) Tierpräparat für (A1) Mäuse und (A2) Ratten, (B) Dextran-Injektion, (C) Mikroblasen-Injektion, (D) Bildgebung vor der Behandlung, (E) Behandlung und Bildgebung, (F) Bildgebung nach der Behandlung und Datenanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig02.jpg"> Abbildung 2: Querschnitt und Draufsicht der 3D-gedruckten Form. (A) Querschnitt der Form. Eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber wird auf die Oberseite des Ringaufnehmers aufgetragen und ein Deckglas wird darauf gelegt. Ein Stempel kann verwendet werden, um festen, gleichmäßigen Druck auf den Deckslip und den Ringaufnehmer auszuüben. (B) Draufsicht auf die Form. Eine Kerbe kann in der Form hinzugefügt werden, um die Entfernung des vorbereiteten Wandlers zu erleichtern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig03.jpg"> Abbildung 3: Ultraschallaufbau. Typische Hardware für Ultraschallexperimente wird gezeigt. Ultraschallparameter werden vom Signalgenerator eingestellt und ausgelöst und vom Verstärker verstärkt. Ein Leistungsmesser kann verwendet werden, um Vorwärts- und Reflexionsleistungen aufzuzeichnen, bevor das Signal an die passende Box gesendet wird, die auf den Wandler abgestimmt ist. Alle Verbindungen werden mit BNC-Kabeln hergestellt, sofern nicht anders angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig04.jpg"> Abbildung 4: Bereich der Fellentfernung und Kopfhautentfernung. (A) Die Fellentfernung sollte zwischen den Augen beginnen und sich bis zur vorderen Halshälfte erstrecken. (B) Die Entfernung der Kopfhaut sollte ausreichen, um die Parietalknochen freizulegen. Die Blutung muss gestoppt werden, bevor Sie fortfahren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig05.jpg"> Abbildung 5: Umriss des Schädelfensters. Das Schädelfenster befindet sich auf einem Parietalknochen. (A) Ein Umriss des Schädelfensters kann auf den Schädel gezeichnet werden, um den Bohrvorgang zu unterstützen. (B) Der Umriss des Schädelfensters ist nach dem Bohren durch den kompakten Knochen zu sehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig06.jpg"> Abbildung 6: Ausrichtung des Schädelfensters und des Wandlers. (A) Das Schädelfenster wird auf einem parietalen Knochen erzeugt. Die Knocheninsel wurde entfernt, wodurch das darunter liegende Gehirn freigelegt wurde. (B) Das Schädelfenster ist vollständig, wenn ein Glasdeckglas mit Cyanacrylatkleber auf den Schädel versiegelt wird. (C) Der Schallkopf wird mit dem Schädelfenster zentriert und mit Cyanacrylatkleber verklebt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig07.jpg"> Abbildung 7: Positionierung von Objektivlinse und Schallkopf. (A,B) Die Objektivlinse ist auf den Ringaufnehmer zentriert. (C) Blutgefäße, die mit fluoreszierendem Dextran gefüllt sind, sind durch die Okulare unter Epifluoreszenz sichtbar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig08.jpg"> Abbildung 8: Maximale Projektion von Multiphotonenbildern von Ultraschall-Mikrobläschen induzierten Erhöhungen der BHS-Permeabilität. Maximale Projektionsbilder von Gefäßen (A) vor und (B) nach Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen. Erfolgreiche Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen können durch beobachtung einer Erhöhung der BHS-Permeabilität nach der Behandlung bestätigt werden, die als fluoreszierende Dextran-Extravasation (Pfeile) visualisiert wird. Maßstabsleiste: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4.jpg"> Abbildung 9: Analyse der Vasomodulation, die durch Ultraschall-Mikrobläschen-Behandlungen induziert wird. Maximale Projektionsbilder von zerebralen Blutgefäßen vor, während und nach Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen. Mikroblasen sind in allen Bildern vorhanden. Im Vergleich zu (A) Vorbehandlungsbedingungen kann eine klare Vasomodulation beobachtet werden (B) während Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen (rote Pfeile). Ultraschall-Mikrobläschen-vermittelte Erhöhungen der BHS-Permeabilität sind auch nach der Behandlung durch die Leckage von fluoreszierendem Dextran aus dem intravaskulären in den extravaskulären Raum (gelbe Pfeile) offensichtlich. (C) Wenn der Ultraschall ausgeschaltet ist, kehren die Gefäßdurchmesser zu den Vorbehandlungsgrößen der Basislinie zurück. (D) Vaskuläre Veränderungen können analysiert werden, indem der Durchmesser des interessierenden Gefäßes vor, während und nach der Ultraschall-Mikroblasenbehandlung dargestellt wird. Maßstabsleiste: 100 μm. (Unveröffentlichtes Werk). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4.jpg"> Abbildung 10: Analyse der Leckagekinetik nach Ultraschall-Mikroblasen-Behandlungen. Die Erhöhung der BHS-Permeabilität wird als Leckage von fluoreszierendem Dextran aus dem intravaskulären in den extravaskulären Raum visualisiert. Veränderungen in der BBB-Permeabilität sind offensichtlich, wenn Bildstapel verglichen werden, die (A) vor und (B) nach Ultraschall-Mikrobläschen-Behandlungen aufgenommen wurden. (C) Die Leckagekinetik kann analysiert werden, indem die Intensität, das Volumen und die Geschwindigkeit von Dextran in extravaskulären Kompartimenten (gelbes Rechteck) verfolgt werden. Maßstabsleiste: 50 μm. (Unveröffentlichtes Werk.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig11.jpg"> Abbildung 11: Blutgefäßsegmentierung des XYZ-Stapels der Multiphotonenmikroskopie. (A) Tiefenstapel (XYZ) der Blutgefäße in einer transgenen EGFP-Ratte. Blutgefäße werden durch intravenöse Injektion von fluoreszierendem Texas Red 70 kDa Dextran (rot) sichtbar gemacht. Der grüne Kanal zeigt fluoreszierende Zellen und Gewebeautofluoreszenz. (B) 3D-Rekonstruktionen von Blutgefäßen werden erstellt und dann nach Blutgefäßtyp farbcodiert, um typspezifische Analysen zu ermöglichen. Venen / Venolen sind blau, Arterien / Arteriolen sind rot und Kapillaren sind cyan. Maßstabsleiste: 50 μm. Rekonstruktionen, die mit Bitplane Imaris erstellt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig11large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen und technischen Verfahren, die eine Echtzeit-In-vivo-Multiphotonen-Fluoreszenzbildgebung des Nagetiergehirns während fokussierter Ultraschall- und Mikroblasenbehandlungen ermöglichen, um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen.

