Name: real-time intravital multiphoton microscopy to visualize focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability
Uploaded: 2022-02-05T13:00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability at JoVE.co

동물의 주거는 비교 의학 코어 시설 (CoMed, NTNU)에 의해 제공되었다. 그림 3은 BioRender.com 만들어졌습니다. 비디오 녹화 및 편집은 NTNU자연과학학부의 웹마스터인 Per Henning에 의해 이루어졌습니다. 이 프로젝트는 노르웨이 과학 기술 대학 (NTNU, Trondheim, 노르웨이), 노르웨이 연구 위원회 (RCN 262228), 캐나다 보건 연구소 (FDN 154272), 국립 보건 원 (R01 EB003268), 서니 브룩 건강 과학 센터의 집중 초음파 연구의 테메르티 의자에 의해 투자되었다.

노르웨이 식품 안전 당국, 서니브룩 연구소 동물 관리 위원회 및 캐나다 동물 관리 위원회에 따라 다음과 같은 모든 실험 절차가 승인되고 수행되었습니다.
1. 재료 준비
<ol><li>두개골 창 수술 및 초음파 마이크로 버블 치료에 필요한 재료를 준비하십시오. 만성 두개골 창의 경우 살균 도구 및 재료, 멸균 수술 공간 및 수술 전 및 수술 후 약물 투여가 필요합니다23,24,25.</li>
	<li>트랜스듀서 및 커버슬립 준비<ol>
<li>트랜스듀서의 물리적 무결성을 확인합니다: 균열과 찌그러짐을 찾습니다. 트랜스듀서의 상단과 측면의 전극이 그대로 유지되었는지 확인합니다.</li>
		<li>시아노아크라일트 접착제를 작은 접시에 넣습니다. 어플리케이터를 사용하여 얇은 접착제 층을 트랜스듀서 표면에 퍼감음으로 보입니다.</li>
		<li>트랜스듀서를 유리 커버슬립에 놓습니다. 20-30 s를 단단히 누릅니다. 참고: 3D 프팅 금형을 사용하여 유리 커버슬립을 링 트랜스듀서와 정렬하여 커버슬립 및 링 트랜스듀서에 단단하고 균일한 압력을 보장할 수 있습니다(그림 2).</li>
		<li>트랜스듀서와 커버슬립 사이의 거품을 확인합니다. 거품이있는 경우, 공기가 초음파 전파를 방해로, 커버 슬립을 벗고 단계 1.2.3.에서 반복. 실온에서 하룻밤 동안 치료하십시오.</li>
		<li>유리 커버슬립을 부착하면 트랜스듀서와 일치합니다(그림 3). 참고: 이 프로토콜은 사내 제조 된 리드 지르코네이트 티타네이트 링 트랜스듀서 (10mm 외부 직경, 1.4mm 두께, 1.2mm 높이)35를 사용하여 50 Ω 임피던스 및 0 ° 위상 부하와 사용자 정의 일치 회로를 사용합니다. 트랜스듀서는 두께 모드에서 0.82MHz로 구동되어 커버슬립 아래에 약 1mm 의 원형 초점 지점을 생성합니다. 유사한 특성의 링 트랜스듀서(외경 10mm, 두께 1.5mm, 높이 1.1mm)를 특징으로 하며 다광광 현미경 실험27,28,29,31,32,36에 광범위하게 사용된다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>트랜스듀서 재사용 및 커버슬립 교체<ol>
<li>금이 가거나 이전 실험에서 파편(예: 모피, 접착제)이 있는 경우 커버슬립을 교체하십시오. 커버슬립을 제거하려면 아세톤에 트랜스듀서와 커버슬립을 20분 동안 잠수하여 접착제를 녹입니다. 참고: 아세톤은 트랜스듀서 및/또는 전극의 무결성에 영향을 줄 수 있습니다. 이 단계를 진행하기 전에 제조업체에 문의하십시오.</li>
		<li>아세톤이 집게로 커버슬립을 부드럽게 당겨 접착제를 녹인지 확인합니다. 아세톤 노출이 길어지않도록 10분마다 한 번 확인하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 동물 준비
<ol><li>유도 챔버에서 의료 공기, 산소 및 이소플루란을 혼합하여 동물을 마취시합니다. 참고: 운반체 가스로서의 산소 사용은 마이크로버블의 반감기에 영향을 미치는 것으로 보고되어 37,38로 BBB 투과성에서 유도된 초음파-마이크로버블 유도 증가의 크기를 감소시키지만 저산소증 및 사망률의 위험을 감소시킬 수도 있다39. 프로젝트 목표와 수의사의 조언에 따라 캐리어 가스를 선택합니다. 케타민/자일라진 칵테일과 같은 주사용 마취제도 사용될 수 있습니다. 그러나 흡입 성 마취및 혈액 산소 수준의 비행기를 조절하는 것이 더 쉽습니다.</li>
	<li>동물이 발가락 핀치를 수행하여 마취의 충분한 평면을 달성했는지 확인하십시오. 동물의 무게를 측정하기 위해 dextran의 복용량을 결정, 마이크로 거품, 및 관리 하는 약물. 동물의 머리에서 털을 제거하고 동물을 스테레오전술 프레임에 놓습니다.</li>
	<li>급성 실험의 경우, 디엑스트라안 및 마이크로버블 주사를 위해 전신 순환에 대한 접근이 확립되어야 합니다. 이를 위해 27g 카테터를 꼬리 정맥에 삽입합니다. 참고: 복고풍 궤도 주사도 가능하지만, 다광 화상 진찰 중 헤드 영역의 제한된 작업 공간으로 인해 꼬리 정맥이 권장됩니다.</li>
	<li>동물을 스테레오테틱 프레임으로 옮기고 마취를 코 콘으로 전환합니다. 가열 패드 또는 따뜻한 물로 채워진 장갑과 같은 열원을 사용하여 37 °C의 동물의 핵심 온도를 유지합니다.</li>
	<li>맥박 산소계를 이용하여 직장 프로브 및 동물 생리학을 사용하여 동물 온도를 모니터링합니다. 안과 연고를 바치다. 적절한 수술 전 진통제 및/또는 항염증제를 주입 하십시오(재료 표 참조).</li>
	<li>두개골 창 수술을 시작하기 전에 마취 의 비행기와 동물의 심박수, O2 포화, 호흡 속도 및 온도를 확인하십시오.</li>
