Name: real-time intravital multiphoton microscopy to visualize focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability
Uploaded: 2022-02-05T13:00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability at JoVE.co

Содержание животных было обеспечено Центром сравнительной медицины (CoMed, NTNU). Рисунок 3 был создан в BioRender.com. Записью и редактированием видео занимался Пер Хеннинг, веб-мастер факультета естественных наук НТНУ. Проект финансировался Норвежским университетом науки и технологии (NTNU, Тронхейм, Норвегия), Исследовательским советом Норвегии (RCN 262228), Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (FDN 154272), Национальным институтом здравоохранения (R01 EB003268) и кафедрой целенаправленных ультразвуковых исследований Темерти в Центре медицинских наук Саннибрука.

Чарисса Пун, Мелина Мюленпфордт, Мариеке Олсман и Катарина де Ланге Дэвис не заявляют о финансовых или нефинансовых конкурирующих конфликтах интересов. Спирос Котопулис является штатным сотрудником и владеет акциями EXACT Therapeutics AS, компании, занимающейся разработкой ультразвуковых и микропузырьковых / кластерных улучшенных лекарств. Куллерво Хининнен является основателем FUS Instruments, от которой он получает поддержку, не связанную с исследованиями.

Мониторинг прижизненной многофотонной микроскопии головного мозга является ценным инструментом для изучения реакций мозга во время ультразвукового воздействия. Насколько нам известно, описанный здесь протокол является единственным методом проведения многофотонной микроскопической визуализации паренхимы головного мозга во время ультразвуково-микропузырьковых процедур. Создание краниальных окон и использование кольцевых преобразователей позволяют в режиме реального времени контролировать сосудистые, клеточные и другие последующие реакции на ультразвуковые микропузырьковые процедуры с высоким пространственным и временным разрешением. Другие группы выполнили многофотонную микроскопическую визуализацию после завершения ультразвуково-микропузырьковых процедур, тем самым пропуская реакцию паренхимы головного мозга в реальном времени на лечение19. Описанная процедура предлагает улучшенный временной контроль, позволяя собирать данные, которые могут помочь осветить острые механизмы, лежащие в основе ультразвукового микропузырькового лечения. Количественные и качественные данные могут быть извлечены и проанализированы из стеков полученных изображений, таких как кинетика экстравазации27,29,30, изменения объема β-амилоидной бляшки31 и динамика клеток32.
В протоколе было выделено несколько шагов по устранению неполадок. Во-первых, были подчеркнуты хирургические этапы, которые особенно подвержены ошибкам оператора, такие как использование агарозы во время операции на черепном окне и размещение датчика. Также были предложены меры по предотвращению дискомфорта и смерти животных, включая мониторинг физиологии животных во время операции и тщательное вихрь декстрана перед инъекцией. Во-вторых, были также выделены физические характеристики преобразователя и выравнивание объектива, преобразователя и краниального окна. Технические характеристики кольцевого преобразователя и его акустические свойства должны определяться с учетом используемой линзы объектива, а также животной модели. В частности, внутренний диаметр кольцевого преобразователя должен быть достаточно большим, чтобы окружать объектив, но достаточно маленьким, чтобы надежно закрепиться на черепе животного. Кроме того, фокусная область преобразователя должна совпадать с диапазоном используемой объектива.
Общая проблема заключается в том, что краниальное окно и кольцевой преобразователь расположены под углом относительно объектива. Правильное центрирование (XY) и выравнивание (Z) объектива с краниальным окном и преобразователем гарантирует, что фокальная область преобразователя и, следовательно, область обработанной ткани мозга выравнивается с полем зрения изображения и снижает риск столкновения между объективом и преобразователем во время визуализации. Выравнивание может быть достигнуто путем регулировки положения головы животного и/или путем вращения стереотаксической рамки, в которой оно зафиксировано.
