Name: real-time intravital multiphoton microscopy to visualize focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability
Uploaded: 2022-02-05T13:00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability at JoVE.co

דיור של בעלי החיים סופק על ידי מתקן הליבה לרפואה השוואתית (CoMed, NTNU). איור 3 נוצר בשנת BioRender.com. הקלטת וידאו ועריכה נעשתה על ידי פר הנינג, מנהל אתר בפקולטה למדעי הטבע ב NTNU. הפרויקט מומן על ידי האוניברסיטה הנורבגית למדע וטכנולוגיה (NTNU, טרונדהיים, נורבגיה), מועצת המחקר של נורבגיה (RCN 262228), המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (FDN 154272), המכון הלאומי לבריאות (R01 EB003268) ויו"ר טמרטי במחקר אולטראסאונד ממוקד במרכז מדעי הבריאות סאניברוק.

צ'ריסה פון, מלינה מולנפפורדט, מאריקה אולסמן וקתרינה דה לנגה דייויס לא מצהירות על ניגודי עניינים כספיים או לא פיננסיים מתחרים. ספירוס Kotopoulis הוא עובד במשרה מלאה ובבעלותו מניות EXACT Therapeutics AS, חברה המפתחת אולטרסאונד ומיקרו-חלוק / אשכול משלוח תרופות משופר. קולרבו הינינן הוא המייסד של FUS Instruments, שממנו הוא מקבל תמיכה שאינה קשורה למחקר.

