Name: isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node
Uploaded: 2021-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني (CSC ، إلى R. Xia) ، والمركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK ؛ 81X2600255 إلى S. Clauss ، و 81Z0600206 إلى S. Kääb ، و 81Z0600204 إلى CS) ، ومؤسسة Corona Foundation (S199 / 10079/2019 إلى S. Clauss) ، و SFB 914 (المشروع Z01 إلى S. Massberg) ، و ERA-NET حول أمراض القلب والأوعية الدموية (ERA-CVD ؛ 01KL1910 إلى S. Clauss) و Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (إلى S. Clauss). لم يكن للممولين أي دور في إعداد المخطوطات.

تم إجراء رعاية الحيوان وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان والأخلاقيات بجامعة ميونيخ وتمت الموافقة على جميع الإجراءات المتخذة على الفئران من قبل حكومة بافاريا ، ميونيخ ، ألمانيا. تم الحصول على الفئران C57BL6 / J تجاريا.
1. الاستعدادات
<ol><li>قم ?...

<ol>
	<li>Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationship+in+the+sinus+and+atrioventricular+nodes.">Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes.</a> Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal.">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages:+heterogeneity+and+functions.">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).</li><li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunofluorescence+staining,+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse.">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Ye Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+atrioventricular+nodal+cells+from+neonate+rabbit+heart.">Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).</li><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+CCR2-+and+CCR2++cardiac+macrophages+differentially+orchestrate+monocyte+recruitment+and+fate+specification+following+myocardial+injury.">Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury.</a> Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).</li><li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease.">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li></ol>

في هذه المخطوطة ، نصف بروتوكولا لإثراء الضامة القلبية المقيمة على وجه التحديد من مناطق SAN و AVN بنقاوة عالية.
تنقسم البلاعم إلى مجموعات فرعية بناء على موقعها التشريحي والنمط الظاهري الوظيفي. يمكنهم أيضا التبديل من نمط ظاهري وظيفي إلى آخر استجابة لإشارات البيئة الدقيقة المتغ?...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU) 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123 
Simone Loy1 
Stefan K&#228;&#228;b13 
Anna Titova1 
Christian Schulz123 
Steffen Massberg123 
Sebastian Clauss123 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU) 
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU) 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62236">Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