Intravitale Multiphotonenmikroskopie in Echtzeit zur Visualisierung fokussierter Ultraschall- und Mikroblasenbehandlungen zur Erhöhung der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Die Ultraschallexposition in Gegenwart von Mikrobläschen hat sich als wirksame Methode erwiesen, um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke vorübergehend und lokal zu erhöhen. Normalerweise behindert die Blut-Hirn-Schranke die Abgabe potenzieller Medikamente für mehrere Hirnerkrankungen. Nach der Beschallung beginnen die injizierten Mikrobläschen zu oszillieren und induzieren eine Belastung der Gefäßwand, öffnen enge Verbindungen und lassen schließlich zu, dass Medikamente die Blut-Hirn-Schranke überwinden In präklinischen Modellen wird die Wirkung von Ultraschall und Mikroblasenbehandlung häufig durch kontrastmittelverstärkte Magnetresonanztomographie oder durch Untersuchung der Extravasation von Farbstoffen ex vivo untersucht.Der Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die Echtzeitreaktion während und unmittelbar nach der Ultraschallexposition nicht erfasst werden kann. Die intravitale Multiphotonenbildgebung des Gehirns bietet die Möglichkeit, diese Effekte in Echtzeit zu untersuchen. Im folgenden Video präsentieren wir schrittweise Anweisungen, wie man ein Schädelfenster in einer Maus platziert und eine Ultraschall-Mikroblasenbehandlung mit einem am Schädel montierten Ringwandler durchführt.Dieses Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Beschallung und in vivo Multiphotonenbildgebung. Um mit der Vorbereitung der Materialien zu beginnen, die für die Schädelfensterchirurgie und Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen benötigt werden. In diesem Video zeigen wir eine akute, nicht genesungsfreie Schädelfensteroperation.Für die chronische Genesung sind Schädelfensterchirurgie, sterilisierte Werkzeuge und Materialien, ein steriler Operationsraum und geeignete Medikamente notwendig. Vor der Operation Verabreichen Sie Anästhesie und Analgesie. Entfernen Sie das Fell auf dem Kopf.Legen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen. Führen Sie einen Katheter in die Schwanzvene für Dextran- und Mikroblaseninjektionen ein. Halten Sie die Kerntemperatur des Tieres von 37 Grad aufrecht, indem Sie eine Wärmequelle verwenden.Hier verwenden wir einen mit warmem Wasser gefüllten Handschuh. Um die Kopfhaut zu entfernen, heben Sie die Haut zwischen den Augen mit einer Pinzette an und schneiden Sie entlang der sagittalen Naht. Entfernen Sie das Periost, das die äußere Oberfläche des Schädels bedeckt, mit einem Wattestäbchen.Markieren Sie anschließend die gewünschte Position des Schädelfensters auf dem Schädel und beginnen Sie mit dem Bohren entlang des Umrisses. Um zu verhindern, dass der Schädel während des Bohrens überhitzt, tropfen Sie Kochsalzlösung mit einer Spritze auf den Schädel oder tragen Sie ein Stück chirurgischen Schwamm auf, der in Kochsalzlösung getränkt ist. Wechseln Sie zwischen Bohren und Kühlen des Schädels.Überprüfen Sie den Bohrfortschritt, indem Sie sanften Druck auf die Knocheninsel ausüben. Entfernen Sie die Knocheninsel mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn feucht gehalten wird, indem Sie ein Stück chirurgischen Schwamm verwenden, der in Kochsalzlösung vorgeakelt wurde.Um ein Schädelfenster zu platzieren, legen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf eine Seite eines Deckglases und manövrieren Sie ihn über das Loch im Schädel. Verteilen Sie eine Schicht Klebstoff um den Umfang des Deckglases, um ihn am Schädel zu befestigen. Sobald der Kleber vollständig getrocknet ist, legen Sie die Agaroselösung auf das Fenster und stellen Sie den Aufnehmer darauf.