ניטור מיקרוסקופיה מולטיפוטונית תוך-וינטלית של המוח הוא כלי בעל ערך לחקר תגובות המוח במהלך חשיפה לאולטרסאונד. למיטב ידיעתנו, הפרוטוקול המתואר כאן הוא השיטה היחידה לניהול הדמיה מיקרוסקופית מולטיפוטנית של פרנשימה במוח במהלך טיפולים אולטרסאונד-microbubble. יצירת חלונות גולגולתיים ושימוש במתמרים טבעתיים מאפשרים ניטור בזמן אמת של כלי דם, תאיים ותגובות אחרות במורד הזרם לטיפולי אולטרסאונד-microbubble ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה. קבוצות אחרות ביצעו הדמיה מיקרוסקופית מולטי-פוטונית לאחר השלמת טיפולי אולטרסאונד-microbubble, ובכך חסר את התגובה בזמן אמת של פרנשימה המוח לטיפולים19. ההליך המתואר מציע שליטה זמנית משופרת, המאפשר איסוף נתונים שעשויים לסייע להאיר את המנגנונים החריפים מאחורי טיפולים אולטרסאונד-microbubble. נתונים כמותיים ואיכותיים ניתן לחלץ ולנתח מערימות התמונה שנרכשו, כגון קינטיקה extravasation27,29,30, שינויים β עמילואיד פלאק volume31, ודינמיקת תאים32.
מספר שלבים לפתרון בעיות הודגשו לאורך הפרוטוקול. ראשית, הודגשו צעדים כירורגיים רגישים במיוחד לשגיאת מפעיל, כגון שימוש באגרוז במהלך ניתוח חלון הגולגולת ומיקום המתמר. כמו כן, סופקו צעדים למניעת אי נוחות ומוות של בעלי חיים, לרבות ניטור פיזיולוגיה של בעלי חיים במהלך הניתוח, ומערבולת יסודית של ה- dextran לפני ההזרקה. שנית, מפרטים פיזיים של המתמר, ויישור העדשה האובייקטיבית, מתמר וחלון הגולגולת, הודגשו גם הם. המפרט של מתמר הטבעת ומאפייניו האקוסטיים חייב להיקבע בהתחשב בעדשה האובייקטיבית המשמשת כמו גם את מודל החיה. באופן ספציפי, הקוטר הפנימי של מתמר הטבעת חייב להיות גדול מספיק כדי להקיף את העדשה האובייקטיבית, אבל קטן מספיק כדי להיות מותקן בבטחה על הגולגולת של החיה. בנוסף, אזור המוקד של המתמר חייב ליישר קו עם טווח העדשה האובייקטיבית המשמשת.
אתגר נפוץ הוא כי החלון הגולגולתי מתמר הטבעת הם בזווית יחסית לעדשה האובייקטיבית. מיקוד נכון (XY) ויישור (Z) של העדשה האובייקטיבית עם חלון הגולגולת והמתמר מבטיחים שאזור המוקד של המתמר, וכך אזור רקמת המוח המטופלת, יתיישר עם שדה הראייה של ההדמיה, ויפחית את הסיכון להתנגשות בין העדשה האובייקטיבית לבין המתמר במהלך ההדמיה. יישור ניתן להשיג על ידי התאמת מיקום הראש של החיה ו / או על ידי סיבוב המסגרת סטריאוטקטית שבה הוא קבוע.
יש לבחור רכיבי מיקרוסקופ (למשל, גלאים, מפצלי קרן) ופרמטרים של רכישת תמונה על בסיס מטרת המחקר. כאן, עדשה אובייקטיבית עם אורך מוקד ארוך (> 2 מ"מ) משמשת בשל נוכחותם של כיסויים(ים) ומתמר טבעת הממוקם בין העדשה האובייקטיבית למוח. מיקרוסקופ זקוף מומלץ גם מכיוון שהוא מאפשר יותר מקום לתמרן את החיה, במיוחד לניסויים במוח. כדי ללכוד את הקינטיקה של אולטרסאונד-microbubble המושרה דליפה של צבע תוך כלי דם, רזולוציה זמנית גבוהה היא חיובית, אשר ניתן להשיג באמצעות מערכת סריקת תהודה. שילוב זה עם מערכת זיהוי רגישות גבוהה, כגון גלאי פוספיד ארסניד גליום (GaAsP), יביא גם תמונות חיוביות יותר.
להליך הניסיוני שהוצג יש מספר מגבלות. ראשית, ההליך הכירורגי הוא פולשני למדי, ודווח כי הוא גורם לדלקת45, אם כי ניתן למזער את הדלקת46. יתר על כן, תגובות חיסוניות הנגרמות על ידי ניתוחי חלון הגולגולת נצפו לפתור על ידי 2-4 שבועות לאחר ניתוח23,24,25. בנוסף, תהליך הקידוח, במיוחד כאשר הוא מתנהל בעוצמה או במהירות מופרזת, עלול לגרום נזק לרקמה הבסיסית עקב יצירת חום, רטט ולחץ המופעלים. ניתוחי חלונות גולגולתיים והדמיה מולטי-פוטונית נצפו גם להשפיע על טמפרטורת המוח47. מגבלות אלה ניתן להפחית במידה מסוימת באמצעות יצירה זהירה של חלונות גולגולת בתוליים, התאוששות נכונה של בעלי חיים עם חלונות גולגולת כרוניים, ותחזוקה של טמפרטורת הגוף נורמוטי באמצעות מקור חימום עם בקרת משוב. שנית, עומק ההדמיה מוגבל על ידי המיקרוסקופ והעדשה האובייקטיבית המשמשת. לדוגמה, ההשפעה של טיפול microbubble אולטרסאונד במבנים מוחיים עמוקים יותר, כגון ההיפוקמפוס, לא ניתן ללמוד ללא אמצעים פולשניים יותר, כגון הסרת רקמה קליפת המוח overlying48, או שימוש microlenses בשילוב עם חדירה קליפת המוח49. שימוש בעדשה אובייקטיבית עם מרחק עבודה ארוך יכול לפתור בעיה זו במידה מסוימת, אך חדירת אור מוגבלת גם בעומקים גדולים יותר.
בעוד התמונות המייצגות של פרוטוקול זה נרכשו מכרסמים מסוג בר, ההליך הניסיוני המוצג יכול להיות מיושם גם על בעלי חיים מהונדסים ומודלים למחלות, כגון מחלת אלצהיימר31. ניסויי אולטרסאונד שאינם קשורים אפנון BBB, כגון neuromodulation המושרה אולטרסאונד, ניתן גם לפקח באמצעות פרוטוקול זה33,34. ניתן להשיג יישומים אפשריים אחרים באמצעות הגדרות מיקרוסקופ או גלאי שונות, כגון שיוך מיקרוסקופ קונפוקלי למצלמה במהירות גבוהה במיוחד50. בעוד פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיה גרועות יחסית במיקרוסקופים קונפוקליים בשל נפח העירור הגדול, הדמיה במהירות גבוהה במיוחד עשויה לאפשר הדמיה חזותית של אינטראקציות תא-מיקרו-נבל נימי במוח עם רזולוציה זמנית גבוהה, אשר יכול להאיר עוד יותר את המנגנונים המניעים טיפולי BBB אולטרסאונד-microbubble. לסיכום, הפרוטוקול המתואר מספק שיטה לניטור השפעות כלי דם ותאיות הנגרמות על ידי ניסויי BBB אולטרסאונד-microbubble בזמן אמת, מתן כלי כדי לקבוע עוד יותר את המנגנונים המניעים טיפולים אלה, כמו גם מאיר את התגובות במורד הזרם של פרנצ'ימה המוח לטיפולים אולטרסאונד-microbubble.