Компоненты микроскопа (например, детекторы, светоделители) и параметры получения изображения должны быть выбраны на основе цели исследования. Здесь используется объектив с длинным фокусным расстоянием (> 2 мм) из-за наличия покровного(ых) и кольцевого преобразователя, расположенного между объективом и мозгом. Также рекомендуется вертикальный микроскоп, поскольку он дает больше пространства для маневрирования животного, особенно для экспериментов с мозгом. Для захвата кинетики ультразвуковой микропузырьки, вызванной утечкой внутрисосудистого красителя, благоприятно высокое временное разрешение, которое может быть достигнуто с помощью системы резонансного сканирования. Сочетание этого с высокочувствительной системой обнаружения, такой как детекторы фосфида арсенида галлия (GaAsP), также приведет к более благоприятным изображениям.
Представленная экспериментальная процедура имеет ряд ограничений. Во-первых, хирургическая процедура является довольно инвазивной и, как сообщается, вызывает воспаление45, хотя воспаление может быть сведено к минимуму46. Кроме того, иммунные реакции, вызванные операциями на черепных окнах, разрешались через 2-4 недели после операции23,24,25. Кроме того, процесс бурения, особенно когда он проводится с чрезмерной силой или скоростью, может привести к повреждению подлежащей ткани из-за генерации тепла, вибрации и давления. Также наблюдалось, что операции на краниальном окне и многофотонная визуализация влияют на температуру мозга47. Эти ограничения могут быть уменьшены в некоторой степени за счет тщательного создания нетронутых черепных окон, правильного восстановления животных с хроническими краниальными окнами и поддержания нормотермической температуры тела с использованием источника нагрева с обратной связью. Во-вторых, глубина изображения ограничена используемым микроскопом и объективом. Например, эффект ультразвукового микропузырького лечения в более глубоких структурах мозга, таких как гиппокамп, не может быть изучен без более инвазивных мер, таких как удаление вышележащей кортикальной ткани48 или использование микролинз в сочетании с кортикальным проникновением49. Использование объектива с большим рабочим расстоянием может в некоторой степени решить эту проблему, но проникновение света также ограничено на больших глубинах.
В то время как репрезентативные изображения этого протокола были получены от грызунов дикого типа, представленная экспериментальная процедура также может быть применена к трансгенным животным и моделям заболеваний, таким как болезнь Альцгеймера31. Ультразвуковые эксперименты, не связанные с модуляцией ГЭБ, такие как ультразвуковая нейромодуляция, также могут контролироваться с использованием этого протокола33,34. Другие возможные применения могут быть достигнуты путем использования различных настроек микроскопа или детектора, таких как сопряжение конфокального микроскопа со сверхскоростной камерой50. В то время как фотоотбеливание и фототоксичность сравнительно хуже в конфокальных микроскопах из-за большого объема возбуждения, сверхскоростная визуализация может позволить визуализировать капиллярные эндотелиальные клеточно-микропузырьковые взаимодействия головного мозга с высоким временным разрешением, что может дополнительно осветить механизмы, управляющие ультразвуковым микропузырьковым лечением BBB. В заключение, описанный протокол предоставляет метод мониторинга сосудистых и клеточных эффектов, индуцированных ультразвуковыми экспериментами с микропузырьками ГЭБ в режиме реального времени, предоставляя инструмент для дальнейшего определения механизмов, приводящих к этим методам лечения, а также освещая последующие реакции паренхимы мозга на ультразвуковые микропузырьковые процедуры.