تبدأ العقدة الجيبية الأذينية (SAN) من الناحية الفسيولوجية النبضة الكهربائية ، وبالتالي فهي جهاز تنظيم ضربات القلب الأساسي. تقوم العقدة الأذينية البطينية (AVN) بتوصيل النبضة الكهربائية من الأذينين إلى البطينين وتعمل أيضا كجهاز تنظيم ضربات القلب الفرعي1. بشكل عام ، يعد توليد وتوصيل النبضات الكهربائية عملية معقدة يمكن تعديلها بواسطة عوامل مختلفة2 ، بما في ذلك البلاعم المقيمة في مناطق SAN / AVN. توضح دراسة حديثة أجراها Hulsmans et al. مجموعة محددة من الضامة القلبية المقيمة التي يتم تخصيبها في AVN وتعمل كلاعبين رئيسيين في الحفاظ على ضربات قلب ثابتة3. ووجدوا أن البلاعم مقترنة كهربائيا بخلايا عضلة القلب ويمكن أن تغير الخصائص الكهربائية لخلايا عضلة القلب المقترنة. لاحظ المؤلفون أيضا أن مثل هذه الخلايا الموصلة التي تتداخل مع الضامة موجودة أيضا في مكونات أخرى من نظام التوصيل القلبي ، مثل SAN.
حاليا ، من غير المعروف تماما ما إذا كان النمط الظاهري للبلاعم القلبية المقيمة يختلف بين مناطق القلب. ومع ذلك ، فقد ثبت أن البيئة المكروية للأنسجة يمكن أن تؤثر على النسخ والتجديد التكاثري للبلاعم الأنسجية4. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه ثبت أن النمط الظاهري للخلية العضلية القلبية مختلف بين المناطق ، فقد تكون التأثيرات الوظيفية للبلاعم على خلايا عضلة القلب خاصة بالمنطقة ، حتى لو كان النمط الظاهري للبلاعم نفسه هو نفسه. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات على مناطق قلبية محددة.
أظهرت الدراسات الحديثة أنه في حالة مستقرة ، يتم إنشاء البلاعم المقيمة في الأنسجة قبل الولادة ، وتنشأ بشكل مستقل عن تكون الدم النهائي ، وتستمر حتى مرحلة البلوغ5. ومع ذلك ، بعد استنفاد البلاعم أو أثناء التهاب القلب ، تساهم حيدات Ly6chi في تجديد عدد البلاعم القلبية6. أظهرت الدراسات التي تضمنت تتبع النسب الجيني ، و parabiosis ، ورسم خرائط المصير ، وتتبع الخلايا تعايش مجموعة متنوعة من مجموعات البلاعم المقيمة في الأنسجة في الأعضاء والأنسجة ، وكذلك السلوك الخلوي المختلف للمجموعات الفرعية من البلاعم التي يحتمل أن تكون مرتبطة بتطورها7،8،9.
استفاد توصيف البلاعم القلبية المقيمة من استخدام فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية (MACS) وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت. هذه الطرق مفيدة بشكل خاص لعزل مجموعات خلايا معينة من كسور الأنسجة المتعددة عن طريق تسميتها بعلامات سطح الخلية. هذا لا يؤدي فقط إلى نقاء أعلى لنوع الخلايا المناعية المعزولة ، ولكنه يسمح أيضا بتحليل النمط الظاهري. هنا ، نقدم بروتوكولا يتضمن خلايا مغلفة بالخرز المغناطيسي متبوعا بفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت لإثراء الضامة القلبية المقيمة المعزولة على وجه التحديد من منطقة SAN و AVN.
لاستكشاف خصائص البلاعم القلبية المقيمة في نظام التوصيل ووظيفتها في التوصيل القلبي وعدم انتظام ضربات القلب ، يعد التوطين الدقيق وتشريح SAN و AVN أمرا بالغ الأهمية. للتشريح المجهري ل SAN و AVN ، يتم استخدام المعالم التشريحية لتحديد المنطقة10. باختصار ، يقع SAN عند تقاطع الوريد الأجوف العلوي والأذين الأيمن. يقع AVN داخل مثلث كوخ ، الذي يحده من الأمام نشرة الحاجز للصمام ثلاثي الشرف ، وخلفيا وتر تودارو11. كما نقدم إجراء تشريح دقيق ل SAN و AVN في الفئران وهو ما تؤكده الأنسجة وتلطيخ التألق المناعي.
يمكن استخدام البلاعم المقيمة المعزولة لإجراء مزيد من التجارب مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أو يمكن استعادتها وزراعتها لأكثر من أسبوعين مما يسمح بإجراء تجارب مختلفة في المختبر. لذلك ، يصف بروتوكولنا إجراء قيما للغاية لأخصائي الإيقاع المناعي. يوضح الجدول 1 تكوين جميع الحلول اللازمة ، ويبين الشكل 1 معالم التشريح المجهري ل SAN و AVN. الشكل 2 هو توضيح تخطيطي لتوطين SAN و AVN. يوضح الشكل 3 التلوين النسيجي ل SAN و AVN (تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان والتألق المناعي). يوضح الشكل 4 استراتيجية بوابة خطوة بخطوة لعزل البلاعم القلبية المقيمة عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Leica DM6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Flow cytometry machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Component of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#8722; Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;ml</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 ml/ml</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 128006</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 123114</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 139306</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101226</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103106</td>
			<td>diluted to 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node

وقد ثبت أن البلاعم القلبية المقيمة تسهل التوصيل الكهربائي في القلب. يبدأ إيقاع القلب الفسيولوجي بنبضات كهربائية متولدة في العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ثم يتم إجراؤها على البطينين عبر العقدة الأذينية البطينية (AVN). لمزيد من الدراسة لدور البلاعم المقيمة في نظام التوصيل القلبي ، من الضروري عزل البلاعم المقيمة بشكل صحيح عن SAN و AVN ، لكنه لا يزال يمثل تحديا. هنا ، نقدم بروتوكولا للتشريح المجهري الموثوق به ل SAN و AVN في قلوب الفئران متبوعا بعزل وثقافة الضامة المقيمة.
يتم تحديد وتشريح كل من SAN الذي يقع عند تقاطع محطة crista مع الوريد الأجوف العلوي ، و AVN الذي يقع في قمة مثلث Koch ، وتشريحه بشكل دقيق. يتم تأكيد الموقع الصحيح من خلال التحليل النسيجي للأنسجة التي أجريت مع صبغة ماسون ثلاثية الألوان ومضاد HCN4.
ثم يتم هضم الأنسجة المجهرية إنزيميا للحصول على معلقات خلية واحدة تليها الحضانة مع لوحة محددة من الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات سطح محددة من نوع الخلية. يسمح ذلك بتحديد أو عد أو عزل مجموعات الخلايا المختلفة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت. للتمييز بين الضامة القلبية المقيمة والخلايا المناعية الأخرى في عضلة القلب ، وخاصة الضامة المشتقة من الخلايا الوحيدة ، هناك حاجة إلى استراتيجية بوابة دقيقة. أولا ، يتم الكشف عن خلايا السلالة اللمفاوية واستبعادها من مزيد من التحليل. بعد ذلك ، يتم تحديد الخلايا النخاعية مع تحديد البلاعم المقيمة من خلال التعبير العالي لكل من CD45 و CD11b ، والتعبير المنخفض عن Ly6C. مع فرز الخلايا ، يمكن بعد ذلك زراعة البلاعم القلبية المعزولة في المختبر على مدار عدة أيام لمزيد من التحقيق. لذلك ، نصف بروتوكولا لعزل البلاعم القلبية الموجودة داخل نظام التوصيل القلبي. نناقش المزالق في التشريح الدقيق وهضم SAN و AVN ، ونقدم استراتيجية بوابات لتحديد الضامة القلبية وعدها وفرزها بشكل موثوق عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة.