אתגר מרכזי לטיפול בהפרעות נוירולוגיות הוא נוכחות מחסום הדם - מוח (BBB). ה- BBB מגביל מולקולות הידרופיליות, טעונות, קוטביות וגדולות (> 400 Da) מלהיכנס למוח parenchyma1. שיטה אחת המשמשת כיום כדי לספק טיפולית על פני BBB לתוך parenchyma המוח היא להשתמש זריקות תוך גולגולת סטריאוטקאט 2. שיטות פחות פולשניות אחרות הנחקרות מעוכבות על ידי המורכבות של הטכניקות המשמשות, כגון תכנון תרופות לאספקה בתיווך קולטן ברחבי BBB3, או מוגבלות בדיוק המרחבי של אזורים ממוקדים, כגון זריקות תוך נאוי4 או ניהול פתרונות היפרוסמוטיים5.
השימוש באולטרסאונד בשילוב עם microbubbles מוזרק באופן שיטתי, סוכן ניגוד אולטרסאונד, פותח כאמצעי לא פולשני כדי להגדיל באופן חולף את החדורות של BBB6. באמצעות מתמר ממוקד7 או מערך שלבים היגוי של מתמרים8,9, אולטרסאונד יכול להיות ממוקד לאזורים נבחרים במוח עם דיוק ברמה מילימטרית, מזעור אפקטים מחוץ למטרה. טיפולים אולטרסאונד-microbubble ניתן להתאים אישית לאנטומיה המוחית של כל נושא באמצעות הדרכת הדמיית תהודה מגנטית7,10,11,12,13,14 או מסגרות סטריאוטקסטיות15. יתר על כן, ניתן לשלוט בזמן אמת בהיקף העלייה בחדירת BBB על ידי ניטור פליטות אקוסטיות ממיקרו-טבלים16,17,18. ניסויים קליניים החוקרים את הבטיחות וההיתכנות של טיפולים אולטרסאונד-microbubble נמצאים כעת בעיצומו ברחבי העולם (למשל, מזהה ClinicalTrials.gov NCT04118764).
טיפולים BBB אולטרסאונד-microbubble מוערכים בדרך כלל על ידי אישור טיפול המושרה עליות חדורות BBB, הדמיה תהודה מגנטית משופרת בניגוד, או על ידי בזבזנות צבע בהדמיית vivo או היסתולוגיה ex vivo. עם זאת, רוב הניתוחים המיקרוסקופיים בוצעו ex vivo, לאחר השלמת טיפולים microbubble אולטרסאונד11,19, ובכך חסר את התגובות הביולוגיות הדינמיות במהלך, ומיד לאחר מכן, חשיפה אולטרסאונד. הדמיה בזמן אמת שנערכה במהלך חשיפה לאולטרסאונד עשויה לסייע בהבנת המנגנונים המניעים טיפולי BBB אולטרסאונד-microbubble כמו גם תגובות במורד הזרם, אשר עשוי להגביר את ההבנה שלנו של היישומים הטיפוליים שלה. יתר על כן, השימוש בחלונות גולגולת כרוניים עם טכניקות הדמיה in vivo יאפשר מחקרים אורך כדי להעריך היבטים זמניים של טיפולים microbubble אולטרסאונד.
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את ההליכים הכירורגיים והטכניים הנדרשים לביצוע הדמיה מולטיפוטית בזמן אמת של טיפולים באולטרסאונד-מיקרו-יבלים למחקרים חריפים וכרוניים במכרסמים (איור 1). זה מושג בשני חלקים: הראשון, כדי ליצור חלון גולגולת כדי לאפשר הדמיית vivo, ושנית, להרכיב מתמר טבעת על גבי כדי לאפשר sonication בו זמנית והדמיה. חלונות גולגולת שימשו בהרחבה על ידי מדעני מוח עבור הדמיה in vivo של צימוד נוירווסקולרי20, β עמילואיד פתוגנזה21, נוירואימונולוגיה22, בין היתר. בפרוטוקול זה, מתוארים הליכים כירורגיים ליצירת חלונות גולגולתיים חריפים (ללא התאוששות) וכרוניים (התאוששות) בעכבר ובגולגולת החולדה. מתודולוגיות חלון הגולגולת, במיוחד עבור ניסויים כרוניים, תועדו היטב23,24,25. כדי יתאים לספרות הקיימת, המונחים 'חריפה' ו'כרונית' ישמשו לאורך פרוטוקול זה. העיצוב של מתמרים טבעת עבור הדמיה in vivo תואר גם בעבר26. למרות הזמינות של טכניקות אלה והתובנות שניתן להשיג מהדמיה בזמן אמת של טיפולים אולטרסאונד-microbubble, יש מעט מאוד מעבדות מחקר שפרסמו בהצלחה ספרות באמצעות טכניקה זו26,27,28,29,30,31,32 . ככזה, בפרוטוקול זה, הפרטים הכירורגיים והטכניים של ביצוע ניסויי אולטרסאונד-microbubble בזמן אמת אלה מתוארים. בעוד הפרמטרים sonication והדמיה שצוינו כבר אופטימיזציה לניסויים BBB, השפעות אחרות של חשיפה אולטרסאונד למוח, כגון neuromodulation33,34, ניטור פלאק β עמילואיד31, ותגובות תאי החיסון32, ניתן לחקור גם באמצעות טכניקה זו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ring transducer placement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>213-0462 or 214-1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (gel)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (13 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CB00130RA120MNT0</td>
			<td>Coverslip for ring transducer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate or microwave</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-400D</td>
			<td>To heat agarose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring transducer</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>217-0867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal preparation and drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine*A</td>
			<td>Aspen</td>
			<td>169912</td>