Ключевой проблемой для лечения неврологических расстройств является наличие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). ГЭБ ограничивает попадание гидрофильных, заряженных, полярных и крупных (> 400 Да) молекул в паренхиму мозга1. Одним из методов, используемых в настоящее время для доставки терапевтических средств через ГЭБ в паренхиму мозга, является использование стереотаксических внутричерепных инъекций2. Другие менее инвазивные исследуемые методы затруднены сложностью используемых методов, таких как разработка лекарств для опосредованной рецепторами доставки через ГЭБ3, или ограничены в пространственной точности целевых областей, таких как интраназальные инъекции4 или введение гиперосмотических растворов5.
Использование ультразвука в сочетании с системно вводимыми микропузырьками, ультразвуковым контрастным веществом, было разработано в качестве неинвазивного средства для временного повышения проницаемости ГЭБ6. Используя сфокусированный преобразователь7 или управляемую фазированную решетку преобразователей8,9, ультразвук может быть нацелен на выбранные области мозга с точностью до миллиметрового уровня, сводя к минимуму нецелевые эффекты. Ультразвуковые микропузырьковые процедуры могут быть настроены на анатомию мозга каждого субъекта с использованием магнитно-резонансной томографии 7,10,11,12,13,14 или стереотаксических кадров15. Кроме того, степень увеличения проницаемости ГЭБ можно контролировать в режиме реального времени путем мониторинга акустического излучения от микропузырьков16,17,18. Клинические испытания, изучающие безопасность и осуществимость ультразвуково-микропузырьковых методов лечения, в настоящее время проводятся во всем мире (например, ClinicalTrials.gov идентификатор NCT04118764).
Ультразвуковые микропузырьковые методы лечения ГЭБ обычно оцениваются путем подтверждения вызванного лечением увеличения проницаемости ГЭБ, визуализируется в магнитно-резонансной томографии с контрастным усилением или путем экстравазации красителя в визуализации in vivo или гистологии ex vivo. Тем не менее, большинство микроскопических анализов были выполнены ex vivo после завершения ультразвуковой микропузырьковой обработки11,19, что привело к отсутствию динамических биологических реакций во время и сразу после ультразвукового воздействия. Визуализация в режиме реального времени, проводимая во время ультразвукового воздействия, может помочь в понимании механизмов, приводящих к лечению ультразвукового микропузырька ГЭБ, а также последующих реакций, что может улучшить наше понимание его терапевтического применения. Кроме того, использование хронических черепных окон с методами визуализации in vivo позволит продольным исследованиям оценить временные аспекты ультразвуково-микропузырьковых процедур.
Целью данного протокола является описание хирургических и технических процедур, необходимых для проведения многофотонной визуализации ультразвукового микропузырькового лечения в режиме реального времени для острых и хронических исследований на грызунах (рисунок 1). Это достигается в двух частях: во-первых, для создания краниального окна для обеспечения визуализации in vivo, а во-вторых, для установки кольцевого преобразователя сверху для обеспечения одновременной обработки ультразвуком и визуализации. Черепные окна широко используются нейробиологами для визуализации in vivo нейроваскулярной связи20, β-амилоидного патогенеза21 и нейроиммунологии22, среди прочих. В этом протоколе описаны хирургические процедуры создания острых (невосстановительных) и хронических (восстановительных) черепных окон в черепе мыши и крысы. Методологии краниальных окон, особенно для хронических экспериментов, были хорошо задокументированы23,24,25. В соответствии с существующей литературой термины «острый» и «хронический» будут использоваться во всем этом протоколе. Конструкция кольцевых преобразователей для визуализации in vivo также была ранее описана26. Несмотря на доступность этих методов и понимание, которое может быть получено из визуализации в режиме реального времени ультразвуковых микропузырьковых методов лечения, существует очень мало исследовательских лабораторий, которые успешно опубликовали литературу с использованием этого метода26,27,28,29,30,31,32 . Таким образом, в этом протоколе описываются хирургические и технические детали проведения этих ультразвуковых микропузырьковых экспериментов в режиме реального времени. В то время как указанные параметры обработки ультразвуком и визуализации были оптимизированы для экспериментов с ГЭБ, другие эффекты ультразвукового воздействия на мозг, такие как нейромодуляция33,34, мониторинг β-амилоидных бляшек31 и реакции иммунных клеток32, также могут быть исследованы с использованием этого метода.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ring transducer placement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>213-0462 or 214-1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (gel)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (13 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CB00130RA120MNT0</td>
			<td>Coverslip for ring transducer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate or microwave</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-400D</td>
			<td>To heat agarose solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring transducer</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>217-0867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal preparation and drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine*A</td>
			<td>Aspen</td>
			<td>169912</td>
			<td>Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine*A</td>
			<td>Indivior</td>
			<td>521634</td>
			<td>Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine*A</td>
			<td>Indivior</td>
			<td>521634</td>