	<li>두개골 창 수술을 시작하려면 탈모 크림을 바르거나 모피 클리퍼를 사용하여 머리에 털을 제거하십시오. 눈 사이의 털을 목의 앞쪽 절반으로 제거합니다(그림 4A). 참고 : 탈모 크림과의 장기간 접촉은 피부를 구울 것입니다. 만성 두개골 창 수술의 경우, 베타딘의 번갈아 닦아 두피를 씻고 모피 제거 후 70 % EtOH. 멸균 수술을 위한 수술 공간을 준비하십시오. 불임은 2.15단계까지 유지되어야 합니다.</li>
	<li>두피를 제거하려면, 비 지배적 인 손에 개최 집게를 사용하여 눈 사이에 피부를 들어 올려, 처진 봉합사를 따라. 곡선 가위를 사용하여 피부를 제거하여 정수리 뼈를 노출시니다(그림 4B). 두개골이나 두피에서 출혈이 있는 경우 면 봉봉으로 단단한 압력을 가하십시오. 출혈은 다음 단계로 진행하기 전에 중지해야합니다. 참고: 급성 수술의 경우, 피부를 밀어 내고 액체 시아노아크라일레이트 접착제 또는 조직 접착제를 사용하여 두개골에 부착할 수 있습니다.</li>
	<li>면봉을 사용하여 두개골의 바깥쪽 표면을 덮는 음골을 제거합니다.</li>
	<li>작동 현미경(6-25x)과 치과 드릴(0.5mm 드릴 버, 중간 속도)을 사용하여 정수리 뼈에 원을 윤곽을 잡아 두개골에 있는 두개골 창의 원하는 위치를 표시합니다(그림 5). 이 지역은 얇고 큰 혈관을 오버레이하기 때문에 처진 봉합사, 람다 및 bregma를 피하십시오. 참고: 드릴링을 용이하게 하기 위해 마커와 스텐실(그림 5A)을 사용하여 두개골에 두개골 창의 윤곽선을 그릴 수 있습니다. 쥐의 경우 원형, 두개골 창 대신 직사각형을 드릴링하는 것이 더 쉬울 수 있습니다. 쥐 두개골 뼈의 두께로 인해 0.7mm 드릴 비트를 사용하여 0.5mm 드릴 비트를 사용하여 드릴링을 완료하기 전에 컴팩트 한 뼈의 두개골 창을 윤곽을 잡을 수 있습니다.</li>
	<li>드릴 비트로 부드러운 압력을 가하십시오. 과도한 압력은 뇌 조직에 손상을 일으킬 위험을 증가시킵니다. 드릴링 중에 두개골이 과열되는 것을 방지하기 위해 주사기를 사용하여 두개골에 식염수를 떨어 뜨리거나 식염수에 담근 외과 스폰지 조각을 적용하십시오.</li>
	<li>두개골의 나머지 부분과 뼈 섬이 분리 될 때까지 두개골을 드릴링하고 냉각하는 것을 번갈아 가십시오. 집게 나 드릴 비트를 사용하여 뼈 섬에 부드러운 압력을 가하여 드릴링 진행 상황을 확인하십시오. 뼈 섬이 두개골의 나머지 부분과 분리 될 때까지 드릴링을 계속합니다. 참고 : 두개골의 가장 얇은 영역에 작은 균열은 드릴링이 거의 완료된 좋은 표시입니다. 뼈 섬을 조기에 제거하려고하면 뼈 조각이 뇌 조직으로 침투하여 두라를 손상시키고 염증과 출혈을 일으킬 수 있습니다.</li>
	<li>뼈 섬의 가장자리 또는 상부 소형 뼈 층을 파악하기 위해 미세 한 집게 쌍을 사용하여 뼈 섬을 제거합니다 (그림 6A). 식염수에 미리 담근 외과 스폰지 조각을 적용하여 뇌가 촉촉하게 유지되도록하십시오. 출혈이 관찰되면 출혈부위에 수술용 스폰지를 놓습니다. 출혈이 멈출 때까지 다음 단계로 진행하지 마십시오. 참고: 출혈이 5분 후에 지속되는 경우, 동물은 다광 화상 진찰 실험에 사용할 수 없습니다. 쥐의 경우, 두껍으면 두라를 제거해야 할 수도 있습니다. 두라를 제거하려면 작동 현미경과 미세 집게 쌍에 높은 배율을 사용하십시오.</li>
	<li>두개골 창을 놓기 위해, 집게 한 켤레와 유리 커버 슬립을 데리러, 한쪽에 식염수 한 방울을 배치하고, 두개골의 구멍을 통해 기동. 커버슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 참고: 쥐의 경우 5mm 유리 커버슬립과 쥐의 경우 8mm를 사용하십시오. 쥐의 경우, 두개골 뼈의 두께로 인해, 커버 슬립과 뇌 사이의 공간을 채우기 위해 식염수 대신 아가로즈 용액을 사용합니다. 트랜스듀서와 커버슬립은 두개골 창에 별도의 커버슬립을 사용하는 대신 두개골에 직접 부착할 수도 있습니다. 이 옵션을 보려면 3.1 단계로 진행합니다. 자세한 내용은 그림 1 을 참조하십시오.</li>
	<li>두개골에 부착하기 위해 커버슬립(그림 6B)의 둘레에 시아노아크라일트 접착제층을 펴보시다. 커버슬립 아래에 접착제가 없는지 확인합니다. 접착제가 뇌와 접촉하지 않도록 커버 슬립에 압력을 가하십시오.</li>
	<li>접착제가 완전히 건조되면 치과 드릴을 사용하여 접착제표면을 꺼낼 수 있습니다. 모든 접착제 파편이 수술 부위에서 제거되었는지 확인합니다. 참고: 만성 두개골 창의 경우 필요한 수술 후 약물(재료 표 참조)을 주입하고 상처 관리 및 부드러운 식품에 대한 연고를 제공하고 열램프 아래에서 동물을 복구하십시오.</li>
</ol>3. 링 트랜스듀서 배치
<ol><li>1% (w/v) 아가로즈 솔루션을 준비합니다. 작은 비커 또는 에렌마이어 플라스크에서 아가로즈 0.1 g와 PBS(1x) 또는 식염수10mL을 추가합니다. 비커를 핫플레이트에 놓거나 전자레인지(30-45s)에 용액을 가열하여 아가로즈가 완전히 용해될 때까지 용액을 끓입니다.</li>
	<li>단계 3.2-3.5는 아가로즈 솔루션이 빠르게 냉각됨에 따라 시간에 민감합니다. 1 mL 주사기로 아가로즈의 0.5 mL을 인출하십시오. 참고: 뇌의 무결성을 보호하기 위해 아가로즈의 온도가 사용하기 전에 체온에 근접하도록 하십시오.</li>
	<li>아가로즈를 두개골 창의 덮개 슬립에 자유롭게 보관하십시오. 참고 : 조직이 희미해지면 아가로즈의 온도가 너무 높았습니다. 동물은 안락사되어야 합니다. 뇌를 덮는 별도의 커버슬립이 없는 경우(즉, 트랜스듀서와 그 커버슬립은 뇌에 직접 배치되고, 단계 2.14참조), 아가로즈는 이 단계에서 뇌의 표면에 증착되어야 합니다.</li>