			<td>Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine*A</td>
			<td>Indivior</td>
			<td>521634</td>
			<td>Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine*A</td>
			<td>Indivior</td>
			<td>521634</td>
			<td>Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c..</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen*C</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>DIN 02255693</td>
			<td>Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For complete fur removal after trimming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone*C</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td>DIN 00664227, 2301</td>
			<td>Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin*C</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>DIN: 02249243</td>
			<td>Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fur clippers</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>90200714</td>
			<td>Exacta/Isis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Physitemp Instruments INC</td>
			<td>HP-1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ESDG9623C</td>
			<td>Dose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam*A</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td>25388</td>
			<td>Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam*A</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td>25388</td>
			<td>Dose rat: 1 mg/kg, s.c.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse oximeter</td>
			<td>STARR Life Sciences Corp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MouseOx.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Kopf 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile ophthalmic ointment</td>
			<td>Th&#233;a</td>
			<td>597562</td>
			<td>Viscotears.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail vein catheter (24 G)</td>
			<td>BD Neoflon</td>
			<td>391350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material and equipment for cranial window placement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton or fibreless swabs</td>
			<td>Chemtronics</td>
			<td>CX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (gel)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1594457 (gel), 230992 (liquid)</td>
			<td>If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>Jet Set-4 Denture Repair Package</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental micromotor hand drill</td>
			<td>FOREDOM</td>
			<td>K.1070-2</td>
			<td>High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10, 11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CB00050RA120MNT0 (5 mm)</td>
			<td>Mouse cranial windows.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CB00080RA120MNT0 (8 mm)</td>
			<td>Rat cranial windows.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill burrs (0.5 mm)</td>
			<td>Meisinger</td>
			<td>HM71005 (0.5 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill burrs (0.7 mm)</td>
			<td>Meisinger</td>
			<td>HM71007 (0.7 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gelatin sponge</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats / trays</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10803-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Numerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46945</td>
			<td>Recommended 10 kDa-2 MDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillator</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SliceScope microscope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 dB RF Amplifier</td>
			<td>E&#38;I</td>
			<td>2100L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matching circuit</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco Imaging</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Lantheus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Definity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>33500B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time intravital multiphoton microscopy to visualize focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability

מחסום הדם - מוח (BBB) הוא אתגר מרכזי עבור משלוח מוצלח של תרופות למוח. חשיפה לאולטרה סאונד בנוכחות microbubbles הופיע כשיטה יעילה כדי להגדיל באופן חולף ומקומי את החדורות של BBB, להקל על הובלה para-ו transcellular של תרופות ברחבי BBB. הדמיית כלי הים במהלך טיפול אולטרסאונד-microbubble יספק תובנות יקרות וחדשות על המנגנונים והדינמיקה של טיפולים אולטרסאונד-microbubble במוח.
כאן, אנו מציגים הליך ניסיוני למיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית באמצעות חלון גולגולתי מיושר עם מתמר טבעת ועדשה אובייקטיבית פי 20. הגדרת זה מאפשר הדמיה ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה של המוח במהלך טיפולים אולטרסאונד-microbubble. גישה אופטית למוח מתקבלת דרך חלון גולגולת פתוח. בקצרה, חתיכה בקוטר 3-4 מ"מ של הגולגולת מוסרת, והאזור החשוף של המוח אטום עם כיסוי זכוכית. מתמר טבעת 0.82 MHz, המחובר לכיסוי זכוכית שני, מותקן למעלה. Agarose (1% w / v) משמש בין כיסוי של מתמר ואת כיסוי המכסה את החלון הגולגולתי כדי למנוע בועות אוויר, אשר לעכב התפשטות אולטרסאונד. כאשר ננקטים ניתוחים סטריליים ואמצעים אנטי דלקתיים, ניתן לבצע שוב ושוב טיפולים באולטרסאונד-מיקרו-חלוק ומפגשי הדמיה במשך מספר שבועות. מצומדים דקסטרן פלואורסצנטי מוזרקים תוך ורידי כדי לדמיין את כלי הדם ולכומת אפקטים המושרים באולטרסאונד-מיקרו-יבל (למשל, קינטיקה של דליפה, שינויים בכלי הדם). מאמר זה מתאר את מיקום חלון הגולגולת, מיקום מתמר הטבעת, הליך ההדמיה, שלבי פתרון הבעיות הנפוצים, כמו גם את היתרונות והמגבלות של השיטה.