			<td>Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c..</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen*C</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>DIN 02255693</td>
			<td>Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For complete fur removal after trimming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone*C</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td>DIN 00664227, 2301</td>
			<td>Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin*C</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>DIN: 02249243</td>
			<td>Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fur clippers</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>90200714</td>
			<td>Exacta/Isis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Physitemp Instruments INC</td>
			<td>HP-1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ESDG9623C</td>
			<td>Dose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam*A</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td>25388</td>
			<td>Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam*A</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td>25388</td>
			<td>Dose rat: 1 mg/kg, s.c.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse oximeter</td>
			<td>STARR Life Sciences Corp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MouseOx.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Kopf 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile ophthalmic ointment</td>
			<td>Th&#233;a</td>
			<td>597562</td>
			<td>Viscotears.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail vein catheter (24 G)</td>
			<td>BD Neoflon</td>
			<td>391350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material and equipment for cranial window placement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton or fibreless swabs</td>
			<td>Chemtronics</td>
			<td>CX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue (gel)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1594457 (gel), 230992 (liquid)</td>
			<td>If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>Jet Set-4 Denture Repair Package</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental micromotor hand drill</td>
			<td>FOREDOM</td>
			<td>K.1070-2</td>
			<td>High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10, 11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CB00050RA120MNT0 (5 mm)</td>
			<td>Mouse cranial windows.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CB00080RA120MNT0 (8 mm)</td>
			<td>Rat cranial windows.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill burrs (0.5 mm)</td>
			<td>Meisinger</td>
			<td>HM71005 (0.5 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill burrs (0.7 mm)</td>
			<td>Meisinger</td>
			<td>HM71007 (0.7 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gelatin sponge</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats / trays</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10803-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN20 XW</td>
			<td>Numerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46945</td>
			<td>Recommended 10 kDa-2 MDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillator</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SliceScope microscope</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 dB RF Amplifier</td>
			<td>E&#38;I</td>
			<td>2100L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matching circuit</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco Imaging</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Lantheus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Definity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>33500B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time intravital multiphoton microscopy to visualize focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является ключевой проблемой для успешной доставки лекарств в мозг. Ультразвуковое воздействие в присутствии микропузырьков стало эффективным методом временного и локального повышения проницаемости ГЭБ, облегчая пара- и трансклеточный транспорт лекарств через ГЭБ. Визуализация сосудистой системы во время ультразвуково-микропузырного лечения даст ценную и новую информацию о механизмах и динамике ультразвуково-микропузырьковых процедур в головном мозге.
Здесь мы представляем экспериментальную процедуру прижизненной многофотонной микроскопии с использованием краниального окна, выровненного с кольцевым преобразователем и объективом 20x. Эта настройка позволяет получать изображения мозга с высоким пространственным и временным разрешением во время ультразвуково-микропузырьковых процедур. Оптический доступ к мозгу осуществляется через черепно-мозговое окно с открытым черепом. Вкратце, кусок черепа диаметром 3-4 мм удаляется, а открытая область мозга запечатывается стеклянной крышкой. Кольцевой преобразователь 0,82 МГц, который прикреплен ко второму стеклянному чехлу, установлен сверху. Агароза (1% мас./об.) используется между крышкой датчика и крышкой, покрывающей краниальное окно, для предотвращения пузырьков воздуха, которые препятствуют распространению ультразвука. Когда проводятся стерильные хирургические процедуры и противовоспалительные меры, ультразвуково-микропузырьковые процедуры и сеансы визуализации могут выполняться повторно в течение нескольких недель. Флуоресцентные конъюгаты декстрана вводят внутривенно для визуализации сосудистой системы и количественной оценки ультразвуковых микропузырьковых эффектов (например, кинетика утечки, сосудистые изменения). В этой статье описывается размещение краниального окна, размещение кольцевого преобразователя, процедура визуализации, общие этапы устранения неполадок, а также преимущества и ограничения метода.