وصفنا إجراء عمليا لعزل الضامة القلبية المقيمة على وجه التحديد من منطقة SAN و AVN. لتأكيد التشريح الصحيح ، يتم إجراء تلطيخ Masson's Trichrome وتلطيخ HCN4 المناعي (الشكل 3) 12. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا جمع ما يقرب من 60000 بلاعم من قلب واحد كامل. يوضح الشكل 4...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node at JoVE.com

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

يوفر البروتوكول المقدم هنا نهجا خطوة بخطوة لعزل الضامة القلبية المقيمة من العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ومنطقة العقدة الأذينية البطينية (AVN) لقلوب الفئران.

عزل وثقافة البلاعم القلبية المقيمة من العقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

وصفنا بروتوكولا للتشريح المجهري والعزل اللاحق للعاثيات الدقيقة المقيمة في القلب عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة على وجه التحديد من الجيوب الأنفية والعقدة الأذينية البطينية في الماوس. من خلال التشريح الدقيق للجيوب الأنفية والعقدة V ، متبوعا بمزيج من فرز الخلايا المغناطيسية والمنشطة بالفلورة ، نحن قادرون على عزل البلاعم المقيمة على وجه التحديد من الجيوب الأنفية والعقدة V بنقاوة عالية. يسمح تحديد وعزل البلاعم القلبية المقيمة من مناطق متميزة في القلب بإجراء مزيد من الدراسة لنمطها الظاهري وتأثيرها الخاص بالمنطقة على الفيزيولوجيا الكهربية للقلب.بعد عزل القلب ، قم بإجراء عمليات التشريح المجهري في طبق تشريح مع برنامج تلفزيوني بارد لمرة واحدة تحت مجهر تشريح. استخدم المعالم التشريحية القلبية مثل الشريان الأورطي والشريان الرئوي والجيب التاجي والبطين الأيسر أو الأيمن لتحديد اليسار واليمين والأمامي الخلفي للقلب. بعد تحديد الاتجاه ، ضع القلب مع الجبهة في أسفل الطبق لفضح الأوردة الكبيرة الخلفية.قطع على طول الأخدود بين البطينين والأذينين لإزالة غالبية البطينين. الحفاظ على الجزء الأذيني. ثبت القلب في طبق التشريح عن طريق إدخال دبابيس من خلال الجزء المتبقي من الجدار الخالي من LV و LAA.اقطع الجدار المتبقي الخالي من المركبات الترفيهية لأعلى من خلال الصمام ثلاثي الشرف والوريد الأجوف العلوي. اقلب RA و RV بعيدا وقم بتثبيت RAA لكشف منطقة تجويف RA والحاجز الأذيني. بالنسبة للتشريح المجهري ل SAN ، قم بقطع القلب على طول الحاجز بين الأذينين الموازي لمحطة crista لفصل المنطقة البينية للحصول على عينة SAN.ضع العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ سعة 1.5 ملليلتر على الثلج. للتشريح المجهري للانسدادي اللاوعائي، قم بتثبيت الأجزاء المتبقية من القلب من خلال الأنسجة المجاورة للحاجز بين الأذينين والحاجز بين البطينين لمواجهة الجانب الأذيني الأيمن من الحاجز بين الأذينين. انظر إلى الأذين الأيمن على سطح الشغاف لمثلث كوخ الذي سيحده من الأمام خط مفصلي نشرة الحاجز للصمام ثلاثي الشرف وخلفيا وتر تودارو.لوحظ فتحة الجيب التاجي في القاعدة. فرم أنسجة SAN و AVN باستخدام المشارط. ثم أضف 500 ميكرولتر من مخزن الهضم الطازج إلى كل عينة واغسل جميع الأنسجة المفرومة من جدار أنبوب الطرد المركزي الدقيق.ماصة بلطف للمساعدة في هضم العينة وتجانس الأنسجة على آلة دوامة. بعد الهضم ، انقل تعليق الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 ملليلتر عن طريق تمريره عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. شطف مصفاة الخلية مع خمسة ملليلتر إضافية من عازلة فرز الخلايا لوقف عملية الهضم.إزالة طاف . بعد إعادة تعليق حبيبات الخلية ب 90 ميكرولترا من المخزن المؤقت لفرز الخلايا ، أضف 10 ميكرولتر من ميكروبيدات CD45 لكل 10 ملايين خلية إجمالية إلى معلق الخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. خلط العينات جيدا.