ניתן לזהות טיפולים מוצלחים באולטרסאונד-מיקרו-חלוק על ידי ההרחבה של דקסטרן פלואורסצנטי מהרחם התוך-וסקולרי לחלל החוץ-וסקולרי (איור 8), מה שמצביע על עלייה בחדירה ל-BBB. בהתאם לשדה הלחץ של מתמר הטבעת, כלי pial ו / או נימים יושפעו.
כדי להעריך את השינויים בכלי הדם הנגרמים על ידי טיפולים אולטרסאונד-microbubble, הקוטר של כלי העניין ניתן למדוד לפני, במהלך, ואחרי טיפול microbubble אולטרסאונד (איור 9). ניתן לעשות זאת באופן ידני בתוכנה זמינה מסחרית (למשל, תוכנת אולימפוס פלווויו). במהלך רכישת תמונה, זריקות בולוס דקסטרן וסריקות קו יכול לשמש גם כדי להעריך את זרימת הדם30,41. כדי להעריך את הקינטיקה של דליפה dextran כמודל מייצג לאספקת תרופות, ניתן להעריך את עוצמת האות בין החללים התוך-וסקולריים באמצעות כלים כגון MATLAB26,27,29,41 (איור 10).
עיבוד תמונה נוסף ניתן להשיג באמצעות ImageJ / FIJI. ImageJ/FIJI היא תוכנת קוד פתוח התואמת ל- MATLAB ומתאימה היטב לביצוע ניתוחים נפוצים בניתוח תמונה ביולוגית, כגון מדידת שינויים בכלי הדם, או אורך או מרחק בין אובייקטים פלואורסצנטיים (למשל, לוחות β עמילואיד לכלי הדם). צינורות עיבוד תמונה שנוצרו ב- ImageJ/FIJI ניתנים לאוטומטיים על-ידי כתיבת פקודות מאקרו מותאמות אישית.
ניתן להשיג ניתוחים מורכבים יותר, כגון פילוח תלת-ממדי של כלי דם ומעקב אחר תאים, באמצעות תוכנה מתקדמת ואוטומטית למחצה (איור 11). לאחר פילוח, ניתוחים ספציפיים יותר יכולים להתבצע, כגון סיווג כלי הדם כמו arterioles, venules, או נימים, בהתבסס על קוטר, הסתעפות, דפוסי טורטואוזיות, כיוון זרימה42,43. אלגוריתמים של למידת מכונה פותחו גם כדי להפוך את פילוח כלי הדם לאוטומטי22,44.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4.jpg"> איור 1: זרימת עבודה כללית של ניסויים מוחיים אולטרסאונד-microbubble מולטי-ויטמין תוך-ויאטוני. זרימת עבודה כללית של ניסויי המוח המולטי-אופן המולטי-אופן-מיקרו-נבל המתוארים בפרוטוקול זה מוצגת. ישנם 6 שלבים: (א) הכנה לבעלי חיים עבור (A1) עכברים ו-(A2) חולדות, (B) הזרקת דקסטרן, (C) הזרקת Microbubble, (D) הדמיה טרום טיפול, (E) טיפול והדמיה, (F) הדמיה לאחר טיפול וניתוח נתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig02.jpg"> איור 2: חתך רוחב ותצוגה עליונה של תבנית בהדפסה תלת-ממדית. (א) חתך רוחב של התבנית. שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט מוחלת על המשטח העליון של מתמר הטבעת, וכיסוי מונח על גבי. חותמת עשויה לשמש כדי להחיל מוצק, אפילו לחץ על כיסוי מתמר טבעת. (ב) מבט עליון של התבנית. חריץ ניתן להוסיף בתבנית כדי להקל על הסרת מתמר מוכן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig03.jpg"> איור 3: הגדרת אולטראסאונד. חומרה אופיינית לניסויי אולטרסאונד מוצגים. פרמטרי אולטרסאונד מוגדרים ומופעלים על ידי מחולל האות ומוגברים על ידי המגבר. ניתן להשתמש במד כוח כדי להקליט קדימה ולשקף כוחות לפני שליחת האות לתיבה התואמת, המותאמת למתמר. כל החיבורים מושגים באמצעות כבלי BNC אלא אם צוין אחרת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig04.jpg"> איור 4: אזור הסרת הפרווה והסרת הקרקפת. (א) הסרת פרווה צריכה להתחיל בין העיניים ולהשתרע עד לחצי הצוואר. (B) הסרת הקרקפת צריכה להספיק כדי לחשוף את העצמות הקודקודיות. יש לעצור את הדימום לפני שתמשיך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig05.jpg"> איור 5: קווי המתאר של חלון הגולגולת. חלון הגולגולת ממוקם על עצם הקודקודית. (א) ניתן