Üben Sie festen Druck aus, so dass zwischen dem Schallkopf und dem Schädelfenster nur minimale Agarose vorhanden ist. Wenn die Agarose auf eine Jell-O-ähnliche Konsistenz abgekühlt ist, schneiden Sie die überschüssige Agarose von den Umfängen des Deckglases des Schallkopfes weg. Verteilen Sie eine Schicht Klebstoff entlang der Umfänge des Deckglases des Schallkopfes, um ihn am Schädel zu befestigen.Nachdem der Kleber vollständig getrocknet ist, positionieren Sie das Tier unter der Objektivlinse des Mikroskops. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv nicht mit dem Aufnehmer oder Deckglas kollidiert. Wählen Sie ein Sichtfeld im Multiphotonenmikroskop aus.Richten Sie einen bildgebenden Scan des Gefäßsystems ein und beginnen Sie mit der Beschallung. Für dieses Protokoll verwenden wir einen Ringaufnehmer, der mit einer Fahrfrequenz von 0,82 Megahertz betrieben wird, 10-Millisekunden-Zyklen, die mechanisch indiziert sind, von 0,2 bis 0,4 und Pulswiederholfrequenzen zwischen einem und vier Hertz. Sonovue-Mikrobläschen werden in einer Dosis von einem Milliliter pro Kilogramm injiziert.Erfolgreiche Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen können durch die Extravasation von fluoreszierendem Dextran vom intravaskulären in den extravaskulären Raum nachgewiesen werden, was auf eine Erhöhung der BHS-Permeabilität hinweist. Um die Kinetik der Dextran-Leckage als repräsentatives Modell für die Wirkstoffabgabe zu bewerten, kann die Signalintensität zwischen dem intra- und extravaskulären Raum mit Tools wie MATLAB bewertet werden. Um die durch Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen induzierten Gefäßveränderungen zu bewerten, kann der Durchmesser des interessierenden Gefäßes vor, während und nach der Ultraschall-Mikroblasenbehandlung gemessen werden.Die Bildanalyse kann mitHilfe von Software wie ImageJ, FIJI oder Programmierwerkzeugen durchgeführt werden. Hier wurde Imaris zur Blutgefäßsegmentierung und -klassifizierung verwendet. Die intravitale Multiphotonenmikroskopie des Gehirns in Kombination mit Ringwandlern bietet eine Methode, um die durch die Ultraschall-Mikroblasenbehandlung induzierten Effekte in Echtzeit mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu überwachen.Quantitative und qualitative Daten können gewonnen werden, um beispielsweise die Extravasationskinetik und vaskuläre Veränderungen zu untersuchen. Die hier vorgestellte experimentelle Methode kann auf mehrere Forschungsmodelle und auf verschiedene Ultraschallanwendungen angewendet werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

Einführung in die Ultraschall-gezielte Mikroblasen Zerstörung Technik

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

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Echtzeit-Überwachung von hochintensiven fokussierten Ultraschall (HIFU) Ablation<em&gt; In-vitro-</em&gt; Canine Livers Verwendung harmonische Bewegung Imaging für fokussierten Ultraschall (HMIFU)

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In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Mikroskopie zur Echtzeitbestimmung der einzelzelligen Morphologie in Bioprozessen

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Herstellung von Nafion-beschichtet, reduziert Graphene Oxid/Polyaniline Chemiresistive Sensor Monitor pH in Echtzeit während der mikrobiellen Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Luzifergelb - Ein robuster parazellulärer Permeabilitätsmarker in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Barriere

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Eine benutzerdefinierte Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform für Live-Bildgebung von Maus-Cornea und Konjunktiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Rückstandsspezifischer Austausch von Prolin durch Prolinanaloga in fluoreszierenden Proteinen: Wie die "molekulare Chirurgie" des Rückgrats die Faltung und Stabilität beeinflusst

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...