	<li>트랜스듀서를 두개골 창 위에 놓습니다(그림 6C). 트랜스듀서와 두개골 창 사이에 최소한의 아가로즈가 있도록 단단한 압력을 가하십시오. 트랜스듀서가 두개골 창에 중심(XY-평면) 및 병렬(Z-평면)이고 아가로즈에 기포가 없는지 확인합니다.</li>
	<li>아가로즈가 젤로와 같은 일관성으로 냉각되면 주걱이나 메스를 사용하여 트랜스듀서의 표지 슬립 둘레에서 과도한 아가로즈를 잘라냅니다. 트랜스듀서의 커버슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다.</li>
	<li>주걱을 사용하여 트랜스듀서의 표지 슬립 둘레에 시아노아크라일트 접착제층을 확산하여 두개골로 확장하여 트랜스듀서가 두개골에 단단히 부착됩니다.</li>
	<li>접착제가 완전히 건조 될 때까지 트랜스 듀서에 대한 단단한 압력을 유지 (10-15 분).</li>
</ol>4. 다광현미경 영상
<ol><li>동물을 객관적인 렌즈 아래에 배치합니다(그림 7A). 객관적인 렌즈가 링 트랜스듀서에 중심이 되고 트랜스듀서와 평행하게 되어 있는지 확인합니다(그림 7B). 물에 침지하는 객관적인 렌즈를 사용하는 경우 링 트랜스듀서의 중앙을 탈온화 및 탈가스로 채웁니다. 참고 : 탈기 물은 적절한 초음파 전파에 중요합니다.</li>
	<li>목표 렌즈로 가장 높은 위치에서 시작한 다음 링 트랜스듀서 내에 들어질 때까지 목표 렌즈를 천천히 낮춥니다(그림 7A, B). 객관적인 렌즈가 트랜스듀서 또는 커버슬립과 충돌하지 않도록 합니다. 참고: 접안 렌즈를 번갈아 사용하여 목표 렌즈의 Z 위치가 뇌 표면과 평면에 있는지 확인하고, 눈으로는 객관적인 렌즈가 트랜스듀서 또는 커버슬립과 충돌하지 않도록 합니다. 꼬리 정맥을 통해 형광 드엑스트라넨을 주입 한 다음 접피스를 통해 피알 혈관을 시각화하는 것이 더 쉬울 수 있습니다 (도 7C).</li>
	<li>이미징을 위해 다광현미경을 준비합니다. 참고: 이 프로토콜은 직립 다광자 현미경과 20-25x 의 작업 거리를 가지는 20-25x 목표 렌즈를 사용하여 커버슬립(들)을 넘어 뇌 의 parenchyma에 집중하기에 충분합니다.</li>
	<li>덱센을 준비한다. 제조업체의 지침에 따라 적절한 양의 PBS를 dextran 바이알에 추가합니다. 1-3분 동안 도스엑스트라낸 용액을 소용돌이어 도포 파우더가 완전히 용해되도록 합니다. 꼬리 정맥에 덱스네 용액을 주입합니다.</li>
	<li>이미지 스캔 설정<ol>
<li>아이피스를 사용하여 객관적인 렌즈가 뇌와 평행하게 되어 있는지 확인합니다. XZ 및 YZ 정렬 불량에 대 한 수정 하는 동물을 기울인다.</li>
		<li>다광현미경에서 시야를 선택합니다. 초음파 노출 전에 혈관의 기준선 이미지를 갖기 전에 XYZ 스캔을 설정합니다. 참고: 일반적인 이미징 매개 변수는 다음과 같습니다: 깊이 300-800 μm, 2-5 μm 스텝 사이즈 및 10-20 시간 스택. 객관적인 렌즈가 이미징 시퀀스 중 가장 낮은 지점에서 트랜스듀서 또는 커버슬립과 접촉하지 않도록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 초음파 노출
<ol><li>모든 BNC 케이블이 올바르게 연결되어 있는지 확인합니다(그림 3).</li>
	<li>초음파 마이크로 버블 치료 전, 도중 및 후에 이미지 스택을 캡처할 수 있을 만큼 충분히 긴 XYZT 이미지 스캔을 설정합니다.</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 마이크로 버블을 준비합니다. 꼬리 정맥에 마이크로 버블을 주입하고 이미징을 시작합니다. 참고: 마이크로버블 주사는 일관된 주입 속도를 보장하고 동시 마이크로 버블 주입 및 이미징을 가능하게 하기 위해 주입 펌프로 수행될 수 있습니다. 이미징 중에 마이크로 버블을 주입해야 하는 경우 검출기를 주변 광에 노출하지 않고도 꼬리 정맥에 쉽게 접근할 수 있는지 확인합니다.</li>
	<li>초음파 처리를 시작합니다. 참고: 일반적인 초음파 처리 매개 변수는 다음과 같습니다 : 10 ms 주기, 0.2-0.4의 기계 지수, 1-4 Hz 사이의 펄스 반복 주파수. 초음파 및 전임상 초음파 마이크로 버블 연구에 사용되는 마이크로 버블 파라미터는 광범위하게 연구되었으며 문헌에 잘 문서화되어 있습니다 (예 : 검토에 대한 40 참조).</li>
	<li>초음파 처리 기간 동안 및 초음파 처리의 끝 에 따라 다광 이미징을 계속합니다. 혈관에서 dextran 사치에 대 한 관찰, 이것은 BBB 투과성에 있는 증가 의 표시. 참고: 외삽 공간에서 dextran이 감지되지만 시야 주변에서 볼 수 있는 경우 시야 외부의 혈관에 영향을 받을 수 있습니다. 이는 객관적인 렌즈의 초점과 트랜스듀서의 정렬 불량으로 인해 발생할 수 있습니다. 이 시나리오에서는, 변환기를 재정렬하는 것보다 객관적인 렌즈를 이동하거나 동물을 재배치하여 시야를 조정하는 것이 더 쉽습니다.</li>
	<li>이미징이 완료되면 깊은 마취 또는 CO2 질식 하에서 동물 자궁 경부 탈구를 안락사시하십시오. 만성 두개골 창의 경우, 노출 된 두개골에 치과 시멘트층을 확산. 참고 : 만성 두개골 창의 경우 2.8 단계에서 두피를 제거하기 때문에 필요한 것은 아니지만 창을 둘러싼 피부를 봉합 할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 이미지 분석
<ol><li>이미지 스택을 내보냅니다.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어(예: 올림푸스 플루오뷰, ImageJ/FIJI, 비트플레인 아이마리스, 써피피셔 과학 아미라) 및/또는 프로그래밍 도구(예: 파이썬, MATLAB)로 이미지를 분석합니다.</li>
</ol>