לצייר קו מתאר של חלון הגולגולת על הגולגולת כדי לסייע בתהליך הקידוח. (B) ניתן לראות את קווי המתאר של חלון הגולגולת לאחר קידוח דרך העצם הקומפקטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig06.jpg"> איור 6: חלון הגולגולת ויישור המתמר. (א) החלון הגולגולתי נוצר על עצם הקודקודית. אי העצמות הוסר, חושף את המוח מתחת. (B) חלון הגולגולת הושלם כאשר כיסוי זכוכית אטום על הגולגולת באמצעות דבק ציאנואקרילט. (ג) המתמר מרוכז בחלון הגולגולת ודבק באמצעות דבק ציאנואקרילט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig07.jpg"> איור 7: מיקום עדשה אובייקטיבית ומתמר. (A,B) העדשה האובייקטיבית מרוכזת במתמר הטבעת. (C) כלי דם מלאים בדקסטרן פלואורסצנטי נראים דרך העינים, תחת אפיפלואורסצנטיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig08.jpg"> איור 8: תמונות מולטי-פוטוניות הקרנה מקסימליות של אולטרסאונד-microbubble המושרה עליות חדורות BBB. תמונות הקרנה מקסימליות של כלי כלי נווה (A) לפני ו-(B) לאחר טיפולים אולטרסאונד-microbubble. טיפולים מוצלחים אולטרסאונד-microbubble ניתן לאשר על ידי התבוננות בעליות חדור BBB לאחר הטיפול, הדמיה כמו אקסטרציה dextran פלואורסצנטי (חצים). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4.jpg"> איור 9: ניתוח של vasomodulation המושרה על ידי טיפולים אולטרסאונד-microbubble. תמונות הקרנה מקסימליות של כלי דם מוחיים לפני, במהלך ואחרי טיפולים microbubble אולטרסאונד. מיקרו-יבלים נמצאים בכל התמונות. בהשוואה (A) תנאי טרום טיפול, vasomodulation ברור ניתן לראות (B) במהלך טיפולים אולטרסאונד-microbubble (חצים אדומים). עליות אולטרסאונד-microbubble בתיווך חמיצות BBB ניכרים גם בעקבות טיפול מדליפת דקסטרן פלואורסצנטי מן כלי הדם אל החלל החוץ כלי הדם (חצים צהובים). (C) כאשר אולטרסאונד כבוי, קטרי כלי הדם לחזור טרום טיפול, גדלים בסיסיים. (D) ניתן לנתח שינויים בכלי הדם על ידי התוויית הקוטר של כלי העניין לפני, במהלך ואחרי טיפול אולטרסאונד-microbubble. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר (עבודה שלא פורסמה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4.jpg"> איור 10: ניתוח של קינטיקה דליפה בעקבות טיפולים אולטרסאונד-microbubble. עלייה בחמיצות BBB הוא דמיון כמו דליפה של dextran פלואורסצנטי מן תוך כלי הדם למרחב החוץ וסקולרי. שינויים חדור BBB ניכרים בעת השוואת ערימות תמונה שנרכשו (A) לפני ו (B) לאחר טיפולים אולטרסאונד-microbubble. (C) ניתן לנתח קינטיקה של דליפה על ידי מעקב אחר העוצמה, הנפח והמהירות של דקסטרן בתאים חוץ-וסקולריים (מלבן צהוב). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר (עבודה שלא פורסמה.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig11.jpg"> איור 11: פילוח כלי הדם של ערימת XYZ מיקרוסקופית מולטי-פוטונית. (A) ערימת עומק (XYZ) של כלי דם בחולדה מהונדסת EGFP. כלי הדם דמיינו באמצעות הזרקה תוך ורידי של פלורסנט טקסס אדום 70 kDa dextran (אדום). הערוץ הירוק מראה תאים פלואורסצנטיים ופלואורספלציה של רקמות. (B) שחזורים תלת-ממדיים של כלי הדם נוצרים, ולאחר מכן מקודדים בצבע בהתאם לסוג כלי הדם כדי להקל על ניתוחים ספציפיים לסוג. ורידים/venules הם כחולים, עורקים / arterioles הם אדומים, נימים הם ציאן. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. שחזורים שנוצרו באמצעות ביטפלן אימריס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability at JoVE.co