خلال وقت احتضان تعليق الخلية بالميكروبيدات وخليط الأجسام المضادة ، قم بإعداد مجموعة الفصل المغناطيسي عن طريق ربط العمود المغناطيسي بفاصل مغناطيسي مناسب ثم وضع أنبوب تجميع تحت العمود المغناطيسي. قم بإعداد الأعمدة المغناطيسية عن طريق الشطف باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المضافة في الجزء العلوي من العمود والسماح للمخزن المؤقت بالمرور. ضع تعليق الخلية على الفور على العمود ، وتجنب فقاعات الهواء ، أثناء مرور المخزن المؤقت لفرز الخلايا.اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لفرز الخلايا على العمود. قم بإزالة العمود من الفاصل المغناطيسي وضعه على أنبوب تجميع جديد.اغسل العمود على الفور عن طريق تطبيق المكبس المزود بالعمود بإحكام للحصول على التدفق الذي يحتوي على الخلايا المسماة مغناطيسيا. بعد تطبيق العينة غير الملوثة وأنابيب التعويض ، اضبط الفولتية لكل قناة لمحاذاة كل من القمم الموجبة والسالبة إلى الموضع المناسب للمحور. قم بتعيين استراتيجية البوابة كما هو موضح في مخطوطة النص باستخدام DAPI كعلامة جدوى.تحقق من مخططات قياس التدفق الخلوي للتأكد من أن عدد الخلايا محل الاهتمام يظهر بشكل صحيح على الرسوم البيانية. اجمع الخلايا المصنفة إلى وسط أو مخزن مؤقت بناء على الحاجة إلى التجارب اللاحقة. لتأكيد التشريح الصحيح ، تم تحديد SAN و AVN باستخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي وتلطيخ ماسون ثلاثي الألوان.يظهر هنا تلطيخ مناعي لخلايا نظام التوصيل الإيجابي HCN4 في SAN و AVN ، بالإضافة إلى تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان ل SAN و AVN. ساعدت استراتيجية البوابة لفرز الخلايا من الضامة القلبية المقيمة على تحديد الخلايا أحادية النواة عن طريق استبعاد الثنائيات في منطقة التشتت الأمامية للمحور ص مقابل المحور السيني. تم استبعاد الخلايا الميتة بواسطة DAPI.تم بوابات الخلايا الحية للكريات البيض الإيجابية CD45 ، ثم للخلايا النخاعية الإيجابية CD11b. تم تحديد البلاعم القلبية من خلال التعبير عن كل من F4 / 80 و CD64 ، ثم تم تقسيمها إلى طبقات بواسطة تعبير مستضد الخلايا الليمفاوية السادس. لوحظت خلايا تم فرزها حديثا تحت المجهر برايتفيلد.كانت الخلايا إيجابية ل CD45 عند ملاحظتها تحت قناة PE الفلورية. عند ملاحظتها تحت قناة فلوروفور APC بحجم سبعة ، أظهر نفس العرض للخلايا المصنفة خلايا إيجابية CD11b. تم استخدام قناة الفلوروفور PE بحجم سبعة لتحديد النمط الظاهري الإيجابي F4 / 80.وتم تحديد الخلايا الإيجابية الثلاثية على أنها بلاعم قلبية مقيمة. يشار إلى البلاعم القلبية المعزولة المزروعة في الوسط لمدة تصل إلى ستة أيام بسهام بيضاء ، بينما تشير الأسهم السوداء إلى الخلايا الميتة. يمكن استخدام البلاعم المصنفة لمزيد من الدراسات الوظيفية مثل تجارب مشبك التصحيح أو دراسات التعبير مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أو الدراسات البروتينية.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

وهناك طريقة لعزل جزيرة الفئران تحت المحفظة وزراعة الكلى

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133<sup&gt; +</sup&gt; خلايا الجذعية السرطانية المزعومين من الميلانوما

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

التصور<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; داخل القلب Microlesions وإعادة عرض القلب لاحقا

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

العزلة ونشر تعميم الخلايا السرطانية من ماوس السرطان نموذج

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية الأولية من الشرايين والأوردة الكلاب

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

عزل وتنقية البيريكيتالقلبي ة المورين

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

عزل الخلايا الماية الأذينية من الفئران البالغة

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

عزلة وثقافة ميفيبر واحدة من نموذج مورين من ضمور العضلات إيمري-دريفوس في وقت مبكر بعد الولادة

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

الموقع، تشريح، وتحليل عصابة مورين ستيلاتي

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...