샤리사 푼, 멜리나 뮐렌프포드, 마리케 올스만, 카타리나 데 랭데이비스는 재정적, 비금융 경쟁적 이해상충을 선언하지 않는다. 스피로스 코토풀리스는 전임 직원이며 초음파 및 마이크로 버블/클러스터 강화 약물 전달을 개발하는 회사인 EXACT Therapeutics AS의 주식을 소유하고 있습니다. 쿨러보 하이니넨은 FUS 인스트루먼트의 창립자로 비연구 관련 지원을 받고 있습니다.

뇌의 인트라바이탈 다광자 현미경 모니터링은 초음파 노출 시 뇌 반응을 연구하는 귀중한 도구입니다. 우리의 지식에, 여기에서 기술된 프로토콜은 초음파 마이크로 버블 처리 도중 두뇌 parenchyma의 다중 광자 현미경 검사기 화상 진찰을 전하는 유일한 방법입니다. 두개골 창의 생성과 링 트랜스듀서의 사용은 높은 공간 및 시간적 해상도에서 초음파 마이크로 버블 치료에 대한 혈관, 세포 및 기타 다운스트림 반응의 실시간 모니터링을 허용합니다. 다른 그룹은 초음파 마이크로 버블 치료의 완료 후 다광 현미경 이미징을 수행하여 치료에 대한 뇌 의 parenchyma의 실시간 반응을 누락19. 설명된 절차는 향상된 측두제어를 제안하여 초음파 마이크로버블 치료 의 뒤에 있는 급성 기전장치를 밝히는 데 도움이 될 수 있는 데이터의 수집을 허용합니다. 정량적 및 질적 데이터는 사치 운동 27,29,30, β 아밀로이드 플라크 볼륨31 및 셀 역학의 변화와 같은 획득 된 이미지 스택에서 추출 및 분석 될 수 있습니다.
프로토콜 전체에서 몇 가지 문제 해결 단계가 강조 표시되었습니다. 첫째, 특히 작업자 오류에 취약한 수술 단계가 강조되었다, 두개골 창 수술 중 아가로즈의 사용 과 트랜스 듀서의 배치. 또한 수술 중 동물 생리학을 모니터링하고 주사 전에 덱스텝을 철저히 소용돌이시키는 등 동물의 불편함과 사망을 예방하는 조치도 제공되었다. 둘째, 트랜스듀서의 물리적 사양, 및 객관적인 렌즈, 트랜스듀서 및 두개골 창의 정렬도 강조되었다. 링 트랜스듀서와 음향 특성의 사양은 동물 모델뿐만 아니라 사용되는 객관적인 렌즈를 고려하여 결정되어야 합니다. 특히, 링 트랜스듀서의 내경은 객관적인 렌즈를 둘러싸기에 충분히 커야 하지만 동물의 두개골에 단단히 장착할 수 있을 만큼 작아야 합니다. 또한 트랜스듀서의 초점 영역은 사용되는 객관적인 렌즈의 범위에 맞추어야 합니다.
일반적인 과제는 두개골 창과 링 트랜스듀서가 객관적인 렌즈에 비해 기울어져 있다는 것입니다. 두개골 창 및 트랜스듀서를 가진 객관적인 렌즈의 적절한 센터링(XY) 및 정렬(Z)은 트랜스듀서의 초점 영역과 따라서 치료된 뇌 조직의 영역이 이미징 시야와 일치하며, 이미징 중 객관적인 렌즈와 트랜스듀서 간의 충돌 위험을 감소시킨다. 정렬은 동물의 헤드 위치를 조정하고 고정된 스테레오전술 프레임을 회전하여 달성될 수 있다.
현미경 구성 요소(예: 검출기, 빔 스플리터) 및 이미지 획득 매개변수는 연구의 목적에 따라 선택되어야 합니다. 여기서, 긴 초점 길이(> 2mm)를 가진 객관적인 렌즈는 객관적인 렌즈와 두뇌 사이에 있는 커버슬립(들)과 링 트랜스듀서의 존재로 인해 사용된다. 수직 현미경은 특히 뇌 실험을 위해 동물을 기동할 수 있는 더 많은 공간을 허용하므로 권장됩니다. 내트라바스-미세버블 유도 누설의 운동을 포착하기 위해, 공진스닝 시스템을 이용하여 얻을 수 있는 높은 측두성 분해능이 유리하다. 이를 갈륨 아르세니드 인스피데(GaAsP) 검출기와 같은 고감도 검출 시스템과 결합하면 더욱 유리한 이미지가 생성됩니다.
제시된 실험 절차는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 외과 적 절차는 매우 침습적이며 염증을 유발하는 것으로 보고되었지만염증은 최소화 될 수 있습니다46. 더욱이, 두개골 창 수술에 의해 유도된 면역 반응은 수술 후 2-4주까지 해결하도록 관찰되었다23,24,25. 또한, 시추 공정은 특히 과도한 힘이나 속도로 수행될 때, 가해지는 열, 진동 및 압력의 생성으로 인해 기본 조직에 손상을 줄 수 있다. 두개골 창 수술 및 다광 화상 진찰은 또한 두뇌 온도영향을 미치기 위하여 관찰되었습니다47. 이러한 제한은 깨끗한 두개골 창의 신중한 생성, 만성 두개골 창이있는 동물의 적절한 회복, 피드백 제어가있는 가열 소스를 사용하여 규범 체온의 유지 를 통해 어느 정도 감소 될 수 있습니다. 둘째, 이미징 깊이는 사용되는 현미경 및 객관적인 렌즈에 의해 제한됩니다. 예를 들어, 해마와 같은 더 깊은 뇌 구조에서 초음파-마이크로버블 치료의 효과는 과열피 조직48의 제거 또는 피질 침투와 함께 마이크로렌즈의 사용과 같은 보다 침습적인 조치 없이는 연구할 수 없다. 장거리 작업 거리가 있는 객관적인 렌즈를 사용하면 이 문제를 어느 정도 해결할 수 있지만, 빛 침투도 더 큰 깊이에서 제한됩니다.
이 프로토콜의 대표적인 이미지는 야생형 설치류로부터 획득되었지만, 제시된 실험 절차는 알츠하이머병과 같은 형질전환 동물 및 질병 모델에도 적용될 수 있다31. 초음파 유발 신경 변조와 같은 BBB 변조와 관련이 없는 초음파 실험도 이 프로토콜33,34를 사용하여 모니터링할 수 있다. 다른 가능한 응용 프로그램은 초고속 카메라50과 공초점 현미경을 페어링하는 것과 같은 다른 현미경 또는 검출기 설정을 사용하여 달성 될 수있다. 광표백 및 광독성은 큰 흥분부함으로 인해 공초점 현미경에서 비교적 나빠지지만, 초고속 이미징은 초음파-마이크로버블 BBB 치료를 구동하는 메커니즘을 더욱 조명할 수 있는 고시간 분해능을 가진 뇌 모세관 내피 세포-마이크로버블 상호 작용의 시각화를 가능하게 할 수 있다. 결론을 내리기 위해, 설명된 프로토콜은 초음파 마이크로버블 BBB 실험에 의해 유도된 혈관 및 세포 효과를 실시간으로 모니터링하는 방법을 제공하여 이러한 치료를 구동하는 메커니즘을 더욱 결정할 수 있는 도구를 제공할 뿐만 아니라 초음파-마이크로버블 치료에 대한 뇌 의 하류 반응을 조명한다.