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים הניתוחיים והטכניים המאפשרים הדמיית פלואורסצנטיות מולטי-פוטונית בזמן אמת של מוח המכרסמים במהלך טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חמיצוץ מחסום הדם - מוח.

מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית בזמן אמת להדמיית טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חדחול מחסום הדם-מוח

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

חשיפה לאולטרה סאונד בנוכחות microbubbles הופיע כשיטה יעילה כדי להגביר באופן חולף ומקומי את החדורות של מחסום הדם - מוח. בדרך כלל מחסום הדם - מוח פוגע באספקת תרופות פוטנציאליות למספר מחלות מוח. עם sonication, microbubbles מוזרק להתחיל תנודה לגרום מתח על קיר כלי הדם, פתיחת צמתים הדוקים ובסופו של דבר לאפשר תרופות לחצות את מחסום הדם - מוח במודלים פרה קליניים, ההשפעה של אולטרסאונד וטיפול microbubble נחקרים לעתים קרובות על ידי הדמיית תהודה מגנטית משופרת בניגוד או על ידי לימוד אקסטרופורמציה של צבעים ex vivo.החיסרון של גישה זו הוא כי התגובה בזמן אמת במהלך ומיד לאחר חשיפה אולטרסאונד לא ניתן לרכוש. הדמיה מולטיפוטית תוך-ויאלית של המוח נותנת הזדמנות לחקור את ההשפעות האלה בזמן אמת. בסרטון הבא, נציג הוראות צעד על איך למקם חלון גולגולת בעכבר ולבצע טיפול microbubble אולטרסאונד באמצעות מתמר טבעת רכוב על הגולגולת.הליך זה מאפשר sonication בו זמנית והדמיה מולטיפוטונית ויוו. כדי להתחיל להכין את החומרים הדרושים לניתוח חלון הגולגולת וטיפולי microbubble אולטרסאונד. בסרטון זה, אנו מראים ניתוח חלון גולגולתי חריף שאינו מחלים.לצורך ניתוח גולגולתי התאוששות כרונית, כלים וחומרים מעוקרים, יש צורך במרחב כירורגי סטרילי ותרופות מתאימות. לפני הניתוח ניתן לבצע הרדמה ומנשך. הסר את הפרווה על הראש.מניחים את החיה במסגרת סטריאוטקסית. הכנס קטטר לתוך וריד הזנב עבור זריקות dextran ו microbubble. שמור על טמפרטורת הליבה של החיה של 37 מעלות באמצעות מקור חום.הנה אנחנו משתמשים בכפפה מלאה במים חמים. כדי להסיר את הקרקפת, להרים את העור בין העיניים באמצעות מלקחיים לחתוך לאורך התפר הקשת. הסר את periosteum המכסה את פני השטח החיצוניים של הגולגולת עם צמר גפן.לאחר מכן לסמן את המיקום הרצוי של חלון הגולגולת על הגולגולת ולהתחיל לקדוח לאורך קווי המתאר. כדי למנוע מהגולגולת להתחמם יתר על המידה במהלך הקידוח, טפטפו תמיסת מלח על הגולגולת באמצעות מזרק או החל פיסת ספוג כירורגי ספוג מלוח. לסירוגין בין קידוח וקירור הגולגולת.בדוק את התקדמות הקידוח על ידי הפעלת לחץ עדין על אי העצמות. הסר את אי העצם באמצעות זוג מלקחיים. ודא כי המוח נשמר לח באמצעות חתיכת ספוג כירורגי כי כבר presoaked מלוחים.כדי למקם חלון גולגולתי, מניחים טיפת תמיסת מלח על צד אחד של כיסוי ולתמרן אותו מעל החור בגולגולת. מורחים שכבה של דבק סביב היקף כיסוי כדי לחבר אותו לגולגולת. ברגע שהדבק יבש לחלוטין, להפקיד את פתרון agarose על החלון ומניחים את המתמר על גבי.תפעיל לחץ מוצק כך שיש מזערי אגרוז בין המתמר לחלון הגולגולת. כאשר האגורוז התקרר לעקביות דמוית ג'לי, חתוך את האגזרה העודפת מהיקף כיסוי המתמר. מורחים שכבה של דבק לאורך היקף כיסוי המתמר כדי לדבוק בגולגולת.לאחר שהדבק התייבש לחלוטין, מקם את החיה מתחת לעדשה האובייקטיבית של המיקרוסקופ. ודא שהמטרה אינה מתנגשת עם המתמר או כיסוי. בחר שדה תצוגה במיקרוסקופ המולטי-פוטוני.תארגן סריקת הדמיה של כלי היתווה ותתחיל בסוניקציה. עבור פרוטוקול זה, אנו משתמשים במתמר טבעת המופעל בתדר נהיגה של 0.82 מגה-הרץ, מחזורים של 10 אלפיות השנייה באינדקס מכני של 0.2 עד 0.4, ותדרי חזרה על פעימות בין אחד לארבעה הרץ. מזון מיני-נובואה מוזרק במינון של מיליליטר אחד לק"ג.טיפולים מוצלחים microbubble אולטרסאונד ניתן לזהות על ידי ראוותנות של dextran פלואורסצנטי מן כלי הדם פנימה למרחב החוץ וסקולרי, המציין עלייה חדור BBB. כדי להעריך קינטיקה של דליפה dextran כמודל מייצג עבור אספקת סמים, עוצמת האות בין החללים הפנים-וסקולריים ניתן להעריך באמצעות כלים כגון MATLAB. כדי להעריך את השינויים בכלי הדם המושרה על ידי טיפולים microbubble אולטרסאונד, הקוטר של כלי העניין ניתן למדוד לפני, במהלך, ואחרי טיפול microbubble אולטרסאונד.ניתן לבצע ניתוח תמונה באמצעות תוכנה כגון ImageJ, FIJI או כלי תיכנות. כאן Imaris שימש פילוח כלי דם וסיווג. מיקרוסקופיה מולטיפוטונית תוך-וינטלית של המוח בשילוב עם מתמרים טבעת לספק שיטה כדי לפקח על ההשפעות הנגרמות על ידי טיפול microbubble אולטרסאונד בזמן אמת ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.נתונים כמותיים ואיכותיים ניתן להשיג ללמוד, למשל, קינטיקה חוצנית ושינויים בכלי הדם. השיטה הניסיונית המוצגת כאן ניתן ליישם על מספר מודלים מחקריים ליישומי אולטרסאונד שונים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

מבוא טכניקת ממוקד אולטראסאונד הרס microbubble

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

ניטור של עצימות גבוהות בזמן אמת אולטרסאונד ממוקד (HIFU) אבלציה של<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדי כלבי שימוש הרמוני Motion הדמיה לאולטראסאונד הממוקד (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

במבחנה חלחול של FITC טעון Ferritins מעבר מכשול עכברוש דם-מוח: מודל לחקר משלוח מולקולות Nanoformulated

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

באתרו מיקרוסקופיה לקביעת בזמן אמת של מורפולוגיה תא חד בBioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

ייצור מצופים Nafion, מופחתת גראפן תחמוצת/Polyaniline Chemiresistive חיישן על צג ה-pH בזמן אמת במהלך התסיסה מיקרוביאלי

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

לוציפר צהוב-מרקר חזק הקרנף מסמן במודל תא של מכשול הדם האנושי-מוח

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

פלטפורמת מיקרוסקופי מרובה-פוטונים מותאמת אישית להדמיה חיה של קרנית עכבר ולחמית

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

חילופי פרולין ספציפיים לשאריות על ידי אנלוגים פרולין בחלבונים פלואורסצנטיים: כיצד "ניתוח מולקולרי" של עמוד השדרה משפיע על קיפול ויציבות

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...