Успешные ультразвуковые микропузырьковые процедуры могут быть обнаружены по экстравазации флуоресцентного декстрана из внутрисосудистого во внесососудистое пространство (рисунок 8), что указывает на увеличение проницаемости ГЭБ. В зависимости от поля давления кольцевого преобразователя будут затронуты пиальные сосуды и/или капилляры.
Для оценки сосудистых изменений, вызванных ультразвуковыми микропузырьками, диаметр интересующего сосуда может быть измерен до, во время и после ультразвуковой микропузырьковой обработки (рисунок 9). Это можно сделать вручную в коммерчески доступном программном обеспечении (например, программном обеспечении Olympus Fluoview). Во время получения изображения болюсные инъекции декстрана и линейное сканирование также могут быть использованы для оценки кровотока30,41. Для оценки кинетики утечки декстрана в качестве репрезентативной модели доставки лекарственного средства интенсивность сигнала между внутрисосудистым и внесосудистым пространствами может быть оценена с использованием таких инструментов, как MATLAB26,27,29,41 (рисунок 10).
Дальнейшая обработка изображений может быть достигнута с помощью ImageJ/FIJI. ImageJ/FIJI - это программное обеспечение с открытым исходным кодом, которое совместимо с MATLAB и хорошо подходит для проведения общих анализов в анализе биологических изображений, таких как измерение сосудистых изменений или длины или расстояния между флуоресцентными объектами (например, β-амилоидными бляшками до кровеносных сосудов). Конвейеры обработки изображений, созданные в ImageJ/FIJI, могут быть автоматизированы путем написания пользовательских макросов.
Более сложные анализы, такие как 3D-сегментация кровеносных сосудов и отслеживание клеток, могут быть достигнуты с использованием более продвинутого, полуавтоматического программного обеспечения (рисунок 11). После сегментации могут быть проведены более конкретные анализы, такие как классификация кровеносных сосудов как артериол, венул или капилляров, на основе диаметра, ветвления, паттернов извилистости и направления потока42,43. Алгоритмы машинного обучения также были разработаны для автоматизации сегментации кровеносных сосудов22,44.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4.jpg"> Рисунок 1: Общий рабочий процесс прижизненных многофотонных ультразвуково-микропузырьковых экспериментов мозга. Показан общий рабочий процесс прижизненных многофотонных ультразвуково-микропузырьковых экспериментов мозга, описанных в данном протоколе. Существует 6 этапов: (A) подготовка животных для (A1) мышей и (A2) крыс, (B) инъекция Декстрана, (C) инъекция микропузырька, (D) визуализация перед лечением, (E) лечение и визуализация, (F) визуализация после лечения и анализ данных. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig02.jpg"> Рисунок 2: Поперечное сечение и вид сверху 3D-печатной формы. (A) Поперечное сечение пресс-формы. На верхнюю поверхность кольцевого преобразователя наносится тонкий слой цианоакрилатного клея, а сверху укладывается крышка. Штамп может использоваться для нанесения твердого, равномерного давления на крышку и кольцевой преобразователь. (B) Вид сверху пресс-формы. Выемка может быть добавлена в форму для облегчения удаления подготовленного преобразователя. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig03.jpg"> Рисунок 3: Настройка ультразвука. Показана типичная аппаратура для ультразвуковых экспериментов. Ультразвуковые параметры устанавливаются и запускаются генератором сигналов и усиливаются усилителем. Измеритель мощности может использоваться для записи прямых и отраженных мощностей перед отправкой сигнала в соответствующую коробку, которая сопоставляется с преобразователем. Все соединения достигаются с помощью кабелей BNC, если не указано иное. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig04.jpg"> Рисунок 4: Область удаления меха и кожи головы. (А) Удаление меха должно начинаться между глазами и расширяться до передней половины шеи. (B) Удаление кожи головы должно быть достаточным для обнажения теменных костей. Кровотечение должно быть остановлено, прежде чем продолжить. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig05.jpg"> Рисунок 5: Контур краниального окна. Краниальное окно расположено на теменной кости. (A) Контур краниального окна может быть нарисован на черепе, чтобы помочь в процессе бурения. (B) Контур краниального окна можно увидеть после сверления через компактную кость. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig06.jpg"> Рисунок 6: Выравнивание краниального окна и преобразователя. (A) Краниальное окно создается на теменной кости. Костяной остров был удален, обнажая мозг под ним. (B) Краниальное окно является полным, когда стеклянная крышка запечатана на череп с помощью цианоакрилатного клея. (C) Датчик центрируется к краниальному окну и приклеивается с использованием цианоакрилатного клея. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig07.jpg"> Рисунок 7: Позиционирование объектива и преобразователя. (A,B) Объектив центрирован на кольцевом преобразователе. (C) Кровеносные сосуды, заполненные флуоресцентным декстраном, видны через окуляры под эпифлуоресценцией. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig07large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig08.jpg"> Рисунок 8: Максимальная проекция многофотонных изображений ультразвуково-микропузырьковых, индуцированных увеличением проницаемости ГЭБ. Максимальные проекционные изображения сосудистой системы (А) до и (В) после ультразвуковых микропузырьковых процедур. Успешные ультразвуковые микропузырьковые процедуры могут быть подтверждены путем наблюдения за увеличением проницаемости ГЭБ после лечения, визуализируемого как флуоресцентная экстравазация декстрана (стрелки). Шкала: 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig08large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4.jpg"> Рисунок 9: Анализ вазомодуляции, индуцированной ультразвуковыми микропузырьками. Максимальные проекционные изображения сосудов головного мозга до, во время и после ультразвуковых микропузырьковых процедур. Микропузырьки присутствуют на всех изображениях. По сравнению с (А) предлечебными состояниями, четкая вазомодуляция может наблюдаться (В) во время ультразвуковых микропузырьковых процедур (красные стрелки). Ультразвуково-микропузырьковые опосредованные повышения проницаемости ГЭБ также проявляются после лечения от утечки флуоресцентного декстрана из внутрисосудистого во внесососудистое пространство (желтые стрелки). (C) Когда ультразвук выключен, диаметры сосудов возвращаются к исходным размерам до лечения. (D) Сосудистые изменения могут быть проанализированы путем построения диаметра интересующего сосуда до, во время и после ультразвуковой микропузырьковой обработки. Шкала: 100 мкм. (Неопубликованная работа). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4.jpg"> Рисунок 10: Анализ кинетики утечки после ультразвуковой микропузырьковой обработки. Повышение проницаемости ГЭБ визуализируется как утечка флуоресцентного декстрана из внутрисосудистого во внесосудистое пространство. Изменения проницаемости ГЭБ очевидны при сравнении стеков изображений, полученных (А) до и (В) после ультразвуковой микропузырьковой обработки. (C) Кинетика утечки может быть проанализирована путем отслеживания интенсивности, объема и скорости декстрана во внесосудистых компартментах (желтый прямоугольник). Шкала: 50 мкм. (Неопубликованная работа.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig11.jpg"> Рисунок 11: Сегментация кровеносных сосудов многофотонной микроскопии XYZ stack. (A) Глубина (XYZ) стек кровеносных сосудов у трансгенной EGFP крысы. Кровеносные сосуды визуализируются с помощью внутривенной инъекции флуоресцентного техасского красного декстрана 70 кДа (красный). Зеленый канал показывает флуоресцентные клетки и тканевую аутофлуоресценцию. (B) Создаются 3D-реконструкции кровеносных сосудов, а затем цветовая кодировка в соответствии с типом кровеносного сосуда для облегчения анализа по типу. Вены / венулы синие, артерии / артериолы красные, а капилляры голубые. Шкала: 50 мкм. Реконструкции, созданные с помощью Bitplane Imaris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig11large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability at JoVE.co