신경 장애 치료에 대 한 주요 도전은 혈액-뇌 장벽의 존재 (BBB). BBB는 뇌 부전, 전하, 극성 및 대형 (> 400 Da) 분자가 뇌 parenchyma1에 들어가는 것을 제한합니다. 현재 뇌 완두엽종에 BBB를 통해 치료물을 전달하는 데 사용되는 한 가지 방법은 입체 내 주사를 사용하는 것입니다2. 조사 중인 다른 덜 침습적 방법은 BBB3 전반에 걸쳐 수용체 매개 전달을 위한 약물을 설계하는 것과 같은 사용되는 기술의 복잡성에 의해 방해되거나, 비강 내 주사4 또는 과노산 용액의 투여와 같은 표적 영역의 공간 정밀도에 제한이 있다5.
초음파의 사용은 체계적으로 주입된 마이크로버블, 초음파 조영제와 함께 BBB6의 투과성을 일시적으로 증가시키는 비침습적 수단으로 개발되었다. 중점 트랜스듀서7 또는 조향 가능한 단계적 트랜스듀서8,9어를 사용하여 초음파는 밀리미터 수준의 정밀도로 뇌의 선택된 영역을 표적으로 삼아 오프 타겟 효과를 최소화할 수 있습니다. 초음파 마이크로 버블 치료는 자기 공명 영상 안내7,10,11,12,13,14 또는 입체 프레임15를 사용하여 각 피험체의 뇌 해부학에 사용자 정의 할 수 있습니다. 또한 마이크로버블16,17,18의 음향 방출을 모니터링하여 BBB 투과성 증가 정도를 실시간으로 제어할 수 있습니다. 초음파 마이크로 버블 치료의 안전성과 타당성을 조사하는 임상 시험은 현재 전 세계적으로 진행 중입니다 (예를 들어, ClinicalTrials.gov 식별자 NCT04118764).
초음파-마이크로버블 BBB 치료는 전형적으로 BBB 투과성에서 유발된 치료 증가를 확인함으로써 평가되며, 대조적으로 향상된 자기 공명 영상으로 시각화되거나 생체 내 이미징 또는 전 생체 조직학에서 염색 사치에 의해 평가된다. 그러나, 대부분의 현미경 분석은 초음파-마이크로버블 처리의 완료에 따라 ex vivo를 수행하였고, 이에 따라 초음파 노출 시, 그리고 그 직후에 동적 생물학적 반응을 누락했다. 초음파 노출 중에 수행 된 실시간 이미징은 초음파 마이크로 버블 BBB 치료뿐만 아니라 다운스트림 반응을 운전하는 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 치료 응용 분야에 대한 우리의 이해를 증가시킬 수 있습니다. 더욱이, 생체 내 이미징 기법을 가진 만성 두개골 창의 사용은 초음파 마이크로 버블 처리의 시간적 양상을 평가하기 위하여 종방향 연구 결과를 가능하게 할 것입니다.
이 프로토콜의 목표는 설치류에 있는 급성 및 만성 연구 결과를 위한 초음파 마이크로 버블 처리의 실시간 다광자 화상 진찰을 수행하는 데 필요한 외과 및 기술적인 절차를 기술하는 것입니다 (그림 1). 이는 두 부분으로 달성됩니다: 첫째, 생체 이미징을 가능하게 하는 두개골 창을 만들고, 둘째, 동시에 초음파 처리 및 이미징을 가능하게 하기 위해 상단에 링 트랜스듀서를 장착합니다. 두개골 창은 신경 혈관 커플링20, β 아밀로이드 병인21 및 신경 면역학22의 생체 내 이미징을 위해 신경 과학자들에 의해 광범위하게 사용되었습니다22, 그 외의 사이에서. 이 프로토콜에서, 마우스와 쥐 두개골에 급성 (비 회복) 및 만성 (복구) 두개골 창을 만들기위한 외과 적 절차가 설명된다. 두개골 창 방법론, 특히 만성 실험에 대 한, 잘 문서화 되었습니다23,24,25. 기존 문헌과 일치하기 위해 이 프로토콜 전체에 걸쳐 '급성'과 '만성'이 사용됩니다. 생체 내 이미징용 링 트랜스듀서의 설계도 이전에 설명되어 있다26. 이러한 기술의 가용성과 초음파 마이크로 버블 치료의 실시간 이미징에서 얻을 수있는 통찰력에도 불구하고,이 기술을 사용하여 문학을 성공적으로 출판 한 연구 실험실이 거의 없습니다26,27,28,29,30,31,32 . 이와 같이, 이 프로토콜에서는, 이러한 실시간 초음파-마이크로버블 실험을 수행하는 수술 및 기술적 세부 사항이 설명된다. 지정된 초음파 처리 및 이미징 파라미터가 BBB 실험에 최적화되어 있지만, 신경변조33,34, β 아밀로이드 플라크 모니터링31 및 면역 세포 반응32와 같은 뇌에 초음파 노출의 다른 효과도 이 기술을 사용하여 조사될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ring transducer placement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>213-0462 or 214-1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (gel)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (13 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CB00130RA120MNT0</td>
			<td>Coverslip for ring transducer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate or microwave</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-400D</td>
			<td>To heat agarose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring transducer</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>217-0867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal preparation and drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine*A</td>
			<td>Aspen</td>
			<td>169912</td>
			<td>Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine*A</td>
			<td>Indivior</td>
			<td>521634</td>
			<td>Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine*A</td>
			<td>Indivior</td>
			<td>521634</td>
			<td>Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c..</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen*C</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>DIN 02255693</td>
			<td>Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For complete fur removal after trimming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone*C</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td>DIN 00664227, 2301</td>
			<td>Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin*C</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>DIN: 02249243</td>
			<td>Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fur clippers</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>90200714</td>
			<td>Exacta/Isis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Physitemp Instruments INC</td>
			<td>HP-1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ESDG9623C</td>
			<td>Dose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam*A</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td>25388</td>
			<td>Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam*A</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td>25388</td>
			<td>Dose rat: 1 mg/kg, s.c.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse oximeter</td>
			<td>STARR Life Sciences Corp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MouseOx.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Kopf 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile ophthalmic ointment</td>
			<td>Th&#233;a</td>
			<td>597562</td>
			<td>Viscotears.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail vein catheter (24 G)</td>
			<td>BD Neoflon</td>
			<td>391350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material and equipment for cranial window placement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton or fibreless swabs</td>
			<td>Chemtronics</td>
			<td>CX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (gel)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1594457 (gel), 230992 (liquid)</td>
			<td>If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>Jet Set-4 Denture Repair Package</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental micromotor hand drill</td>
			<td>FOREDOM</td>
			<td>K.1070-2</td>
			<td>High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10, 11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CB00050RA120MNT0 (5 mm)</td>
			<td>Mouse cranial windows.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CB00080RA120MNT0 (8 mm)</td>
			<td>Rat cranial windows.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill burrs (0.5 mm)</td>
			<td>Meisinger</td>
			<td>HM71005 (0.5 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill burrs (0.7 mm)</td>
			<td>Meisinger</td>
			<td>HM71007 (0.7 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gelatin sponge</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats / trays</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10803-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Numerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46945</td>
			<td>Recommended 10 kDa-2 MDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillator</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SliceScope microscope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 dB RF Amplifier</td>
			<td>E&#38;I</td>
			<td>2100L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matching circuit</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco Imaging</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Lantheus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Definity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>33500B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time intravital multiphoton microscopy to visualize focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability