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Этот протокол описывает хирургические и технические процедуры, которые позволяют в режиме реального времени in vivo многофотонную флуоресцентную визуализацию мозга грызунов во время сфокусированного ультразвука и микропузырьков для повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера.

Прижизненная многофотонная микроскопия в режиме реального времени для визуализации сфокусированного ультразвука и микропузырьковых процедур для повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Ультразвуковое воздействие при наличии микропузырьков стало эффективным методом преходящего и локального повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера. Обычно гематоэнцефалический барьер препятствует доставке потенциальных лекарств для лечения нескольких заболеваний головного мозга. После обработки ультразвуком введенные микропузырьки начинают колебаться и вызывают напряжение на стенке сосуда, открывая плотные соединения и в конечном итоге позволяя лекарствам пересекать гематоэнцефалический барьер В доклинических моделях эффект ультразвука и лечения микропузырьками часто изучается с помощью магнитно-резонансной томографии с контрастным усилением или путем изучения экстравазации красителей ex vivo.Недостатком такого подхода является то, что реакция в реальном времени во время и сразу после ультразвукового воздействия не может быть получена. Прижизненная многофотонная визуализация головного мозга дает возможность изучать эти эффекты в режиме реального времени. В следующем видео мы представим пошаговую инструкцию о том, как поместить краниальное окно в мышь и выполнить ультразвуковую обработку микропузырем с помощью кольцевого преобразователя, установленного на черепе.Эта процедура обеспечивает одновременную обработку ультразвуком и многофотонную визуализацию in vivo. Для начала необходимо подготовить материалы, необходимые для хирургии черепного окна и ультразвуковой обработки микропузырьков. В этом видео мы показываем острую невосстанавливающую операцию на черепном окне.Для хронического восстановления хирургии черепных окон необходимы стерилизованные инструменты и материалы, стерильное хирургическое пространство и соответствующие препараты. Перед операцией вводят анестезию и обезболивание. Снимите мех на голове.Поместите животное в стереотаксическую рамку. Вставьте катетер в заднюю вену для инъекций декстрана и микропузырьков. Поддерживайте температуру ядра животного 37 градусов с помощью источника тепла.Здесь мы используем перчатку, наполненную теплой водой. Чтобы удалить кожу головы, поднимите кожу между глазами с помощью щипцов и разрезайте вдоль сагиттального шва. Удалите надкостницу, покрывающую внешнюю поверхность черепа ватным тампоном.После этого отметьте нужное расположение краниального окна на черепе и приступайте к сверлению вдоль контура. Чтобы предотвратить перегрев черепа во время сверления, капните физиологический раствор на череп с помощью шприца или нанесите кусок хирургической губки, смоченный в физиологическом растворе. Чередуйте сверление и охлаждение черепа.Проверьте ход бурения, оказав мягкое давление на костный остров. Удалите костный остров с помощью пары щипцов. Убедитесь, что мозг остается влажным, используя кусок хирургической губки, который был предварительно пропитан физиологическим раствором.Чтобы поместить краниальное окно, поместите каплю физиологического раствора на одну сторону крышки и маневрируйте ею над отверстием в черепе. Распределите слой клея по периметру чехлового листа, чтобы прикрепить его к черепу. Как только клей полностью высохнет, нанесите раствор агарозы на окно и поместите датчик сверху.Примените сильное давление таким образом, чтобы между датчиком и краниальным окном была минимальная агароза. Когда агароза остынет до желеобразной консистенции, отрежьте избыток агарозы с окружностей крышки преобразователя. Распределите слой клея по окружности чехла преобразователя, чтобы приклеить его к черепу.После того, как клей полностью высохнет, поместите животное под объектив микроскопа. Убедитесь, что объектив не сталкивается с датчиком или крышкой. Выберите поле зрения в многофотонном микроскопе.Настройте сканирование сосудистой системы и начните обработку ультразвуком. Для этого протокола мы используем кольцевой преобразователь, который работает на частоте движения 0,82 мегагерца, 10-миллисекундных циклах, механически индексированных от 0,2 до 0,4, и частотах повторения импульсов от одного до четырех Герц. Микропузырьки Sonovue вводят в дозе один миллилитр на килограмм.Успешные ультразвуковые микропузырьковые процедуры могут быть обнаружены по экстравазации флуоресцентного декстрана из внутрисосудистого во внесосудистое пространство, что указывает на увеличение проницаемости ГЭБ. Для оценки кинетики утечки декстрана в качестве репрезентативной модели доставки лекарственного средства интенсивность сигнала между внутрисосудистым и внесосудистым пространствами может быть оценена с использованием таких инструментов, как MATLAB. Чтобы оценить сосудистые изменения, вызванные ультразвуковыми микропузырьками, диаметр интересующего сосуда может быть измерен до, во время и после ультразвуковой обработки микропузырьками.Анализ изображений может проводиться с помощью программного обеспечения, такого как ImageJ, FIJI, или инструментов программирования. Здесь имарис использовался для сегментации и классификации кровеносных сосудов. Прижизненная многофотонная микроскопия головного мозга в сочетании с кольцевыми преобразователями обеспечивает метод мониторинга эффектов, индуцированных ультразвуковым микропузырьковым лечением, в режиме реального времени с высоким пространственным и временным разрешением.Количественные и качественные данные могут быть получены для изучения, например, кинетики экстравазации и сосудистых изменений. Экспериментальный метод, представленный здесь, может быть применен к нескольким моделям исследований и к различным ультразвуковым приложениям.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

Введение в Ультразвуковое Целевые микропузырьков Техника Уничтожение

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

Мониторинг в реальном времени высокой интенсивности сфокусированного ультразвука (HIFU) абляции<em&gt; In Vitro</em&gt; Собаки Печень Использование Harmonic Motion визуализации для сфокусированного ультразвука (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Проникновение ФИТЦ-нагруженных ферритинов через Rat гематоэнцефалический барьер: модель для изучения Поставка Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

На Ситу Микроскопия для определения одноклеточной морфологии в биопроцессах в режиме реального времени

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Изготовление Nafion покрытием, снижение графена оксид/полианилин Chemiresistive датчик pH монитора в реальном времени во время микробной ферментации

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Люцифер желтый - Надежный параклеточной проницаемости маркер а в клеточной модели человеческого кровяного мозга барьер

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Пользовательская многофотонная микроскопическая платформа для живого изображения мыши Корнеа и Конъюнктивы

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Остаточно-специфический обмен пролина на аналоги пролина в флуоресцентных белках: как «молекулярная хирургия» позвоночника влияет на складчатость и стабильность

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...