혈액 뇌 장벽 (BBB)은 뇌에 약물의 성공적인 전달을위한 주요 도전이다. 마이크로 버블의 존재에 초음파 노출은 BBB의 투과성을 일시적으로 그리고 국소증가시키는 효과적인 방법으로 등장하여 BBB를 통해 약물의 파라 및 세포 간 수송을 용이하게합니다. 초음파 마이크로 버블 치료 중 혈관을 이미징하면 뇌의 초음파 마이크로 버블 치료의 메커니즘과 역학에 대한 귀중하고 새로운 통찰력을 제공합니다.
여기서는 링 트랜스듀서와 20배 의 객관적인 렌즈와 정렬된 두개골 창을 사용하여 인트라바이탈 다광현미경 검사법을 실험하는 시술을 제시합니다. 이 설정은 초음파 마이크로 버블 치료 중 뇌의 높은 공간 및 측두해상도 이미징을 가능하게합니다. 뇌에 대한 광학 적 접근은 열린 두개골 두개골 창을 통해 얻을 수 있습니다. 간단히 말해서, 두개골직경 3-4mm 조각이 제거되고 뇌의 노출된 부위는 유리 덮개 슬립으로 밀봉됩니다. 두 번째 유리 커버슬립에 부착된 0.82MHz 링 트랜스듀서가 상단에 장착되어 있습니다. 아가로즈(1% w/v)는 트랜스듀서의 커버슬립과 두개골 창을 덮는 커버슬립 사이에 사용되어 초음파 전파를 방해하는 기포를 방지한다. 멸균 수술 절차와 항염증 제치가 취해질 때, 초음파 마이크로버블 처리 및 화상 진찰 세션은 몇 주 동안 반복적으로 수행될 수 있습니다. 형광 드엑스트라엔 컨쥬게이트는 혈관을 시각화하고 초음파 마이크로 버블 유도 효과(예: 누설 운동, 혈관 변화)를 정량화하기 위해 정맥내주입된다. 이 백서는 두개골 창 배치, 링 트랜스듀서 배치, 이미징 절차, 일반적인 문제 해결 단계 뿐만 아니라 방법의 장점과 한계에 대해 설명합니다.

성공적인 초음파 마이크로 버블 치료는 BBB 투과성의 증가를 나타내는 항락에서 항암 공간 (그림 8)에 형광 dextran의 사치에 의해 검출 될 수있다. 링 트랜스듀서의 압력 필드에 따라 피알 용기 및/또는 모세혈관이 영향을 받습니다.
초음파 마이크로버블 치료에 의해 유도된 혈관 변화를 평가하기 위해, 관심 있는 용기의 직경은 초음파-마이크로버블 처리 전, 도중 및 후에 측정될 수 있다(도 9). 이 작업은 시판되는 소프트웨어(예: 올림푸스 플루오뷰 소프트웨어)에서 수동으로 수행할 수 있습니다. 이미지 수집 하는 동안, bolus dextran 주사 및 라인 스캔 또한 혈액 흐름을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다30,41. 약물 전달을 위한 대표적인 모델로 서두른 누설의 운동을 평가하기 위해 MATLAB26,27,29,41(도 10)과 같은 도구를 사용하여 내외 및 사치 공간 사이의 신호 강도를 평가할 수 있다.
ImageJ/FIJI를 사용하여 추가 이미지 처리를 수행할 수 있습니다. ImageJ/FIJI는 MATLAB과 호환되며 혈관 변화 측정이나 형광 물체 사이의 길이 또는 거리(예: 혈관에 대한 β 아밀로이드 플라크)와 같은 생물학적 이미지 분석에서 일반적인 분석을 수행하는 데 적합한 오픈 소스 소프트웨어입니다. ImageJ/FIJI에서 만든 이미지 처리 파이프라인은 사용자 지정 매크로를 작성하여 자동화할 수 있습니다.
혈관의 3D 세분화 및 세포 추적과 같은 보다 복잡한 분석은 보다 진보된 반자동 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있습니다(그림 11). 세분화에 따라 혈관을 관절, 베울 또는 모세혈관으로 분류하는 것과 같은 보다 구체적인 분석을 실시하여 직경, 분기, 고문 패턴 및 유동 방향42,43에 따라 수행될 수 있습니다. 기계 학습 알고리즘은 또한 혈관 세분화를 자동화하기 위해 개발되었다22,44.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4.jpg"> 그림 1: 인트라바이탈 다광자 초음파-마이크로버블 뇌 실험의 일반적인 워크플로우. 이 프로토콜에 기재된 인트라바이탈 다광자 초음파-마이크로버블 뇌 실험의 일반적인 워크플로우가 나타난다. 6단계가 있다: (A) 동물 제제는 (A1) 마우스 및 (A2) 쥐, (B) 엑스트라안 주사, (C) 마이크로버블 주입, (D) 전처리 영상, (E) 치료 및 이미징, (F) 후 처리 영상 및 데이터 분석이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig02.jpg"> 그림 2: 3D 프팅 금형의 단면 및 상단 뷰. (A) 금형의 단면. 고리 트랜스듀서의 상단 표면에 청색 된 시아노아크라일트 접착제가 적용되고 커버 슬립이 위에 배치됩니다. 스탬프는 커버슬립 및 링 트랜스듀서에 단단하고 압력을 가하는 데 사용될 수 있습니다. (B) 금형의 최고 뷰. 제조된 트랜스듀서의 제거를 용이하게 하기 위해 금형에 노치를 추가할 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig03.jpg"> 그림 3: 초음파 설정. 초음파 실험을 위한 일반적인 하드웨어가 표시됩니다. 초음파 파라미터는 신호 발생기에 의해 설정되고 트리거되고 증폭기의해 증폭됩니다. 출력 미터는 트랜스듀서와 일치하는 일치하는 일치하는 상자를 일치하는 일치하는 상자에 신호를 보내기 전에 전방 및 반사 힘을 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 연결은 BNC 케이블을 사용하여 수행됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig04.jpg"> 그림 4: 모피 제거 및 두피 제거 영역. (A) 모피 제거는 눈 사이에서 시작하여 목의 앞쪽 절반까지 확장되어야 합니다. (B) 두피 제거는 정수리 뼈를 노출하기에 충분해야합니다. 출혈은 진행하기 전에 중지해야합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig05.jpg"> 그림 5: 두개골 창의 윤곽선입니다. 두개골 창은 정수리 뼈에 위치하고 있습니다. (A) 두개골 창의 윤곽선을 두개골에 그려 드릴링 프로세스를 도울 수 있습니다. (B) 두개골 창의 윤곽선은 컴팩트한 뼈를 통해 드릴링 한 후 볼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig06.jpg"> 그림 6: 두개골 창 및 트랜스듀서 정렬. (A) 두개골 창은 정수리 골격에 만들어집니다. 뼈 섬이 제거되어 아래 뇌가 노출되었습니다. (B) 두개골 덮개 슬립이 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 두개골에 밀봉될 때 두개골 창이 완성됩니다. (C) 트랜스듀서는 두개골 창에 중심을 두고 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 부착된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig07.jpg"> 그림 7: 객관적인 렌즈 및 트랜스듀서의 위치 지정. (A,B) 객관적인 렌즈는 링 트랜스듀서를 중심으로 합니다. (C) 형광 드레이칸으로 채워진 혈관은 눈피성 아래, 피광을 통해 볼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig08.jpg"> 그림 8: 초음파-마이크로버블의 최대 프로젝션 다광자 이미지는 BBB 투과성에서 증가한다. 초음파 마이크로 버블 치료 후 혈관 (A)의 최대 투영 이미지 (A) 전과 (B). 성공적인 초음파-마이크로버블 치료는 형광성 엑스트라인 사치(arrows)로 시각화된 치료 후 BBB 투과성 증가를 관찰함으로써 확인할 수 있다. 스케일 바: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4.jpg"> 그림 9: 초음파 마이크로버블 치료에 의해 유도된 혈관변조 의 분석. 초음파 마이크로 버블 치료 전, 도중 및 후에 대뇌 혈관의 최대 투영 이미지. 마이크로 버블은 모든 이미지에 존재합니다. (A) 전처리 조건에 비해, 초음파-마이크로버블 치료(적색 화살표) 동안 명확한 혈관 변조를 관찰(B)할 수 있다. BBB 투과성에서 초음파 마이크로 버블 매개 증가는 또한 항라바능에서 화반 공간 (노란색 화살표)에 형광 dextran의 누설에서 치료 다음 분명하다. (C) 초음파가 꺼지면 혈관 직경이 전처리, 기준선 크기로 돌아갑니다. (D) 혈관 변화는 초음파-마이크로버블 처리 전, 도중 및 후에 관심 있는 용기의 직경을 플로팅하여 분석될 수 있다. 스케일 바: 100 μm(게시되지 않은 작업). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4.jpg"> 그림 10: 초음파 마이크로 버블 치료 다음 누설 운동제의 분석. BBB 투과성의 증가는 비약공간에서 화과 공간으로형광디엑스트라넨의 누설로 시각화된다. BBB 투과성의 변화는 초음파 마이크로 버블 치료 후 획득 한 이미지 스택 (A) 전과 (B)를 비교할 때 분명합니다. (C) 누출 역학은 사치구획(노란색 사각형)에서 덱스의 강도, 부피 및 속도를 추적하여 분석할 수 있다. 스케일 바: 50 μm(게시되지 않은 작업). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig11.jpg"> 도 11: 다광현미경 XYZ 스택의 혈관 세분화. (A) 깊이(XYZ) 형질형 EGFP 쥐에서 혈관의 스택. 혈관은 형광 텍사스 레드 70 kDa dextran (빨간색)의 정맥 주사를 통해 시각화됩니다. 녹색 채널은 형광 세포 와 조직 자동 형광을 보여줍니다. (B) 혈관의 3D 재건이 생성된 다음 혈관 유형에 따라 색으로 구분되어 유형별 분석을 용이하게 합니다. 정맥/베뉴는 파란색이고 동맥/동맥은 빨간색이며 모세혈관은 시안입니다. 스케일 바: 50 μm. 비트 플레인 이마리스를 사용하여 만든 재건. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability at JoVE.co

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

이 프로토콜은 혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중 된 초음파 및 마이크로 버블 치료 중에 설치류 뇌의 생체 내 다광 형광 이미징에서 실시간으로 가능하게하는 수술 및 기술적 절차를 설명합니다.

혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중된 초음파 및 마이크로 버블 치료를 시각화하는 실시간 인트라바이탈 다광원 현미경 검사법

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

마이크로 버블의 존재에 초음파 노출은 혈액 - 뇌 장벽의 투과성을 일시적으로 로컬로 증가시키는 효과적인 방법으로 등장했다. 일반적으로 혈액-뇌 장벽 여러 뇌 질환에 대 한 잠재적인 약물의 전달을 방해. 초음파 처리시, 주입된 마이크로버블은 진동을 시작하고 혈관 벽에 부담을 유도하고, 단단한 접합을 열고 결국 약물이 전임상 모델에서 혈액-뇌 장벽을 넘을 수 있도록 허용하며, 초음파 및 마이크로 버블 치료의 효과는 종종 대조적으로 향상된 자기 공명 영상이나 염료 ex vivo의 사치를 연구함으로써 연구됩니다.이 접근법의 단점은 초음파 노출 후 실시간 반응을 얻을 수 없다는 것입니다. 뇌의 인트라바이탈 다광화상은 이러한 효과를 실시간으로 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 다음 비디오에서는 마우스에 두개골 창을 배치하고 두개골에 장착 된 링 트랜스듀서를 사용하여 초음파 마이크로 버블 치료를 수행하는 방법에 대한 단계별 지침을 제시합니다.이 절차는 동시 초음파 처리 및 생체 내 다광화상 이미징을 가능하게 합니다. 두개골 창 수술 및 초음파 마이크로 버블 치료에 필요한 재료를 준비하기 시작합니다. 이 비디오에서는 급성 비 회복 두개골 창 수술을 보여줍니다.만성 회복 두개골 창 수술, 살균 도구 및 재료, 멸균 수술 공간 및 적절한 약물이 필요합니다. 수술 전에 마취와 진통을 투여합니다. 머리에 털을 제거합니다.동물을 스테레오탁프레임에 놓습니다. dextran 및 마이크로 버블 주사를 위해 꼬리 정맥에 카테터를 삽입합니다. 열원을 사용하여 동물의 핵심 온도를 37도 유지합니다.여기에 우리는 따뜻한 물로 가득 찬 장갑을 사용하고 있습니다. 두피를 제거하려면 집게를 사용하여 눈 사이에 피부를 들어 올리고 처진 봉합사를 따라 자른다. 면봉으로 두개골의 바깥쪽 표면을 덮는 음골제거합니다.그런 다음 두개골에 있는 두개골 창의 원하는 위치를 표시하고 윤곽선을 따라 드릴링을 시작합니다. 드릴링 중에 두개골이 과열되는 것을 방지하기 위해 주사기를 사용하여 두개골에 식염수를 떨어 뜨리거나 식염수에 담근 외과 스폰지 조각을 적용하십시오. 두개골을 드릴링하고 냉각하는 것을 번갈아 가며.뼈 섬에 부드러운 압력을 가하여 드릴링 진행 상황을 확인하십시오. 한 쌍의 집게를 사용하여 뼈 섬을 제거합니다. 식염수에 미리 담근 외과 스폰지 조각을 사용하여 뇌가 촉촉하게 유지되도록하십시오.두개골 창을 놓기 위해, 커버 슬립의 한쪽에 식염수 한 방울을 놓고 두개골의 구멍 위로 기동합니다. 덮개 슬립의 둘레에 접착제 층을 확산하여 두개골에 부착합니다. 접착제가 완전히 건조되면 아가로즈 용액을 창에 놓고 트랜스듀서를 위에 놓습니다.트랜스듀서와 두개골 창 사이에 최소한의 아가로즈가 있도록 단단한 압력을 가하십시오. 아가로즈가 젤오와 같은 일관성으로 냉각되면 트랜스듀서의 커버슬립 둘레에서 과잉 아가로즈를 잘라냅니다. 트랜스듀서의 표지 전표 둘레를 따라 접착제 층을 펼쳐 두개골에 부착합니다.접착제가 완전히 건조 된 후, 현미경의 객관적인 렌즈 아래에 동물을 배치합니다. 목표가 트랜스듀서 또는 커버슬립과 충돌하지 않는지 확인합니다. 다광 현미경에서 시야를 선택합니다.혈관의 이미징 스캔을 설정하고 초음파 처리를 시작합니다. 이 프로토콜의 경우 0.82 메가헤르츠의 주행 주파수에서 작동하는 링 트랜스듀서, 기계적으로 0.2~0.4의 10밀리초 사이클, 1~4개의 Hertz 사이의 펄스 반복 주파수를 사용합니다. 소노브 마이크로 버블은 킬로그램 당 1 밀리리터의 용량으로 주입됩니다.성공적인 초음파 마이크로 버블 치료는 BBB 투과성의 증가를 나타내는, 사치스러운 공간에서 형광 dextran의 사치에 의해 검출 될 수있다. 약물 전달을 위한 대표적인 모델로 서두른 누설의 운동을 평가하기 위해 MATLAB과 같은 도구를 사용하여 내외 공간과 사치 공간 사이의 신호 강도를 평가할 수 있다. 초음파 마이크로 버블 치료에 의해 유도 된 혈관 변화를 평가하기 위해, 관심있는 용기의 직경은 초음파 마이크로 버블 치료 전, 도중 및 후에 측정 될 수있다.이미지 분석은 ImageJ, FIJI 또는 프로그래밍 도구와 같은 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다. 여기서 이마리스는 혈관 세분화 및 분류에 사용되었습니다. 링 트랜스듀서와 결합된 뇌의 인트라바이탈 다광자 현미경 검사는 높은 공간 및 측두성 해상도에서 초음파 마이크로버블 처리에 의해 유도된 효과를 실시간으로 모니터링하는 방법을 제공한다.정량적 및 질적 데이터는 예를 들어, 사치 운동 및 혈관 변화를 연구하기 위하여 얻어질 수 있습니다. 여기에 제시된 실험 방법은 여러 연구 모델및 다양한 초음파 응용 프로그램에 적용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

초음파 타겟 Microbubble 파괴 기술 소개

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

연구

생체공학

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

높은 강도의 실시간 모니터링의 초음파 (HIFU) 절제를 집중<em&gt; 체외</em&gt; 집중 초음파에 대한 조화 운동 이미징을 사용하여 개 간을 (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

쥐 뇌 혈관 벽의 맞은 편에 FITC로드 Ferritins의 생체 외 투과 년 : 모델 Nanoformulated 분자의 배달을 공부하기

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

시투에 바이오 프로세스에서 단세포 형태학의 실시간 측정을 위한 현미경 검사법

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Nafion 코팅의 제조, 미생물 발효 하는 동안 실시간 산도 모니터에 그래 핀 산화물/폴리아닐린 Chemiresistive 센서 감소

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

루시퍼 옐로우 - 인간 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 강력한 파라셀룰러 투과성 마커

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...